小鼠法檢測脂溶性貝類毒素假陽性來源分析

劉曉玉，徐　靜，晚觀生，劉慧穎，曹際娟,,

（1.大連工業大學，遼寧 大連 116034；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001）

小鼠法檢測脂溶性貝類毒素假陽性來源分析

劉曉玉1，徐靜2，晚觀生1，劉慧穎2，曹際娟1,2,*

（1.大連工業大學，遼寧 大連 116034；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001）

目的：探討牡蠣樣品中游離脂肪酸含量隨貯存溫度和時間的變化，以期對小鼠法檢測脂溶性貝類毒素假陽性結果的來源進行探索和分析。方法：采用三氟化硼甲酯化法對脂肪酸進行衍生化，使用固定液100%二氰丙基聚硅氧烷的毛細管色譜柱對牡蠣樣品中游離脂肪酸進行檢測。結果：-10 ℃和-20 ℃貯存樣品中游離脂肪酸總含量隨時間延長先增加后減少，之后再緩慢增加，4 ℃貯存樣品中游離脂肪酸總含量隨貯存時間的延長一直緩慢增加；貯存時間相同，-20 ℃貯存樣品游離脂肪酸含量明顯高于-10 ℃。在3 種貯存溫度條件下，高毒游離脂肪酸C20∶5n-3和低毒游離脂肪酸C22∶6n-3含量均隨時間延長而增長。5 個月后-20 ℃貯存樣品中C20∶5n-3含量為136.79 μg/g，達到小鼠最小致死量（6 mg）45%；若取2.5 倍稱樣量進行實驗，可導致小鼠法假陽性結果。結論：牡蠣樣品中高毒游離脂肪酸是小鼠法檢測脂溶性貝類毒素假陽性結果的重要來源，且高毒游離脂肪酸含量隨貯存溫度和時間變化呈增長趨勢。

小鼠法；脂溶性貝類毒；假陽性；游離脂肪酸

隨著貝類毒素分析技術不斷發展，許多國家和組織相繼提出了用液相色譜-質譜聯用分析技術替代小鼠生物法的建議，但是許多檢驗檢疫機構仍然在使用SCT 3023—2004《貝類中麻痹性小鼠法貝類毒素的測定》、SN/T 1573—2013《出口貝類中神經性貝類毒素檢測方法》、SNT 2131.2—2010《貝類腹瀉性貝類毒素檢驗方法》等相關標準的中小鼠生物法來進行貝類毒素的監測分析。鑒于小鼠法直觀監測貝類毒素毒性大小的不可代替性，故該方法仍然作為貝類毒素的常規監控分析技術被廣泛使用。根據相似相溶原理，小鼠法檢測脂溶性貝類毒素時，游離脂肪酸常被提取溶劑提取到待測液中，之后經腹腔注射進入小鼠體內。早在1982日本學者Takagi等［1］使用游離脂肪酸標準品對小鼠進行腹腔注射，發現游離脂肪酸對小鼠具有很大的毒害作用。之后Takagi等［2］進一步對不飽和游離脂肪酸的毒害作用進行研究，發現其中的多烯游離脂肪酸可能是小鼠生物法檢測腹瀉性貝毒假陽性結果的主要來源。

針對此問題，很多學者進行探索研究［3-8］。唐倩囡等［6］發現貯藏溫度和時間等因素會引起貝類腸腺產生某種生化物質，這種生化物質經高效液相色譜-串聯質譜法確認并非脂溶性貝毒，但是這種生化物質進行小鼠實驗卻導致小白鼠死亡出現假陽性結果，從而影響小鼠法檢測貝毒的結果。沈志剛［7］采用1%硫酸-甲醇甲酯化進行脂肪酸衍生化和帶有聚乙二醇涂層的毛細管色譜柱對陰性牡蠣樣品中游離脂肪酸進行研究，并對其隨貯存時間和貯存溫度含量變化進行監測分析，發現當-10 ℃冷凍保存4 個月時C20∶5n-3含量為389.0 mg/kg，相當于1 mL中小鼠腹腔注射液含有7.78 mg C20∶5n-3，可造成小鼠死亡。

