響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶-復(fù)合磷酸鹽嫩化低檔部位牛肉工藝

陶　瑞，湯曉艷，龔　艷，齊　凱，耿永然

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶-復(fù)合磷酸鹽嫩化低檔部位牛肉工藝

陶瑞，湯曉艷*，龔艷，齊凱，耿永然

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

采用響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)來(lái)探究復(fù)合磷酸鹽與木瓜蛋白酶復(fù)配使用嫩化低檔部位燒烤牛肉的最佳條件。以單位肉中木瓜蛋白酶活力、復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度和作用時(shí)間為嫩化因子，以剪切力值和感官評(píng)價(jià)得分為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.05軟件對(duì)測(cè)得的結(jié)果建立二次回歸模型。結(jié)果表明，復(fù)合磷酸鹽與木瓜蛋白酶配合使用可以有效降低中低檔部位牛肉的剪切力值，同時(shí)適當(dāng)減少酶的用量，提高肉的保水性，得到更好的感官評(píng)價(jià)效果。最佳嫩化條件為：木瓜蛋白酶活力9.44 U/g、復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度18.35 mg/mL、作用時(shí)間9.09 h。在此條件下，低檔部位燒烤牛肉的剪切力預(yù)測(cè)值為17.25 N，感官得分為5.02，整體感受較滿(mǎn)意。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值吻合良好，說(shuō)明響應(yīng)面模型具有較好的預(yù)測(cè)能力，能有效用于剪切力值和感官評(píng)分的預(yù)測(cè)。

低檔部位牛肉；木瓜蛋白酶；復(fù)合磷酸鹽；響應(yīng)面；復(fù)合嫩化

隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，冷鏈物流技術(shù)和體系的成熟，以及中西方飲食文化的不斷融合，燒烤牛肉以其獨(dú)特的風(fēng)味，方便、快捷的烹調(diào)方式，越來(lái)越受到年輕消費(fèi)者的青睞。由于我國(guó)牛肉市場(chǎng)上外脊、上腦、眼肉等高檔部位牛肉價(jià)格昂貴、產(chǎn)量有限，所以普通燒烤店和快餐店普遍選用牛的臀肉、米龍、小黃瓜條等嫩度較差的低檔部位肉為原料，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)恼{(diào)理加工來(lái)提高嫩度，實(shí)現(xiàn)低檔部位燒烤牛肉的高值化和高產(chǎn)化，提高產(chǎn)品附加值［1］。

嫩度是評(píng)價(jià)牛肉品質(zhì)的首要因素，嫩度也是低檔部位燒烤牛肉需要改善的重要方面。但實(shí)際調(diào)研發(fā)現(xiàn)［1］，低檔部位牛肉調(diào)理燒烤方法仍然存在嫩化效果不好，嫩度、多汁性等口感較差的問(wèn)題。運(yùn)用物理、化學(xué)或酶法手段將肌原纖維或結(jié)締組織中的纖維蛋白水解或斬?cái)嗍桥Ｈ饽刍闹饕侄巍Ｄ竟系鞍酌缸鳛橐环N低特異性巰基酶，其活性中心含半胱氨酸，能夠快速切開(kāi)纖維蛋白內(nèi)部的—CO—NH—，生成小分子多肽類(lèi)物質(zhì)。且相比其他嫩化酶，木瓜蛋白酶具有嫩化效果好、成本低、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，具有更好的應(yīng)用價(jià)值［2-3］。但實(shí)際使用時(shí)發(fā)現(xiàn)，酶活的變化對(duì)結(jié)果影響很大，常常會(huì)因用量過(guò)多，發(fā)生過(guò)度水解，造成肉質(zhì)老化、保水性降低、風(fēng)味變差等問(wèn)題［4］。而復(fù)合磷酸鹽不僅可以改善肉的保水性，同時(shí)還可以提高肉的pH值，保持蛋白酶的最佳酶活力條件，有效減少酶的用量［5-6］。國(guó)內(nèi)外的很多專(zhuān)家學(xué)者都對(duì)木瓜蛋白酶或者復(fù)合磷酸鹽用于肉類(lèi)嫩化進(jìn)行了大量的研究［7-10］，但作為目前最常用的兩種嫩化劑，它們?cè)谌赓|(zhì)嫩化中的復(fù)合使用鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)，以木瓜蛋白酶和復(fù)合磷酸鹽為嫩化手段，對(duì)牛的低檔部位肉半腱肌進(jìn)行復(fù)合嫩化處理，以剪切力值和感官評(píng)價(jià)得分為嫩度評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究木瓜蛋白酶和復(fù)合磷酸鹽配合使用的最佳條件，構(gòu)建復(fù)合嫩化體系，為低檔部位牛肉嫩化提供有效手段。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

