激光共聚焦掃描顯微鏡的光學設計

張洪飛,談夢科,及少勇,李龍譚,郭漢明

(上海理工大學 光電信息與計算機工程學院,上海　200093)

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激光共聚焦掃描顯微鏡的光學設計

張洪飛,談夢科,及少勇,李龍譚,郭漢明

(上海理工大學 光電信息與計算機工程學院,上海200093)

為獲得較高分辨率的細胞圖像,設計了激光共聚焦光學系統(tǒng)。通過較復雜結(jié)構(gòu)物鏡實現(xiàn)了照明光路系統(tǒng)和發(fā)射光路系統(tǒng)的設計。用Zemax對照明光路和發(fā)射光路進行了設計,仿真過程中照明光路的聚焦彌散斑直徑小于1 μm,照明針孔處的聚焦彌散斑直徑小于20 μm,發(fā)射光路的聚焦彌散斑直徑小于20 μm,同時照明光路和發(fā)射光路的MTF曲線接近衍射極限,達到較理想的情況。

激光共聚焦; 光學設計; 照明光路系統(tǒng); 發(fā)射光路系統(tǒng); Zemax

引 言

激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)是以激光作為光源[1],激光束經(jīng)照明針孔形成點光源對焦平面上標本進行掃描,標本上的聚焦點在與其共軛的探測針孔的位置成像[2],這樣所得到的共焦圖像是樣本的光學橫斷截面的圖像。由此可知,激光共聚焦掃描顯微鏡的成像原理與普通的光學顯微鏡明顯不同,它以抑制焦點外物點信息的光信號來實現(xiàn)高分辨率,再采用掃描技術(shù)來彌補視場小的缺點[3]。理想情況下,實現(xiàn)點對點的成像。與普通光學顯微鏡相比,它可以獲得更高的橫向分辨率,并且具有較高的縱向分辨率。利用這樣的特性,實現(xiàn)了對樣品三維結(jié)構(gòu)重建和測量分析的工作,為研究生物組織等物體結(jié)構(gòu)提供了有效的工具[4]。

本文根據(jù)LCSM工作原理設計了共聚焦掃描光學系統(tǒng),并用Zemax對所設計光學系統(tǒng)進行仿真和優(yōu)化。

1　激光共聚焦工作原理

在共焦顯微成像系統(tǒng)中,使用共焦探測針孔不但使得整個光學系統(tǒng)擁有了高分辨軸向響應特性,同時具有抗雜散光和增大對比度的優(yōu)點。激光共聚焦掃描顯微成像系統(tǒng)是利用物鏡使光束聚焦形成很小的光點,通過光點與樣品之間的相對運動,實現(xiàn)對樣品逐點掃描成像。激光共聚焦掃描顯微成像采用焦點共軛的技術(shù),使照明針孔、探測針孔、被照射的樣品都處在彼此的共軛位置。這樣只有在焦平面上的點被光源照射所激發(fā)出的熒光能夠通過探測針孔而被光電探測器所接收,焦面以外的光線或聚焦在針孔前或聚焦在針孔后,會很大程度地被抑制掉,因此共焦探測針孔的作用相當于一個針孔濾波器,可以極大地提高激光共焦顯微成像系統(tǒng)的縱向分辨率[5]。

2　光學系統(tǒng)設計過程

圖1　系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.1　3D layout of the system structure

圖2　組合聚焦透鏡點列圖Fig.2　Spot diagram of the compound lens

激光共聚焦光學系統(tǒng)由照明光路系統(tǒng)和發(fā)射光路系統(tǒng)組成。如圖1所示,激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過準直擴束透鏡組(鏡組1、2),變成一束直徑較大的平行光束,二向色鏡4使光束偏轉(zhuǎn)90°,經(jīng)過物鏡3會聚在其焦點上。樣品中的熒光物質(zhì)在激光激發(fā)下發(fā)射沿各個方向的熒光,一部分熒光經(jīng)過物鏡、二向色鏡、高通濾波片5、聚焦透鏡(鏡組6)會聚在聚焦透鏡的焦點處,再通過焦點處的針孔7,由探測器8接收。

2.1照明光路設計

2.1.1準直擴束系統(tǒng)

