超高效液相色譜-串聯質譜法檢測雞肉和雞肝中抗病毒藥物利巴韋林殘留

齊　凱，湯曉艷,，陶　瑞，楊小體，張小慶，沈習習

（1.南京農業大學食品科技學院，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081）

超高效液相色譜-串聯質譜法檢測雞肉和雞肝中抗病毒藥物利巴韋林殘留

齊凱1,2，湯曉艷1,2,*，陶瑞2，楊小體1,2，張小慶2，沈習習1,2

（1.南京農業大學食品科技學院，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081）

為研究禁用抗病毒藥物利巴韋林在雞組織中的殘留規律，對京紅蛋雞以30 mg/kg體質量劑量連續口服灌喂，在不同的時間點采集雞肉和雞肝樣品，以超高效液相色譜-串聯質譜法檢測利巴韋林含量。對雞肉、雞肝中利巴韋林檢測的方法學考察表明，雞肉中利巴韋林檢測方法線性相關系數R2＞0.99，檢出限為1.20 μg/kg，質量濃度范圍為5.0～200 μg/L；雞肝中利巴韋林檢測方法線性相關系數R2＞0.98，檢出限為1.54 μg/kg，質量濃度范圍為10.0～500 μg/L；高、中、低3 種添加水平下回收率為83.5%～120.6%，精密度（相對標準偏差）為0.7%～9.1%，滿足殘留分析方法要求。利巴韋林口服灌喂蛋雞后被迅速代謝吸收，在雞肝中代謝消除較快，殘留時間短，最長檢出時間為24 h，即超過24 h不再有檢出，雞肉中利巴韋林消除速率相對較慢，殘留時間較長，最長檢出時間為60 h，在兩種組織中均不發生蓄積現象。

雞肉；雞肝；利巴韋林；超高效液相色譜-串聯質譜法；殘留規律

利巴韋林原名三氮唑核苷，相對分子質量244.21，分子式C8H12N4O5，化學名1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4,-三氮唑-3-羧酰胺，是一種人用的抗病毒類藥物，分子結構式見圖1［1］。2005年10月農業部第560號公告［2］正式廢止了金剛烷胺、利巴韋林及其鹽、酯單復方制劑的獸藥用途。但由于其顯著的抗病毒療效，實際養殖中仍被一些養殖戶非法用于預防和治療禽類呼吸道疾病，同時獸藥專項監測也發現，部分中西復方獸藥中存在利巴韋林檢出問題。前期研究表明，利巴韋林藥物經各種給藥途徑進入動物體后，可轉移至肉、蛋、乳及內臟等動物性食品中，從而對人類的健康造成危害［3］。隨著集約化蛋禽養殖業和食品加工業的發展，淘汰蛋雞作為肉食原料大量被加工成各類產品［4］。淘汰蛋雞中藥物殘留也對禽類食品造成安全風險，因此有必要對淘汰蛋雞及其產品中常見禁用抗病毒藥物利巴韋林進行殘留監測，以確保食品安全。目前對于動物組織中利巴韋林檢測方法研究較少，主要為液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法，已有方法進樣時間長，前處理繁雜，同時不同動物種屬間利巴韋林的殘留特性也存在較大的差異，而家禽組織中利巴韋林殘留特性尚未有相關研究［5-12］。本研究首先采用改良的QuEChERS前處理方法和超高效液相色譜-串聯質譜法，建立了雞肉、雞肝組織中利巴韋林殘留檢測方法，在此基礎上，對蛋雞組織雞肉和雞肝中利巴韋林的殘留規律進行了監測，研究結果為禽類養殖中利巴韋林違法使用監管提供了方法依據，也為禽產品質量安全風險評估提供了基礎數據支持。

圖1　利巴韋林結構式Fig.1　Structure of ribavirin

1　材料與方法

1.1材料與試劑

京紅蛋雞96 只，240 日齡，購自北京平谷某養殖場，單籠飼養于標準化養殖中心。

利巴韋林標準品（純度99.9%，CAS：36791-04-5）德國Dr. Ehrenstorfer公司；13C5-利巴韋林標準品（純度99%，分子式C5H12N4O5，相對分子質量249.17）加拿大TRC公司；利巴韋林注射液（規格0.1 g/mL）杭州民生藥業有限公司；乙腈、甲酸均為色譜純；實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2儀器與設備

ACQUITY超高效液相色譜 美國Waters公司；QTRAP?6500型線性離子阱質譜儀 美國AB Sciex公司；TTL-DCⅡ型氮氣濃縮儀 北京同泰聯科技發展有限公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq反相色譜柱（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A相為0.1%（體積分數）甲酸溶液，B相為甲醇；柱平衡時間：1 min；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL；內標法定量。流動相梯度方案見表1。