牛半腱肌，取自北京御香苑集團(tuán)6～7 歲的淘汰母牛，宰后于0～4 ℃條件下排酸24 h，-20 ℃速凍后取回備用。

木瓜蛋白酶（酶活力為108萬(wàn) U/g） 廣州華琪生物科技有限公司；復(fù)合磷酸鹽（多聚磷酸鹽-六偏磷酸鹽-焦磷酸鹽復(fù)配質(zhì)量比為2∶2∶1） 徐州天嘉食用化工有限公司；食鹽 中鹽北京市鹽業(yè)公司。

1.2儀器與設(shè)備

MODEL235沃-布剪切力儀 英國(guó)G-R Manufacturing公司；HHS-21-6型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；JH2102電子天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理

1.3.1.1嫩化

牛的半腱肌于0～4 ℃條件下解凍24 h至中心溫度達(dá)到0 ℃以上，剔除可見(jiàn)脂肪和結(jié)締組織，沿垂直肌纖維的方向切分成厚度為3 cm，大小約為3 cm×6 cm×6 cm，質(zhì)量約為（180±10） g的肉塊。采用手動(dòng)注射，將預(yù)先配制好的嫩化劑均勻地注射到肉中，注射量為肉質(zhì)量的10%，注射量偏差范圍控制在5%以?xún)?nèi)。然后在0～4 ℃嫩化處理。

1.3.1.2烤制

將肉塊切成2.54 cm厚，稱(chēng)質(zhì)量，將電感耦合溫度計(jì)插入到肉塊中心，在160 ℃左右烤制至肉塊中心溫度達(dá)70 ℃，將烤好后的肉塊保存在鋁箔內(nèi)冷卻至室溫備用。

1.3.2剪切力值的測(cè)定

參照NY/T 1180—2006《肉嫩度的測(cè)定：剪切力測(cè)定法》［11］。將解凍后的肉樣切分出3 cm×3 cm×6 cm的肉塊，置于蒸煮袋中，于85 ℃的恒溫水浴鍋中煮至中心溫度達(dá)到70 ℃后取出，冷卻至室溫，用吸水紙擦干表面水分。然后放在0～4 ℃條件下貯存12 h，用直徑1.27 cm的圓錐形取樣器平行肌纖維方向鉆切肉樣，孔樣長(zhǎng)度不少于2.5 cm，數(shù)量不少于3 個(gè)。用沃-布剪切力儀垂直于肌纖維方向剪切樣本，求平均值即得到該樣本的剪切力值。

1.3.3感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)參考GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評(píng)定規(guī)范》［12］和趙鐳等［13］方法。選擇從事食品質(zhì)量安全專(zhuān)業(yè)的10 人組成感官評(píng)價(jià)小組，對(duì)品評(píng)人員進(jìn)行烤制牛肉顏色、嫩度、風(fēng)味、多汁性等感官品質(zhì)指標(biāo)培訓(xùn)，要求了解所用評(píng)語(yǔ)的含義和主觀感受，采用順序標(biāo)度法，對(duì)烤肉各品質(zhì)指標(biāo)評(píng)價(jià)采用7分制，即1～7 分，見(jiàn)表1。評(píng)價(jià)結(jié)果按照本課題組前期所做的燒烤牛肉消費(fèi)者嗜好性和滿(mǎn)意度評(píng)價(jià)模型計(jì)算最終加權(quán)得分［1］。計(jì)算公式如下：