當前脂肪酸的檢測，前處理的衍生化法［9-13］主要有堿法甲酯化、硫酸甲醇甲酯化、三氟化硼甲酯化。堿法甲酯化只適合于脂肪；硫酸-甲醇甲酯化既適于游離脂肪酸，又適合于結合態脂肪酸（脂肪）［9］，但是容易造成長鏈脂肪酸（碳鏈長度大于20 個碳原子）的損失［14］。三氟化硼法能利用快速皂化使脂肪酸鹽直接轉化成脂肪酸甲酯，減少酸化提取手續，并可防止常規法皂化時所引起的異構化［15］。本實驗每次對所用的牡蠣樣品中貝類毒素含量先進行液相色譜-串聯質譜法的檢測確證，確定整個實驗過程中貝類毒素的檢測結果均為陰性。之后采用采用氣相色譜法對小鼠法檢測脂溶性貝類毒素假陽性結果來源進行探索研究，對牡蠣樣品中游離脂肪酸的含量在不同貯存溫度條件下隨貯存時間的變化進行監測。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

牡蠣購于大連市場，收獲季節為7月份。

甲醇、二氯甲烷、氫氧化鈉、丙酮、正己烷均為色譜純；氯化鉀和氯化鈉均為國產分析純；37 種脂肪酸甲酯混合標準品 美國Supelco公司；三氟化硼-10%甲醇溶液、丁羥甲苯和Amberlyst-A26陰離子交換樹脂 美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

GC-2010 Plus氣相色譜儀 日本島津公司；Z 323K臺式高速離心機 德國Hermle公司；HY-4調速多用振蕩器 國華電器有限公司；R-210旋轉蒸發儀瑞士Büchi公司；T25 basic高度分散機 德國IKA公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品的前處理

將在大連市場上購買的新鮮牡蠣，去除外殼，立刻放入-10 ℃和-20 ℃的冰箱進行貯藏。檢測時，到樣品處理室用絞碎機打碎，待稱樣使用。在室溫條件下使冷凍樣品融化呈半冷凍狀態，此時的貝肉仍呈冷凍狀態，除去牡蠣外部附著的冰片，用吸水紙輕輕抹去水分后，稱量10 g牡蠣肉作為檢樣。

1.3.2樣品總脂肪的制備［16-17］

取牡蠣碎肉樣品10 g，于100 mL離心管（帶孔的蓋子）中，加入二氯甲烷-甲醇溶液（2∶1，V/V）50 mL和丁羥甲苯10 μL，然后用高度分散機均質勻漿 1 min、4 000 r/min條件下離心5 min；取出離心管后，取下層溶液（二氯甲烷大約30 mL）于50 mL具塞試管中，加入5 mL的0.88% KCl溶液后輕輕振蕩混勻，混勻過程中不斷開蓋放氣。過夜分層后取下層液體到250 mL圓底燒瓶中進行減壓濃縮真空干燥，所得黏稠狀油狀物即為粗脂肪。

1.3.3游離脂肪酸的的制備

1.3.3.1Amberlyst-26（A-26）陰離子交換樹脂的活化［18-21］

稱取5 g A-26樹脂，加入50 mL濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液，用調速多用振蕩器以60 r/min振搖30 min，倒掉NaOH溶液，用高純水洗樹脂3 次，每次皆用10 mL高純水并振搖20 min，用30 mL甲醇洗3 次，每次皆用10 mL甲醇且振搖20 min，重復上述甲醇洗樹脂一次，將A-26樹脂保存于甲醇中。因A-26陰離子交換樹脂具有強烈的魚腥味，故稱量應快速進行。