激光準直擴束系統(tǒng)由圖1中的鏡組1和透鏡2組成,其從左到右各面的參數(shù)如表1,通過改變光束束腰直徑,使激光的準直性、光束平行度變高,且照明針孔位于鏡組1的聚焦點處,激光經(jīng)過此針孔后形成點光源,點光源不僅具有方向性強、發(fā)散小、亮度高的特點，而且具有高度的空間和時間相干性以及平面偏振激發(fā)等獨特的優(yōu)點。為了得到較小的聚焦光斑,聚焦光路選擇兩個透鏡組合(鏡組1)的形式,材料選擇ZF14,其聚焦光斑點列圖如圖2所示,光斑直徑小于20 μm。此處照明針孔和探測針孔幾何尺寸一致。探測針孔的大小與艾里斑的直徑相關(guān),針孔大小為艾里斑經(jīng)過光學系統(tǒng)成像的大小時,探測器接收光能量較高[6-7]。

表1　準直擴束系統(tǒng)參數(shù)

2.1.2顯微物鏡

顯微物鏡是LSCM中最為重要的器件,對成像質(zhì)量起決定性作用,而數(shù)值孔徑是判斷物鏡性能的重要參數(shù),表征物鏡的聚光能力,增強物鏡的聚光能力,可提高物鏡的分辨率。根據(jù)初始結(jié)構(gòu)[10]校正軸上點球差,并保證較大的數(shù)值孔徑。圖1物鏡3從上到下各面的參數(shù)如表2所示,點列圖如圖3所示。

表2　物鏡結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖3　物鏡的點列圖Fig.3　Spot diagram of the optimized objective lens

圖4　物鏡的MTF曲線Fig.4　MTF curves of the objective lens

2.1.3照明光路

將準直擴束光路和物鏡組合在一起并添加二向色鏡的反射面和光闌,得到照明光路的初始結(jié)構(gòu)。其中照明光源是方向性、單色性很好的激光,采用平行入射的方式進入光學系統(tǒng),因此該照明系統(tǒng)只存在軸上點球差。對該初始結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化時,將準直擴束光路的半徑設為變量,在默認評價函數(shù)中加入焦距控制操作數(shù),使擴束比例達1.875,然后進行自動優(yōu)化。再將物鏡的所有半徑以及像距設為變量,采用默認評價函數(shù)優(yōu)化。優(yōu)化后的MTF曲線和照明光路點列圖如圖5,圖6所示。由圖可知該照明光路的彌散斑直徑小于1 μm,MTF曲線接近其衍射極限,因此該照明光路具有極高的點光源分辨率。優(yōu)化后物鏡的數(shù)值孔徑變?yōu)?.686 8。

圖5　照明光路的MTF曲線

圖6　照明光路的點列圖

圖7　發(fā)射光路的點列圖Fig.7　Spot diagram of the emission system

2.2發(fā)射光路設計

將之前設計的物鏡和一個雙膠合透鏡(鏡組6)組合在一起并添加二向色鏡的折射面,由此得到了發(fā)射光路的初始結(jié)構(gòu)。為進一步優(yōu)化發(fā)射光路(因系統(tǒng)不能改變物鏡),只對起聚焦作用的雙膠合透鏡進行優(yōu)化。設半徑為變量,并逐漸修改厚度,用默認評價函數(shù)進行自動優(yōu)化。優(yōu)化后的發(fā)射光路點列圖如圖7所示,雙膠合透鏡從下到上各面的參數(shù)如表3所示。

表3　雙膠合透鏡結(jié)構(gòu)參數(shù)

優(yōu)化后發(fā)射光路的MTF曲線分別如圖8所示。由圖可知彌散斑直徑小于20 μm，而探測針孔直徑等于艾里斑成像的直徑D，即

式中:β為系統(tǒng)的放大倍率;λ為發(fā)射光的波長;NA為物鏡的數(shù)值孔徑。且β=40,λ= 480 nm,NA=0.686 8,由此得D=34 μm,探測針孔直徑為35 μm。因此彌散斑直徑小于20 μm,滿足激光共聚焦探測針孔直徑為35 μm的要求。發(fā)射光路的MTF曲線接近衍射極限,因此該發(fā)射光路具有極高的光學傳輸效率。

