實時熒光PCR法鑒定食品中雙歧桿菌

肖其勝，楊捷琳，楊惠琴，丁卓平，何宇平,

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

實時熒光PCR法鑒定食品中雙歧桿菌

肖其勝1,2，楊捷琳2，楊惠琴2，丁卓平1，何宇平2,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

根據雙歧桿菌屬16S rRNA基因的保守區序設計特異性引物和探針，建立一種鑒定食品中雙歧桿菌屬的實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法。對方法的特異性、靈敏度、重復性和體系抗干擾能力進行驗證，最后采用該方法對市售25 份標示含雙歧桿菌樣品進行檢測。結果表明：該檢測方法可特異性檢測雙歧桿菌屬細菌，對近緣的乳桿菌屬、鏈球菌屬及食品中常見菌群包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等均無擴增。雙歧桿菌DNA檢測絕對靈敏度可達到2 pg，相對靈敏度可達到104CFU/mL。重復性測試表明相對標準偏差小于1%。同時進行了雜菌干擾檢測實驗，在培養物水平和純基因組DNA水平上將青春雙歧桿菌ATCC15703與大腸桿菌ATCC25922混合進行檢測，檢出Ct值較純菌檢測時無顯著影響，表明建立的熒光PCR方法抗干擾能力良好。對25 份市售實際樣品進行測試，有5 份標識含有“雙歧桿菌”的樣品未檢測出雙歧桿菌成分。本研究所建立的實時熒光PCR法能準確、快速檢測食品中雙歧桿菌屬細菌。

實時熒光聚合酶鏈式反應；雙歧桿菌；16S核糖體RNA；鑒定

雙歧桿菌是一類存在于人體中非常重要的專性厭氧菌，于1899年首先在母乳喂養的健康嬰兒糞便中發現并分離，研究證實雙歧桿菌具有平衡腸道菌群、降膽固醇、延緩衰老及抗腫瘤等生理功能，是人體益生菌群的主要組成［1-4］。因此，添加雙歧桿菌的微生態制劑開發研究已成為一大熱點，廣泛應用于食品、保健和醫療等領域［5-7］。

在雙歧桿菌等益生菌制劑需求大增的同時，不斷有報道指出國內外市場上雙歧桿菌微生態制劑標示名稱混亂，很多國家市場上雙歧桿菌制品假冒代替現象嚴重［8］。由于沒有相關法規，也沒有一套完整的體系進行監控，一些酸奶品牌包裝上雖然標示含有高科技益生菌群成分，但到底有無添加都是廠家自說自話，實際上可能與普通酸奶并無多大差異，甚至出現在雙歧桿菌發酵乳制品中檢驗不出雙歧桿菌的以假亂真現象［9-10］。為防止名不副實、以次充好現象的發生，建立基于物種分子特征性序列的雙歧桿菌特異性檢測鑒定方法至關重要。

目前基于DNA的檢測方法由于快速、靈敏、省時省力等優點越來越多地應用到物種鑒定中［11-15］。其中實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術以其高特異性、快速、高靈敏度、無污染等優點，廣泛地應用在食品檢測中［16-19］。本研究旨在建立基于雙歧桿菌屬16S rRNA保守區基因的特異性序列運用實時熒光PCR方法檢測鑒定食品中雙歧桿菌成分的方法，以保障消費者利益，確保食品質量安全。

1　材料與方法

1.1材料與菌種

表1　標準菌種名稱及編號Table1　Names and serial numbers of standard strains

發酵乳、嬰幼兒配方奶粉和含益生菌食品均購自上海各大超市，所有樣品均標示含有雙歧桿菌。記錄所有樣品標示的菌種成分，包括菌種名稱等。

根據衛生部《可用于食品的菌種名單》，本研究供試菌株包括雙歧桿菌的6 個種共8 株；非雙歧桿菌共46 株，包括12 株乳桿菌，2 株嗜熱鏈球菌；以及大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等其他細菌共32 株［20］。菌株樣本詳見表1。

1.2試劑與儀器

脫脂牛乳培養基：脫脂奶粉120.0 g，蒸餾水1.0 L，自然pH值。113 ℃滅菌20 min；強化梭菌瓊脂培養基（CM1542） 北京路橋技術有限股份公司；檸檬酸三鈉二水、氫氧化鈉、無水乙醇、三氯甲烷、酚氯仿 生工生物工程（上海）股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒（Cat.：DP302-02）、蛋白酶K（20 mg/mL）、溶菌酶溶液（50 mg/mL）、瓊脂糖、溴化乙錠、1×TE（Cat.：DP324-03）、50×TAE Electrophoresis buffer（Fermentas）、DL 2000 DNA Marker 天根生化科技有限公司；TaKaRa Ex TaqTMPCR試劑 寶生物工程（大連）有限公司；HR qPCR Master Mix（Cat：SJ-2101B）上海輝睿生物科技有限公司。所有化學試劑均為分析純。