1.3.3.2游離脂肪酸的提取

經過減壓濃縮得到總脂肪后，在圓底燒瓶中加入15 mL丙酮-甲醇溶液（2∶1，V/V）和250 mg A-26陰離子交換樹脂，置于調速多用振蕩器中以水平60 r/min常溫振蕩2 h后去除溶液，用丙酮-甲醇溶液洗5 次（共用20 mL），最后在旋轉蒸發儀在常溫條件下小轉速樹脂吹干后待甲酯化。

1.3.4三氟化硼甲酯化［22-23］

在圓底燒瓶中加入5 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液混勻后連接回流裝置。在100 ℃水浴中加熱回流6～8 min，然后加3 mL三氟化硼-10%甲醇溶液反應5 min，取出冷凝裝置將燒瓶冷卻至室溫后加入2 mL正己烷，將液體轉入15 mL離心管中，后用3 mL飽和氯化鈉溶液清洗平底燒瓶3 次，合并飽和氯化鈉溶液于15 mL離心管，充分振搖后以2 000 r/min離心5 min。吸取上層溶液（正己烷層）約l mL于樣品瓶中作為測試液，供氣相色譜儀測定。

三氟化硼-10%甲醇溶液是強腐蝕性劇毒試劑，甲酯化反應必須在通風安全櫥中進行；甲酯化后的試樣應盡快進行氣相色譜分析。如需保存，應用惰性氣體保護，密封并冷藏于-4 ℃冰箱中。

1.3.5氣相色譜檢測條件［22,24］

氣相毛細管色譜柱內壁涂有固定液100%二氰丙基聚硅氧烷，型號CNW CD-2560（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；檢測器：氫火焰離子化檢測器；檢測器溫度：280 ℃；進樣口溫度：260 ℃；氣化室溫度：250 ℃；柱溫箱溫度：初始溫度140 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫至240 ℃，保持15 min；載氣：N2；載氣流速：1.0 mL/min；分流比：100∶1；進樣量：1 μL。

2　結果與分析

2.1牡蠣中脂肪酸的檢測結果

分別對新鮮牡蠣、4 ℃貯存、-10 ℃貯存及-20 ℃貯存條件下，牡蠣中游離脂肪酸的變化進行了考察。圖1為37 種游離脂肪酸甲酯標準品圖譜；圖2為牡蠣樣品中脂肪酸圖譜。

圖1　37種脂肪酸甲酯標準品氣相色譜圖Fig.1　Profiles of 37 fatty acid methyl ester standards

從圖1可以看出，牡蠣中含量較高的游離脂肪酸約有20 種。Takagi［1］以游離脂肪酸標準品對小鼠腹腔注射的進行毒性研究，結果表明C20∶4n-6、C18∶3n-3、C20∶5n-3鼠單位（MU）劑量為6～12 mg，表現出高毒性；而C18∶2n-6t、C18∶2n-6c、C22∶6n-3鼠單位劑量為12～25 mg，表現出低毒性，C18∶1n-9鼠單位劑量為25～50 mg幾乎無毒。本實驗針對游離脂肪酸總含量，以及高毒和低毒的游離脂肪酸含量隨貯存溫度和時間的變化進行了監測分析。

圖2　牡蠣樣品脂肪酸甲酯氣相色譜圖Fig.2　Profiles of fatty acid methyl esters from oyster samples

2.2牡蠣中游離脂肪酸總含量隨貯藏條件的變化

對實驗結果進行分析，牡蠣貯存過程中游離脂肪酸總含量變化情況為在相同貯存時間中，-10、-20 ℃牡蠣中脂肪酸總含量都是隨貯存溫度的升高先升高后降低，之后緩慢升高，主要原因是C18∶2n-6t先升高，后劇烈下降，接近于零。新鮮牡蠣中脂肪酸總含量為270.78 μg/g，貯存5 個月后-20 ℃的牡蠣中游離脂肪酸總含量為333.35 μg/g，明顯高于-10 ℃貯存的總含量199.48 μg/g。（圖3）。對貯存4 個月后的牡蠣樣品進行了加速實驗，取出冷凍樣品，在貯存（4 ℃）條件下考察其脂肪酸含量1周內的變化，發現其含量隨時間的延長而升高（圖4）；超過1 周后4 ℃貯存的牡蠣樣品發生了腐爛變質現象。