圖8　發(fā)射光路的MTF曲線Fig.8　MTF curves of the emission system

3　結(jié)　論

本文設計了激光共聚焦掃描顯微鏡的光學系統(tǒng),采用結(jié)構(gòu)較為復雜的物鏡以及簡單的準直擴束系統(tǒng)和二向色鏡反射面實現(xiàn)了照明光路的設計,物鏡以及簡單的雙膠合透鏡和二向色鏡的折射面實現(xiàn)了發(fā)射光路的設計。整個共聚焦系統(tǒng)中照明光路的聚焦彌散斑直徑小于1 μm,照明針孔處的聚集光斑直徑小于20 μm,滿足照明針孔直徑為35 μm要求。發(fā)射光路的聚集光斑直徑小于20 μm,滿足探測針孔直徑為35 μm的要求,而且照明光路和發(fā)射光路的MTF曲線都比較接近衍射極限,優(yōu)化的較為理想,具有比較好的光學傳輸效率。因此激光共聚焦掃描顯微鏡被廣泛應用在生命科學、生物技術(shù)和納米科學等領域。然而整個系統(tǒng)的設計也有可以改進的地方,此系統(tǒng)的物鏡數(shù)值孔徑較小,可以進一步提高物鏡的的數(shù)值孔徑,從而提高激光共聚焦光學系統(tǒng)的光學分辨率。

[1]姜曼,陶振強,蔣庭佳,等.基于連續(xù)掃描方式的激光共焦掃描顯微鏡的研制[J].光學儀器,2013,35(5):52-60.

[2]朱延彬,郭周義.激光共焦掃描顯微鏡的光學特性研究[J].光學儀器,1994,16(3):11-19.

[3]SHEPPARD C J R,WILSON T.Depth of field in the scanning microscope[J].Optics Letters,1978,3(3):115-117.

[4]姜曼.激光共聚焦掃描顯微鏡的研制及掃描采集控制方法的研究[D].上海:上海理工大學,2014:6-9.

[5]陶振強,賈南南,阮斌.單點式位移平臺激光共聚焦掃描熒光顯微鏡[J].光學儀器,2015,37(2):170-174.

[6]WILSON T,CARLINI A R.Size of the detector in confocal imaging systems[J].Optics Letters,1987,12(4):227-229.

[7]KAWATA S,ARIMOTO R,NAKAMURA O.Three-dimensional optical-transfer-function analysis for a laser-scan fluorescence microscope with an extended detector[J].Journal of the Optical Society of America A,1991,8(1):171-175.

[8]羅剛銀,王弼陡,繆鵬,等.激光共聚焦近紅外熒光掃描系統(tǒng)光學設計[J].應用光學,2015,36(1):29-34.

[9]范應娟,張艷軍.基于Zemax的He-Ne激光光束聚焦物鏡的設計[J].應用光學,2010,31(6):1032-1035.

[10]LAIKIN M.光學系統(tǒng)設計[M].4版.周海憲,程云芳,譯.北京:機械工業(yè)出版社,2011:128-130.

(編輯:張磊)

Optical design of laser confocal scanning microscopy

ZHAGN Hongfei,TAN Mengke,JI Shaoyong,LI Longtan,GUO Hanming

(School of Optical-Electrical and Computer Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China)

In order to obtain the high-resolution cell image,we designed a laser scanning confocal optical system.The light system and emission system were realized based on the objective of complex structure.The Zemax was used for the system optical design.In the simulation the focal spot size of light system was less than 1μm,and the focal spot size was less than 20 μm at the light pinhole position.The focal spot size was less than 20 μm at the emission pinhole position.At the same time light system and emission system of the MTF curve was close to the diffraction limit to reach the ideal situation.

laser confocal scanning; optical design; lighting system; emission system; Zemax

2015-07-27

國家自然科學基金資助項目(61178079)

張洪飛(1988—),男,碩士研究生,主要從事光機設計方面的研究。E-mail:zhfus420@163.com

1005-5630( 2016) 03-0221-05

TH 703

A

10.3969/j.issn.1005-5630.2016.03.006