表1　流動相梯度方案Table1　Gradient program of mobile phase

1.3.2質譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；檢測方式：多重反應監測；掃描方式：正離子掃描；碰撞氣壓力：2 psi；氣簾氣壓力：25 psi；霧化氣壓力：30 psi；干燥氣壓力：276 psi；電噴霧電壓：5 500 V；離子化溫度：550 ℃。

1.3.3給藥與采樣

蛋雞隨機分成12 組，每組8 只，分別編號，稱量后分籠飼養。利巴韋林原藥用無菌生理鹽水配制成30 mg/mL的溶液，蛋雞給藥前禁食12 h，自由飲水，給藥時按編號取受試雞，根據蛋雞體質量，按30 mg/kg的標準進行口服灌喂，連續給藥5 d?？瞻捉M以等量的生理鹽水灌喂。停藥0（空白樣）、2、6、12、24、36、48、60、72、120、240、480 h，剖殺取肝臟，肌肉（胸肉）組織，保鮮袋分裝，-20 ℃冰箱保存備用。

1.3.4樣品前處理

取（1±0.05） g雞肉（雞肝）樣品于50 mL離心管中，加入100 μL 0.2 mg/L質量濃度的13C5-利巴韋林內標工作液，渦旋均勻，加入1 mL超純水，超聲渦旋混勻，再加入9 mL乙腈，超聲振蕩提取，5 000 r/min離心10 min。轉移上清液，加入石墨化碳黑（graphite carbon black，GCB）40 mg和C1860 mg，渦旋后，5 000 r/min離心5 min。移取上清液，40 ℃條件下氮氣吹干，加入1 mL超純水復溶，10 000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜，上機。

1.4數據處理

采用內標法，并結合AB SCIEX質譜工作站配置的Analyst 1.6.2分析軟件，對測定的結果進行定量分析，測定不同時間點雞肝和雞肉中利巴韋林含量，作藥物殘留質量濃度-時間曲線圖。

2　結果與分析

2.1質譜條件優化

取標樣標準工作液，采用針泵進樣，正離子掃描，以藥物母離子響應最優條件來確定儀器部分質譜參數（碰撞氣壓力、氣簾氣壓力、霧化氣壓力、干燥氣壓力、電噴霧電壓、離子化溫度），進而對藥物子離子以及去簇電壓及碰撞電壓進行優化。各藥物優化后的最優質譜參數見表2。

表2　利巴韋林及13C5-利巴韋林質譜參數Table2　Optimum parameters and selected fragmentations for ribavirin and-ribavirin

表2　利巴韋林及13C5-利巴韋林質譜參數Table2　Optimum parameters and selected fragmentations for ribavirin and-ribavirin

注：*.定量離子對。

時間/ms碰撞電壓/V去簇電壓/V利巴韋林3.06245*113*501520 9650402013C5-利巴目標物保留時間/min母離子（m/z）子離子（m/z）駐留韋林3.03250113*501520 96504020

2.2特異性考察

研究發現雞肉、雞肝樣品中均含有一種與利巴韋林相似的物質，該物質與利巴韋林具有相同的質量分子數且電離打碎后有相同的離子片段，干擾利巴韋林的定性和定量分析，從而影響利巴韋林的檢出和結果準確性。Danso等［13］經過研究發現這種物質為內源性的尿苷類似物（相對分子質量244.2），該物質在質譜ESI+源中被打碎，產生的碎片離子質荷比與利巴韋林相同。為了消除尿苷類似物的影響，本研究在前處理無法將該物質除去的條件下，通過優化液相流動相成分、比例和梯度，使利巴韋林與尿苷及其碎片達到了有效分離，使其互不干擾，結果如圖2所示。

圖2　雞肉空白基質（A）、雞肉基質標準溶液（B）、空白雞肝（C）和雞肝基質標準溶液（D）二級質譜總離子流色譜圖Fig.2　MS/MS total ion current chromatograms of blank muscle （A）, ribavirin in matrix standard solution of blank muscle （B）, blank liver （C）and ribavirin in matrix standard solution of blank liver （D）

2.3方法線性范圍、回收率和精密度

為了消除基質效應對測定結果的影響，本方法采用基質標準曲線對利巴韋林進行分析，以定量離子對和內標13C5-利巴韋林的峰面積比為縱坐標（Y），以基質標準工作液質量濃度作為橫坐標（X）進行線性回歸計算。以信噪比（RSN）確定方法的檢出限（limit of detection，LOD），得到利巴韋林在雞肉、雞肝中的LOD（RSN=3）分別為1.20 μg/kg和1.54 μg/kg。同時，在空白雞肉、雞肝中分別以高、中、低3 個添加水平做利巴韋林添加回收實驗。雞肉中利巴韋林的回收率在104.8%～120.6%之間；雞肝中利巴韋林的回收率在83.5%～113.7%之間；利巴韋林在雞肉、雞肝中的準確度和精密度滿足基本要求，如表3所示。