圖3　不同溫度貯存牡蠣肉中脂肪酸總含量變化Fig.3　Changes in the content of total toxic fatty acids in oysters at different storage temperatures

圖4　4℃貯存7 d條件下牡蠣中脂肪酸總含量變化Fig.4　Changes in the content of total toxic fatty acids in oysters with storage time

2.3牡蠣中低毒和高毒游離脂肪酸含量隨貯藏條件的變化

圖5　不同貯存溫度牡蠣中有毒脂肪酸含量變化Fig.5　Changes in contents of toxic fatty acids in oysters at different storage temperatures

由圖5可以看出，-10 ℃和-20 ℃貯藏時，低毒游離脂肪酸C18∶2n-6t含量都是隨時間延長先升高后劇烈下降接近于零，C18∶2n-6c幾乎不變，C22∶6n-3含量隨貯存時間變化則緩慢增長（圖5a和c）。高毒游離脂肪酸C20∶5n-3含量劇烈增長，C18∶3n-3緩慢增長，C20∶4n-6變化趨勢不明顯。從貯存第2個月起，-20 ℃貯存的牡蠣中每一種有毒游離脂肪酸含量均明顯高于-10 ℃貯存的牡蠣含量。

在加速實驗（4 ℃貯存）條件下，牡蠣中低毒游離脂肪酸C22∶6n-3含量第5天之前緩慢增加，之后劇烈增長（圖6）；而C18∶2n-6t和C18∶2n-6c變化趨勢不明顯；牡蠣中高毒游離脂肪酸C20∶5n-3含量變化趨勢同C22∶6n-3，但是C20∶5n-3含量明顯高于C22∶6n-3，C18∶3n-3緩慢增長，C20∶4n-6變化趨勢不明顯。

圖6　4 ℃貯存牡蠣中有毒脂肪酸含量變化Fig.6　Changes in contents of toxic fatty acids in oyster stored at 4 ℃

2.4小鼠法檢測牡蠣中脂溶性貝毒假陽性結果來源分析

表1　牡蠣中高毒游離脂肪酸含量與小鼠法致死量的關系Table1　Relationship between the contents of highly toxic free fatty acids in oysters and their lethal dose for mouse

根據現行國標［25］，采用有機試劑提取脂溶性貝毒，將1 mL注射液（內含有20 g貝肉樣品提取液），腹腔注射導致小鼠死亡的含量，定義為一個鼠單位（MU）。但有機試劑不但可提取出脂溶性貝毒，也會將其中的高毒游離脂肪酸提取出來，特別是3 種高毒游離脂肪酸，是造成假陽性結果的主要原因。根據文獻［1］的研究結果，脂肪酸對小鼠致死量C20∶4n-6、C18∶3n-3、C20∶5n-3鼠單位劑量為6～12 mg，表現出高毒性。表1列出了本實驗3種高毒性游離脂肪酸的致死量，與歷經貯存后牡蠣中的脂肪酸含量對比。可見各高毒脂肪酸含量均隨著貯存時間延長而升高，特別是C20∶5n-3，在-20 ℃貯存5 個月后，其含量已經達到最小致死量（6 mg）的45%。此含量雖然尚不足以致小鼠死，但如果將檢測稱樣量加大，則也會引起假陽性結果。結合脂肪酸隨貯存時間而增長的趨勢，可以預測在后續貯存過程中，各高毒脂肪酸將有可能增長到小鼠致死的劑量。