表1　烤制牛肉品質(zhì)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table1　Criteria for sensory evaluation of roast beef

1.3.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以木瓜蛋白酶活力（A）、復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度（B）和作用時(shí)間（C）為自變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定自變量的取值范圍。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)以及前期單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以木瓜蛋白酶和復(fù)合磷酸鹽為嫩化因素，以剪切力值（Y1）和感官評(píng)價(jià)得分（Y2）為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.05進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)各因素水平見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面法嫩化牛肉試驗(yàn)因素與水平Table2　Factors and their coded levels used in response surface analysis

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SAS/PC 9.2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行均值差異顯著性檢驗(yàn)，分組顯著水平0.05。采用Design-Expert 8.05對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，建立以剪切力值（Y1）和感官評(píng)價(jià)得分（Y2）為響應(yīng)值的復(fù)合評(píng)價(jià)體系，設(shè)計(jì)三因素三水平的二次回歸方程，擬合自變量與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系。將得到的兩個(gè)回歸方程聯(lián)立共解，以獲得同時(shí)滿(mǎn)足嫩度和感官要求的最佳嫩化條件［14-15］。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1木瓜蛋白酶活力對(duì)牛肉嫩化效果的影響

圖1　木瓜蛋白酶活力對(duì)剪切力值的影響Fig.1　Effect of papain dosage on shear force

復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度和作用時(shí)間分別為15 mg/mL和9 h時(shí)，酶活力在0～25 U/g范圍內(nèi)的剪切力值變化見(jiàn)圖1，當(dāng)酶活力在0～10 U/g范圍內(nèi)，剪切力值隨著肉中木瓜蛋白酶活力的增加而顯著降低（P＜0.05）。當(dāng)酶活力大于10 U/g后，剪切力值略有回升但變化不顯著（P＞0.05），酶活力為10 U/g時(shí)，剪切力均值為25.02 N，相比對(duì)照組（48.12 N）下降約43.36%。實(shí)際中也 發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶活力大于20 U/g以后，肉的外觀和組織嚴(yán)重破壞，失水過(guò)多，肉塊變硬，風(fēng)味異常。由剪切力的變化趨勢(shì)，最終確定最佳的酶活力使用量為10 U/g。

2.1.2復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)牛肉嫩化效果的影響

圖2　復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)剪切力值的影響Fig.2　Effect of phosphate concentration on shear force

木瓜蛋白酶活力和作用時(shí)間分別為10 U/g和9 h時(shí)，復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度在0～25 mg/mL范圍內(nèi)的剪切力值變化見(jiàn)圖2，復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度在0～15 mg/mL的范圍內(nèi)，剪切力值隨復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度的增加而顯著降低（P＜0.05），15 mg/mL以后趨于平緩，剪切力值的變化不顯著（P＞0.05）。此時(shí)剪切力均值為18.33 N，相比對(duì)照組（25.48 N）下降約28.08%。對(duì)比圖1可知，復(fù)合磷酸鹽對(duì)剪切力的影響作用比酶解作用略差，證明酶解作用是影響剪切力值主要因素。綜上，選擇復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度為15 mg/mL作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

2.1.3作用時(shí)間對(duì)牛肉嫩化效果的影響

圖3　作用時(shí)間對(duì)剪切力值的影響Fig.3　Effect of tenderization time on shear force

表3　響應(yīng)面法優(yōu)化低檔部位燒烤牛肉嫩化體系的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table3　Box-Behnken design （BBD） with experimental and predicted values of response variables for low-grade beef

木瓜蛋白酶活力和復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度分別為10 U/g和15 mg/mL，作用時(shí)間在0～15 h范圍內(nèi)的剪切力值變化見(jiàn)圖3，當(dāng)復(fù)合嫩化液作用時(shí)間在0～9 h范圍內(nèi)，剪切力值隨時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低（P＜0.05）；作用時(shí)間大于9 h以后趨于平緩，剪切力值的變化不顯著（P＞0.05）。此時(shí)，剪切力均值為20.87 N，相比對(duì)照組（41.94 N）下降約50.23%，最后確定作用時(shí)間9 h為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