表3　雞肉、雞肝中利巴韋林回收率和精密度（n=6）Table3　Recovery and precision of ribavirin in chicken muscle and liver （ n= 6）

2.4不同時間雞肉、雞肝中利巴韋林殘留規律

圖3　口灌給藥后雞肉、雞肝中利巴韋林殘留量-時間曲線（n=6）Fig.3　Concentration-time curve of ribavirin in chicken muscle and liver after oral administration （n = 6）

蛋雞以30 mg/kg體質量標準連續口服灌喂5 d，以藥物殘留量平均值和時間的關系作藥物殘留消除曲線圖（圖3）。由圖3可以看出，雞肝臟中利巴韋林最高殘留量為91.65 ng/g，雞肉中利巴韋林最高殘留量為402.97 ng/g，說明利巴韋林在雞肉中殘留量大，在雞肝中殘留量較低。從2 種組織中利巴韋林最長檢出時間來看，雞肝中利巴韋林最長檢出時間為24 h，雞肉最長檢出時間為60 h，說明利巴韋林在雞肉中殘留時間長，在雞肝中殘留時間較短。從殘留消除曲線斜率來看，12 h前利巴韋林在雞肉中消除速度較快，很快從較高質量濃度降到較低質量濃度，隨后以低質量濃度水平在雞肉中緩慢消除。

3　討 論

3.1檢測方法優化

在質譜參數優化中，根據目標物質量分子數及分子結構特點，目標分析物通常會結合質子、銨根離子或者帶正電荷的堿金屬離子，在ESI+模式下成為帶正電荷的加合離子，如［M+H］+、［M+NH3］+和［M+Na］+等。本研究參考Danso等［13］的方法，采用針泵進樣，分別在正負離子模式下進行母離子Q1掃描，結果表明，利巴韋林在正離子模式下響應強度大，因此選取［M+H］+峰為準分子離子峰，確定母離子為m/z 245。通過優化碰撞能，以其分子斷裂的方式，對碎片離子進行優化選擇，得到主要子離子對為m/z 113和m/z 96。

由于利巴韋林的強極性，在普通C18反相色譜柱上保留性差，本實驗采用對極性化合物具有良好保留效果的Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），同時采用高比例的水相進行洗脫，使目標物與基質中的尿苷類似物達到有效分離。

利巴韋林屬于強極性的化合物，易溶于水和一些有機溶劑［14］。目前對于動物組織中利巴韋林的提取，主要是有機溶劑和水相結合的方式，有機溶劑使蛋白、核苷等大分子物質變性，從而去除干擾。目前已有研究采用提取溶劑包括0.1%甲酸溶液-乙腈溶液（1∶9，V/V）、0.1%甲酸溶液-20 mmol/L乙酸銨甲醇溶液（1∶9，V/V）、乙腈-水（9∶1，V/V）、甲酸-水（9∶1，V/V）等［15］。本實驗對以上提取溶劑進行了比較優化，發現乙腈-水（9∶1，V/V）作為提取溶劑具有良好的提取效果。

關于利巴韋林的凈化方式，目前主要采用固相萃取技術，如MCX萃取柱、NH2萃取柱、PBA萃取柱和HLB萃取柱等［16-17］。本研究利用QuEChERS快速樣品前處理方法原理，采用C18和GCB兩種主要的固相萃取材料進行樣品凈化，取得了良好提取效果，回收率明顯高于固相萃取柱，且操作簡單、凈化時間短。

3.2雞肉、雞肝中利巴韋林殘留特性

目前利巴韋林在機體內的研究主要在藥物代謝動力學方面，研究對象集中在大鼠、獼猴、仔豬和人等哺乳類動物，對于禽類組織中的研究甚少［18-23］。Catlin等［24］研究發現，人體單劑量口服利巴韋林后吸收迅速，血藥濃度在1～1.5 h即達到峰值。劉雪梅［25］對利巴韋林在仔豬體內的代謝研究發現，利巴韋林在仔豬體內吸收好，分布廣泛，但代謝消除速率緩慢，容易在仔豬組織中產生蓄積，引起中毒癥狀。這說明不同動物種屬之間，利巴韋林的代謝、吸收、分布和殘留特性存在較大差異。Glue等［26］研究發現利巴韋林消除主要途徑是代謝轉化，經腎臟排泄消除的原型僅占5%～15%。劉敬先等［1］研究也提出利巴韋林原藥在機體內主要是以糞便形式排出，但原型約占17%。本課題組前期對蛋雞中利巴韋林藥物代謝動力學研究發現，利巴韋林在蛋雞血漿中代謝消除速率很快，半衰期僅1.59 h，主要是原型藥物發生了代謝轉化，生成了代謝產物［27］。