根據文獻［7］研究結果，C20∶5n-3在-10 ℃貯存4 個月后，含量即可達到389 μg/g，可導致小鼠死亡，與本實驗所獲得結果不同。游離離脂肪酸的產生，可作為水產品腐敗的監測指標之一，但目前尚無公認的水解機理，普遍認為是由三酰甘油經化學水解或者酶促水解產生［26］。但不同的動物品種，水解的過程機理和水解的最終結果都會有所不同，武華等［27］對凍藏溫度對鳙魚片脂質特性變化的影響進行研究，考察了-10、-20 ℃和-30 ℃貯存條件下，鳙魚片中游離脂肪酸總含量的變化，其結果是前2 個溫度條件下，脂肪水解量在前4 周快速升高，而后漸趨平緩；-30 ℃條件則是一直緩慢升高，這與本實驗研究牡蠣的結果，以及張寧等［8］研究的牡蠣結果也不同。因此本實驗認為，游離脂肪酸的水解過程，會受到物種的影響而不同，也會受到同一物種而不同產地乃至不同收獲季節的影響。

3　結 論

牡蠣在冷凍貯存過程，體內的三酰甘油經化學水解或者酶促水解產生游離脂肪酸，經檢測發現有毒脂肪酸含量占測得20 種脂肪酸總含量的66%～71%，特別是其中3種高毒性脂肪酸，C18∶3n-3、C20∶4n-6和C20∶5n-3，其含量均隨著貯藏時間的延長而緩慢增加。在-20 ℃貯存5 個月后，C20∶5n-3的含量即可接近小鼠的半數致死量，可認為高毒游離脂肪酸是造成小鼠法檢測脂溶性貝毒假陽性結果的重要原因之一。

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Inquiry and Analysis of Sources of False Positive Results for the Detection of Fat Soluble Shellfish Toxins by the Mouse Bioassay

LIU Xiaoyu1, XU Jing2, WAN Guansheng1, LIU Huiying2, CAO Jijuan1,2,*
（1. Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116001, China）

Objective： To examine the changes in free fatty acid contents in oyster with storage temperature and storage time for the purpose of exploring and analyzing the sources of false positive results in mouse bioassay for fat soluble shellfi sh toxins. Methods： Methyl esterifi cation of free fatty acids was carried out with boron trifl uoride in methanol. The products were analyzed by gas capillary chromatography with a column coated with a 100% cyanopropyl polysiloxane stationary phase. Results： The total content of free fatty acids stored at -10 ℃ and -20 ℃ increased at first, then decreased, and slowly increased again with prolonging time. When the sample was stored at 4 ℃, there was a slowly increasing trend. The content of free fatty acids stored at -20 ℃ was signifi cantly higher than at -10 ℃ at the same storage time. At all the three storage temperatures, the contents of the highly toxic free fatty acid C20：5n-3and the low toxic fatty acid C22：6n-3kept increasing throughout the storage period. Five months later, C20∶5n-3in oyster stored at -20 ℃ was 136.79 μg/g, which was 45% of the lethal dose for mice. If 2.5-fold weight of the oyster sample was used, the mice would die, leading to false positive results in mouse bioassay for fat soluble shellfi sh toxins. Conclusion： The high toxic free fatty acid in oyster samples was important source of false positive results in mouse bioassay for fat soluble shellfi sh toxin, and the content of high toxic free fatty acid in oyster samples presented an increasing trend at three temperatures as time goes by.

mice method； fat soluble shellfish poison； false positive； free fatty acid

10.7506/spkx1002-6630-201620026

TS254.4

A

1002-6630（2016）20-0157-05

劉曉玉, 徐靜, 晚觀生, 等. 小鼠法檢測脂溶性貝類毒素假陽性來源分析［J］. 食品科學, 2016, 37（20）： 157-161.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620026. http：//www.spkx.net.cn

LIU Xiaoyu, XU Jing, WAN Guansheng, et al. Inquiry and analysis of sources of false positive results for the detection of fat soluble shellfish toxins by the mouse bioassay［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 157-161. （in Chinese with English abstract）

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620026. http：//www.spkx.net.cn

2016-02-04

國家公益性行業（質檢）科研專項（201310141）

劉曉玉（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品質量安全檢測。E-mail：liuxiaoyua@sina.com

曹際娟（1968—），女，研究員，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：cjj0909@163.com