2.2響應(yīng)面回歸模型的建立

依據(jù)單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，篩選木瓜蛋白酶活力（A）、復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度（B）和作用時(shí)間（C）中的合理?xiàng)l件進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。用Design-Expert 8.05對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)（結(jié)果見(jiàn)表4），分別得到剪切力值（Y1）和感官評(píng)價(jià)得分（Y2）與3 個(gè)嫩化因子A、B、C的三元二次多項(xiàng)式回歸方程：

表4　以剪切力值感官得分為響應(yīng)值的方差分析結(jié)果Table4　Analysis of variance （ANOVA） for the regression equations with shear force and sensory evaluation as responses

由表4可以看出，兩個(gè)回歸模型都達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），決定系數(shù)R2分別為0.927 8和0.898 5，同時(shí)失擬檢驗(yàn)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明模型與實(shí)際結(jié)果擬合良好。整體上，兩個(gè)方程可以正確地反映剪切力值（Y1）、感官得分（Y2）與木瓜蛋白酶活力（A）、復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度（B）和作用時(shí)間（C）三因素之間的關(guān)系，且在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平范圍內(nèi)，木瓜蛋白酶活力（A）對(duì)剪切力值和感官得分的影響最大，其次是復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度，最后是作用時(shí)間。

2.3響應(yīng)面試驗(yàn)中各因素的交互效應(yīng)分析

根據(jù)以上得到的二次多項(xiàng)式回歸方程，利用Design-Expert 8.05對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到交互作用的響應(yīng)面圖4和圖5，其中，圖4代表剪切力值對(duì)應(yīng)的各個(gè)交互因素響應(yīng)面，圖5代表感官評(píng)價(jià)得分對(duì)應(yīng)的各個(gè)交互因素響應(yīng)面。

圖4　各因素對(duì)剪切力值影響的響應(yīng)面圖Fig.4　Response surface graphs showing the effect of various factors on Warner-Bratzler shear force

由圖4可知，在等高線(xiàn)的中心區(qū)域，剪切力值最低，由中心向邊緣逐漸升高。三因素中，木瓜蛋白酶活力和復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)剪切力值的影響極顯著（P＜0.01）。當(dāng)作用時(shí)間固定在9 h，酶活力與復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度的交互作用對(duì)剪切力值有顯著影響（P＜0.05），響應(yīng)曲面呈現(xiàn)明顯的先降后升的趨勢(shì)；作用時(shí)間與酶活力或復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度的交互作用不顯著（P＞0.05），但當(dāng)鹽質(zhì)量濃度在15 mg/mL，且時(shí)間一定時(shí)，剪切力值隨著酶活力的增加急 速降低，達(dá)到最低點(diǎn)后緩慢回升；當(dāng)木瓜蛋白酶活力控制在10 U/g時(shí)，剪切力值的變化也呈現(xiàn)先下降后緩慢上升的趨勢(shì)。

圖5　各因素對(duì)感官評(píng)價(jià)得分的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface graphs showing the effect of various factors on sensory evaluation score

由圖5可以看出，等高線(xiàn)的中心區(qū)域，感官評(píng)價(jià)得分最高，由中心向邊緣逐漸降低。三因素中，木瓜蛋白酶活力和復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)感官得分的影響顯著（P＜0.05）。當(dāng)作用時(shí)間為9 h，酶活力和復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度的交互作用顯著（P＜0.05），其他交互作用的影響不顯著（P＞0.05），但是整體上，當(dāng)兩個(gè)因素條件固定時(shí)，變量因素先升后降的趨勢(shì)明顯，尤其酶活力達(dá)到最大時(shí)，感官得分明顯下降。