Vii7實時熒光PCR儀 美國ABI公司；麥氏比濁儀生物梅里埃中國有限公司；Eppendorf Centrifuge 5415R離心機、Thermomixer Comfort恒溫振蕩孵育器、Eppendorf Mastercycle Gradient PCR儀 德國艾本德公司；NanoVue Plus微量分光光度計 上海匯檢菁英科技有限公司；200/2.2電泳儀、CLP 75.2314電泳槽 伯樂生化儀器公司；ALPHA 2S-2200凝膠分析成像系統 溫州市安萊科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株的處理

冷凍干燥的雙歧桿菌菌株首先轉接于強化梭菌瓊脂培養基中，37 ℃厭氧培養24 h，轉接2代恢復活力用于后續實驗。

1.3.2樣品制備

相對靈敏度測試樣品選取巴氏殺菌純牛乳作為基質，代表菌株青春雙歧桿菌ATCC15703和長雙歧桿菌ATCC15707培養物稀釋到109CFU/mL，取1 mL培養物加入到9 mL純牛乳中，混勻后，按上述方法用純牛乳10 倍梯度稀釋至10 CFU/mL，每個濃度梯度樣品取1 mL備用。

抗干擾能力測試樣品是將青春雙歧桿菌ATCC15703培養物由109CFU/mL 10 倍梯度稀釋到104CFU/mL，分別與106、102CFU/mL兩種濃度的大腸桿菌ATCC25922培養物1∶1混合備用。

1.3.3DNA提取

將不同菌株培養物、混合樣品或實際樣品，使用DNA提取試劑盒并按其操作步驟提取DNA，每次DNA提取均設置提取空白對照。用微量分光光度計測定DNA質量濃度后，置于-20 ℃保存備用。

1.3.4引物和探針設計

在NCBI網站上（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ nucleotide/）下載雙歧桿菌屬16S rRNA基因序列建立本地數據庫，采用ClustalW軟件對雙歧桿菌屬16S rRNA基因保守區進行比對，然后使用PrimerExpress軟件設計引物（FBP：5'-GTT GGG TTA AGT CCC GCA A-3'，RBP：5'-TGA AGC CCT GGA CGT AAG G-3'，BP：5'-FAMACG TAA GGG GCA TGA TGA TCT GAC G-BHQ1-3'）用于雙歧桿菌鑒定，擴增產物片段長為145 bp。在NCBI網站上使用BLAST數據庫比對引物和探針的理論特異性。細菌通用引物序列（27F-5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，1492R-5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）用于擴增提取的DNA［21］，細菌通用引物可在所有細菌的DNA中擴增出目的條帶。雙歧桿菌屬16S rDNA tuf基因的引物序列（Bif_tuf_F-5'-GTC CGT GAC CTC CTC GAC-3'，Bif_tuf_R-5'-GTG GAA GGT CTC GAT GGA G-3'）［22］，可對實際樣品中提取的雙歧桿菌DNA進行擴增，片段大小為339 bp。引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成。

1.3.5PCR反應條件

1.3.5.1普通PCR

普通PCR采用25 μL體系進行PCR擴增，其中包括12.5 μL TaKaRa Ex Taq預混液，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，2.5 μL DNA模板，去離子水補足至25 μL。

普通PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。

PCR產物檢測方法：取5 μL PCR產物，在2.0%瓊脂糖凝膠和0.2% TAE緩沖液中電泳30 min（120 V），然后采用凝膠成像系統拍照存檔。

1.3.5.2實時熒光PCR

實時熒光PCR反應體系為25 μL，包含Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.25 μL，探針（10 μmol/L）0.625 μL，2.0 μL DNA模板，去離子水補足至25 μL。采用實時熒光PCR系統進行擴增。實時熒光PCR反應參數：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火45 s，45 個循環。熒光信號在58 ℃時收集。