雞肉、雞肝兩種組織中雞肉的利巴韋林殘留量大，而肝臟中殘留量低。蛋雞經30 mg/kg體質量連續口服灌喂利巴韋林后，肝臟中利巴韋林原藥最高殘留量為91.65 ng/g，雞肉中最高殘留量為402.97 ng/g，這可能是肝臟作為藥物代謝器官，導致利巴韋林在肝臟中發生了代謝轉化。本實驗結果發現，利巴韋林在蛋雞體內代謝吸收速度快，在組織中消除速度也快，雞肝與血液具有相似的代謝殘留特點，即原藥殘留量低，代謝轉化速度快。利巴韋林在組織中最長檢出時間點雞肝為24 h，雞肉為60 h。結合本課題組鄭鋅等［27］對利巴韋林在蛋雞體內藥物代謝動力學研究可以看出，蛋雞口服給藥后藥物迅速向血液中轉移，血漿中的最大殘留量達到2 796 ng/mL，本研究同時也發現藥物也向肝臟、雞肉組織中轉移，并且在雞肉中消除速率緩慢。說明禽類養殖中違禁使用利巴韋林會對禽肉產品帶來一定的安全風險隱患。

4　結 論

本研究建立了雞肉、雞肝中利巴韋林超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，方法線性關系良好（R2＞0.98），回收率為83.5%～120.6%，精密度（相對標準偏差）為0.7%～9.1%。雞肉、雞肝的LOD分別為1.20、1.54 μg/kg，樣品分析時間短、操作簡單，可作為禽類養殖中禁用抗病毒藥物利巴韋林殘留監管的手段。同時對可食用組織雞肉、雞肝中利巴韋林殘留特性進行了研究，發現利巴韋林在雞肉組織中殘留量比雞肝中殘留量大，殘留時間比雞肝中殘留時間長，禽類養殖中違禁使用利巴韋林會對禽產品質量安全造成一定的風險隱患。

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Determination of Residues of the Antiviral Drug Ribavirin in Chicken Muscle and Liver by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

QI Kai1,2, TANG Xiaoyan1,2,*, TAO Rui2, YANG Xiaoti1,2, ZHANG Xiaoqing2, SHEN Xixi1,2
（1. National Centry of Meat Quality and Safety Control, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China； 2. Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China）

This study aimed to investigate the distribution prolfiles of residues of the antiviral drug ribavirin in chicken tissues, whose use has been banned. Ribavirin at the dose of 30 mg/kg was continuously administered to Jinghong laying hens. The animals were executed and chicken muscle and liver samples were collected at different time intervals for the detection of ribavirin content by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The calibration curve for ribavirin in chicken muscle was linear in the concentration range of 5.0-200 μg/L with a correlation coefficients （R2） of above 0.99, and the limit of detection （LOD） was 1.20 μg/kg. The calibration curve for ribavirin in chicken liver was linear in the concentration range of 10.0-500 μg/L with a correlation coefficients （R2） of above 0.98, and the the limit of detection （LOD） was 1.54 μg/kg. At three spiked concentration levels, the recoveries of ribavirin ranged from 83.5% to 120.6%, and the precision expressed as relative standard deviation （RSD） ranged from 0.7%-9.1%, which met the basic quantitative requirements. The results showed that ribavirin in chicken liver was rapidly eliminated and the final detection time was 24 h, while the elimination rate for muscle was relatively slow, and the final detection time was 60 h after oral administration. Finally, there was no accumulation of ribavirin residue in both tissues.

chicken muscle； liver； ribavirin； ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；residue distribution pattern

10.7506/spkx1002-6630-201620024

TS251.7

A

1002-6630（2016）20-0146-05

齊凱, 湯曉艷, 陶瑞, 等. 超高效液相色譜-串聯質譜法檢測雞肉和雞肝中抗病毒藥物利巴韋林殘留［J］. 食品科學, 2016, 37（20）： 146-150. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620024. http：//www.spkx.net.cn

QI Kai, TANG Xiaoyan, TAO Rui, et al. Determination of residues of the antiviral drug ribavirin in chicken muscle and liver by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 146-150. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620024. http：//www.spkx.net.cn

2016-05-26

中國農業科學院科技創新工程項目

齊凱（1988—），男，碩士研究生，研究方向為畜產品質量安全。E-mail：410584866@qq.com

湯曉艷（1976—），女，研究員，博士，研究方向為畜產品質量安全。E-mail：txycaas@126.com