剪切力值越低，且感官評(píng)分越高，說(shuō)明肉嫩化效果越好，反之則說(shuō)明效果不好。因此，利用上述兩個(gè)模型探究同時(shí)滿(mǎn)足剪切力值低且感官評(píng)分較好的復(fù)合嫩化劑使用條件。將回歸方程（1）和（2）聯(lián)立求解，對(duì)各自變量求導(dǎo)，得到復(fù)合嫩化體系的最佳使用條件：木瓜蛋白酶活力為9.44 U/g，復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度為18.35 mg/mL，作用時(shí)間為9.09 h。在此條件處理下，調(diào)理燒烤牛肉的剪切力預(yù)測(cè)值為17.25 N，感官得分為5.02。

為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，用試驗(yàn)得到的最佳條件處理燒烤牛肉原料肉，重復(fù)3 次作為平行，測(cè)定剪切力值并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，最終得到的實(shí)測(cè)結(jié)果為：剪切力值18.33 N，感官得分5.01。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值吻合良好，模型準(zhǔn)確可靠，證明本實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件能有效實(shí)現(xiàn)肉質(zhì)嫩化，減少木瓜蛋白酶用量，避免水分過(guò)度流失，同時(shí)感官評(píng)價(jià)較好，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

3　討 論

不同嫩化劑在肉質(zhì)嫩化過(guò)程中的嫩化效果不同，這主要與嫩化劑的作用方式有關(guān)。作為純天然生物酶制劑，木瓜蛋白酶主要作用于蛋白質(zhì)分子中精氨酸、賴(lài)氨酸、甘氨酸等參與形成的肽鍵，將肌原纖維蛋白和結(jié)締組織水解，以降低剪切力值，實(shí)現(xiàn)肉質(zhì)嫩化，但一些研究表明，稍微過(guò)量的使用也可能會(huì)引起肉塊水解過(guò)度、失水老化，造成一些小分子胺類(lèi)物質(zhì)生成，肉塊的整體風(fēng)味下降［16-17］。通過(guò)本研究中圖4、5響應(yīng)面的變化趨勢(shì)也可以看出木瓜蛋白酶用量較少時(shí)，可以有效降低剪切力值，實(shí)現(xiàn)肉質(zhì)嫩化；但用量超過(guò)15 U/g后，肉塊老化嚴(yán)重，水分流失，感官評(píng)分下降，剪切力值也略有升高。而復(fù)合磷酸鹽不僅能穩(wěn)定體系pH值，促進(jìn)膠原蛋白溶解，具有一定的嫩化效果，還能增加離子強(qiáng)度，提高肉的保水性和彈性［18］。在與木瓜蛋白酶配合使用時(shí)，復(fù)合磷酸鹽能夠起到緩沖溶劑的作用，保證木瓜蛋白酶始終處于適宜的活性條件下，提高嫩化效率。同時(shí)，復(fù)合磷酸鹽還能螯合Ca2+、Mg2+等金屬離子，釋放羧基，增加負(fù)電荷斥力，提高保水性。本研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)復(fù)合磷酸鹽與木瓜蛋白酶酶配合使用，在復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)，嫩度、多汁性感官指標(biāo)評(píng)分得到了有效提高。可見(jiàn)，復(fù)合磷酸鹽和木瓜蛋白酶酶的復(fù)合使用，對(duì)提高牛肉嫩度，改善感官品質(zhì)方面都有較好的效果。

嫩化效果的評(píng)價(jià)方式也是影響條件篩選的重要方面。牛肉嫩化工藝一般以剪切力值作為條件篩選的響應(yīng)值，通過(guò)比較不同條件下剪切力值的變化來(lái)確定最終條件［19-21］。但是，牛肉嫩化最終還是為食用服務(wù)，而客觀的剪切力值無(wú)法完全代表食用品質(zhì)，過(guò)度追求剪切力的降低，反而會(huì)影響產(chǎn)品的感官感受。Sullivan等［8］研究發(fā)現(xiàn)，使用嫩化酶處理牛肉時(shí)，當(dāng)剪切力值達(dá)到最低時(shí)，失水和老化作用反而會(huì)使感官評(píng)分下降。因此，嫩化工藝條件的確定有必要引進(jìn)感官指標(biāo)，來(lái)保證最終的食用效果。本研究采用剪切力值和感官評(píng)價(jià)得分共同作為影響值，通過(guò)對(duì)樣品顏色、嫩度、風(fēng)味、多汁性等感官指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)，來(lái)校正剪切力值過(guò)低造成的食用品質(zhì)下降等問(wèn)題，保證最終篩選的嫩化條件更具實(shí)際意義。

在條件優(yōu)化方面，關(guān)于木瓜蛋白酶或復(fù)合磷酸鹽用于肉質(zhì)嫩化的研究報(bào)道也有很多。明建等［7］在常溫條件下用木瓜蛋白酶嫩化處理牛肉，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以剪切力值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到的最佳使用條件為：酶活力20 U/g、pH 7.0、處理溫度37 ℃、處理時(shí)間1.5 h或者酶活力40 U/g、pH 7.0、處理溫度20 ℃、處理時(shí)間1.5 h。夏軍軍等［22］采用響應(yīng)面回歸試驗(yàn)篩選木瓜蛋白酶最佳的使用條件，確定在酶活力20 U/g、pH 7.0、30 ℃條件下處理時(shí)間26 min可以獲得最佳的嫩化效果。此外，Kempb［4］、林志民［23］等都通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討了木瓜蛋白酶單獨(dú)使用的最佳條件。McGee等［24］比較分析了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)復(fù)合磷酸鹽對(duì)牛肉的剪切力值、蒸煮損失率和感官評(píng)分的影響，結(jié)果表明復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%、注射量7%～9%時(shí)能夠有效改善蒸煮損失率和感官評(píng)分，但對(duì)剪切力值影響不顯著（P＜0.05）；Baublits等［25］研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%、注射量為12%時(shí)，牛肉的多汁性和嫩度等感官評(píng)分顯著改善（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在復(fù)合磷酸鹽的配合使用下，木瓜蛋白酶活力達(dá)到5 U/g，復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度5 mg/mL時(shí)，嫩度開(kāi)始改善，當(dāng)酶活力到達(dá)10 U/g，復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度15 mg/mL時(shí)，效果最佳。與上述研究相比，酶的用量減少了約50%，這主要是由于本研究的嫩化體系中復(fù)配使用了復(fù)合磷酸鹽，改善了肉的嫩度、保水性，提高了肉的感官評(píng)價(jià)效果。因此，通過(guò)建立木瓜蛋白酶-復(fù)合磷酸鹽的復(fù)合嫩化體系，能有效改善嫩度，提升感官評(píng)價(jià)得分，同時(shí)還降低了酶的用量，避免了單獨(dú)酶解造成的過(guò)度嫩化、風(fēng)味異常等問(wèn)題，節(jié)約了嫩化成本。

4　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶和復(fù)合磷酸鹽組合作用，確定了低檔部位燒烤牛肉的嫩化條件。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)對(duì)低檔部位燒烤牛肉的嫩化條件進(jìn)行優(yōu)化，得到的響應(yīng)面模型效果極顯著（P＜0.01），由回歸方程確定的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶活力9.44 U/g、復(fù)合磷酸鹽質(zhì)量濃度18.35 mg/mL、作用時(shí)間9.09 h。此條件下，剪切力的預(yù)測(cè)值為17.25 N，感官得分為5.02，總體評(píng)價(jià)較滿(mǎn)意。通過(guò)驗(yàn)證，模型準(zhǔn)確可靠，與試驗(yàn)擬合良好。本實(shí)驗(yàn)體系在減少了酶用量的同時(shí)，獲得了更好的感官評(píng)價(jià)效果，為低檔部位燒烤牛肉嫩化提供了有效方法依據(jù)。

［1］ 龔艷, 湯曉艷, 陶瑞, 等. 基于模糊綜合評(píng)價(jià)法的市售燒烤牛肉質(zhì)量評(píng)價(jià)［J］. 食品工業(yè)科技, 2015, 36（13）： 364-367. DOI：10.13386/ j.issn1002-0306.2015.13.068.

［2］ HARTWIG A, ARAND M, THOMAS B, et al. MAK collection for occupational health and safety［M］. Berlin： Wiley-VCH Verlag GmbH & Co, 2004： 233-235.

［3］ HA M, BEKHIT A E A, CARNE A, et al. Characterisation of commercial papain, bromelain, actinidin and zingibain protease preparations and their activities toward meat proteins［J］. Food Chemistry, 2012, 134（1）： 95-105. DOI：10.1016/j.foodchem.2012.02.071.

［4］ KEMPB C M, PAUL L, RONALD G, et al. Tenderness： an enzymatic view［J］. Meat Science, 2010, 84（2）： 248-256. DOI：10.1016/ j.meatsci.2009.06.008.

［5］ YUAN H K, ELISABETH H L, STEVEN M L, et al. Effects of lactate/phosphate injection enhancement on oxidation stability and protein degradation in early postmortem beef cuts packaged in high oxygen modifi ed atmosphere［J］. Meat Sience, 2010, 86（3）： 852-858. DOI：10.1016/j.meatsci.2010.07.008.

［6］ 趙立艷, 彭增起, 陳貴堂. 磷酸鹽對(duì)牛肉嫩化作用的研究［J］. 食品工業(yè)科技, 2003, 24（5）： 27-28. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2003.05.015.

［7］ 明建, 曾凱芳, 李洪軍. 木瓜蛋白酶嫩化牛肉效果的研究［J］. 食品科學(xué), 2009, 30（7）： 210-214.

［8］ SULLIVAN G A, CALKINS C R. Application of exogenous enzymes to beef muscle of high and low-connective tissue［J］. Meat Science, 2010, 85（4）： 730-734. DOI：10.1016/j.meatsci.2010.03.033.

［9］ PIETRASIK Z, SHAND P J. Effects of moisture enhancement, enzyme treatment, and blade tenderization on the processing characteristics and tenderness of beef semimembranosus steaks［J］. Meat Science, 2011, 88（1）： 8-13. DOI：10.1016/j.meatsci.2010.11.024.

［10］ RAHARJO S, DEXTER D R, WORFEL R C, et al. Quality characteristics of restructured beef steaks manufactured by various techniques［J］. Journal of Food Science, 2006, 60（1）： 68-71. DOI：10.1111/j.1365-2621.1995.tb05608.x.

［11］ NY/T 1180—2006 肉嫩度的測(cè)定： 剪切力測(cè)定法［S］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2006.

［12］ GB/T 22210—2008 肉與肉制品感官評(píng)定規(guī)范［S］. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

［13］ 趙鐳, 汪厚銀, 劉文. 食品感官評(píng)價(jià)指標(biāo)體系建立的一般原則與方法［J］. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2008, 8（3）： 121-124. DOI：10.16429/j.1009-7848.2008.03.011.

［14］ AUSTIN C L, CARLA L G, LOU X Q, et al. Response surface modeling to predict fluid loss from beef strip loins and steaks injected with salt and phosphate with or without a dehydrated beef protein water binding adjunct［J］. Meat Science, 2013, 94（1）： 9-18. DOI：10.1016/j.meatsci.2012.12.004.

［15］ HU Yaqin, YU Hiaxia, DONG Kaicheng, et al. Analysis of the tenderisation of jumbo squid （Dosidicus gigas） meat by ultrasonic treatment using response surface methodology［J］. Food Chemistry, 2014, 160（1）： 219-225. DOI：10.1016/j.foodchem.2014.01.085.

［16］ ASHIE I N A, SORENSEN T L, NIELSEN P M. Effects of papain and a microbial enzyme on meat proteins and beef tenderness［J］. Journal of Food Science, 2002, 67（6）： 2138-2142. DOI：10.1111/j.1365-2621.2002.tb09516.x.

［17］ 周強(qiáng), 張富新. 嫩化酶及其在肉類(lèi)加工中的應(yīng)用進(jìn)展［J］. 肉類(lèi)研究, 2007, 21（1）： 40-42.

［18］ 劉宗敏, 江洪波, 王鵬, 等. 磷酸鹽在肉制品中應(yīng)用研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)［J］. 肉類(lèi)研究, 2010, 24（8）： 44-46.

［19］ DEND Shaoying, WANG Daying, ZHANG Muhan, et al. Application and optimization of the tenderization of pig Longissimus dorsi muscle by adenosine 5'-monophosphate （AMP） using the response surface methodology［J］. Animal Science Journal, 2016, 87（3）： 439-448. DOI：10.1111/asj.12434.

［20］ 江慧, 何立超, 章建浩, 等. 淘汰蛋雞胸肉風(fēng)干成熟組合木瓜蛋白酶嫩化工藝優(yōu)化［J］. 食品科學(xué), 2011, 32（4）： 31-36.

［21］ 朱秀娟, 余群力, 李儒仁, 等. 采用響應(yīng)面法研究木瓜蛋白酶嫩化牦牛肉的條件［J］. 食品工業(yè)科技, 2013, 34（20）： 230-234. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2013.20.066.

［22］ 夏軍軍, 李洪軍, 賀稚非, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化酶嫩化牛肉工藝［J］. 西南大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 37（12）： 17-24. DOI：10.13718/j.cnki.xdzk.2015.12.003.

［23］ 林志民, 游立怡. 幾種牛肉嫩化方法的研究［J］. 食品工業(yè)科技, 2006, 27（7）： 127-129. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2006.07.038.

［24］ McGEE M R, HENRYB K L, BROOKS L C, et al. Injection of sodium chloride, sodium tripolyphosphate, and sodium lactate improves Warner-Bratzler shear and sensory characteristics of pre-cooked inside round roasts［J］. Meat Science, 2003, 64（3）： 273-277. DOI：10.1016/ S0309-1740（02）00189-4.

［25］ BAUBLITS R T, POHIMAN F W, BROWN A H, et al. Enhancement with varying phosphate types, concentrations, and pump rates, without sodium chloride on beef biceps femoris quality and sensory characteristics［J］. Meat Science, 2006, 72（3）： 404-414. DOI：10.1016/ j.meatsci.2005.08.006.

Response Surface Methodology for Optimization of Tenderization Conditions for Low-grade Beef Using Papain and Composite Phosphate

TAO Rui, TANG Xiaoyan*, GONG Yan, QI Kai, GENG Yongran
（Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China）

The purpose of this study was to establish the optimal tenderization conditions using papain and composite phosphate together for low-grade roast beef production. Response surface methodology （RSM） was used to model and optimize responses. Three parameters including enzymatic specific activity, phosphate concentration and time were selected as the main tenderization conditions. The responses were Warner-Bratzler shear force and sensory evaluation. The experimental data were statistically analyzed for the establishment of quadratic regression models using the Design-Expert 8.05 software. According to the results of RSM, the Warner-Bratzler shear force could be reduced remarkably by using papain and composite phosphate, and higher water retention and sensory evaluation scores were achieved by properly reducing papain dosage. The optimal tenderization parameters were determined as follows： papain activity, 9.44 U/g；phosphate concentration, 18.35 mg/mL； and tenderization time, 9.09 h. Under these conditions, the shear force was 17.25 N and the sensory evaluation was 5.02. The predicted values were proved to coincide well with the measured values. Accordingly, the developed regression models were reliable and could be used to predict the changes in shear force and sensory evaluation.

low-grade beef； papain； composite phosphate； response surface methodology； combined tenderization

10.7506/spkx1002-6630-201620003

TS251.52

A

1002-6630（2016）20-0013-06

陶瑞, 湯曉艷, 龔艷, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶-復(fù)合磷酸鹽嫩化低檔部位牛肉工藝［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）：13-18. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620003. http：//www.spkx.net.cn

TAO Rui, TANG Xiaoyan, GONG Yan, et al. Response surface methodology for optimization of tenderization conditions for low-grade beef using papain an d composite phosphate［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 13-18. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620003. http：//www.spkx.net.cn

2016-03-22

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303083）

陶瑞（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：836524745@qq.com

湯曉艷（1976—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：txycaas@126.com