1.3.6檢測方法的特異性、靈敏度和重復性測試

特異性測試采用8 株雙歧桿菌，14 株近緣乳酸菌，以及32 株其他細菌DNA為模板，采用建立的實時熒光PCR檢測方法進行擴增。

檢測方法的靈敏度測試包括絕對靈敏度和相對靈敏度。絕對靈敏度測試選取收集的8 株雙歧桿菌，分別將提取的DNA溶液稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 ng/μL，進行實時熒光PCR擴增。相對靈敏度測試采用配制的以純牛乳作為背景的青春雙歧桿菌ATCC15703、長雙歧桿菌ATCC15707混合樣品DNA為模板，采用建立的實時熒光PCR方法進行測試。靈敏度測試每個質量濃度設置5 個平行，實驗重復4 次，即每個質量濃度得到20 個對應的Ct值，以滿足不小于95%置信區間的要求，計算陽性擴增的次數。

重復性測試采用雙歧桿菌標準菌株DNA的5 個質量濃度梯度稀釋液分別進行擴增，每個質量濃度重復3 次，計算Ct值的標準偏差和相對標準偏差。

1.3.7實時熒光PCR體系抗干擾能力測試

對建立的實時熒光PCR體系抗干擾能力測試包括培養物水平和純基因組DNA水平。培養物水平測試對配制的不同濃度青春雙歧桿菌ATCC15703培養物與不同濃度大腸桿菌ATCC25922培養物混合樣品提取的DNA進行實時熒光PCR擴增，每個混合樣品重復3 次，計算Ct值的標準偏差。純基因組DNA水平是將提取的青春雙歧桿菌ATCC15703 DNA溶液稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL，在分別添加300 pg、3 ng和30 ng的大腸桿菌ATCC25922 DNA，對制備的混合DNA模板進行實時熒光PCR擴增，每個混合樣品重復3 次，計算Ct值的標準偏差。

1.3.8實際樣品檢測

對收集購買的標注含有“雙歧桿菌”成分的25 份實際樣品進行測試。每個樣品取樣2 份，提取DNA后采用細菌通用引物、雙歧桿菌屬通用引物以及建立的雙歧桿菌檢測引物和探針進行擴增，每個樣品重復擴增2 次。用細菌通用引物進行擴增是為了確保DNA的有效提取，避免假陰性出現。

2　結果與分析

2.1檢測方法的特異性

如圖1A所示，所有雙歧桿菌類樣品均產生顯著的熒光增幅，Ct值介于10～16之間；而以其他近緣乳酸菌以及常見食源致病菌樣品DNA為模板均無熒光擴增信號（圖1B），采用細菌通用引物對所有樣品進行擴增，均可見目的條帶（數據未在此呈現）。因此，建立的實時熒光PCR檢測方法特異于雙歧桿菌屬檢測。

圖1　實時熒光PCR檢測的特異性測試Fig.1　Specificity of the real-time PCR method

2.2檢測方法的靈敏度

2.2.1實時熒光PCR的絕對靈敏度

表2　實時熒光PCR檢測的絕對靈敏度Table2　Absolute limit of detection （LOD） of the real-time PCR method

如表2所示，兩歧雙歧桿菌ATCC25921、青春雙歧桿菌ATCC15703、短雙歧桿菌ATCC15700和乳雙歧桿菌HN019樣品可穩定檢出的最低質量濃度為0.000 5 ng/μL，即檢測下限為1 pg（模板為2 μL）。動物雙歧桿菌BB-12、乳雙歧桿菌Bi-07、長雙歧桿菌ATCC15707和嬰兒雙歧桿菌ATCC15697樣品可穩定檢出的最低質量濃度為0.001 ng/μL，即檢測下限為2 pg。綜合8 株雙歧桿菌的檢測結果，本研究建立的實時熒光PCR體系的絕對靈敏度可達到2 pg。

2.2.2實時熒光PCR的相對靈敏度

表3　實時熒光PCR檢測的相對靈敏度Table3　Relative LOD of the real-time PCR method

相對靈敏度測試用純牛乳作為稀釋基質，按照10 倍稀釋方法將青春雙歧桿菌ATCC15703、長雙歧桿菌ATCC15707培養物稀釋到108～101CFU/mL，各濃度取1 mL提取DNA后測定可以穩定擴增的最低濃度，結果如表3所示。當青春雙歧桿菌和長雙歧桿菌混入牛乳中時可以穩定檢出的最低濃度為104CFU/mL。綜合上述結果，本研究建立的實時熒光PCR體系的相對靈敏度可達到104CFU/mL。

2.3檢測方法的重復性

表4　實時熒光PCR重復性Table4　Repeatability of the real-time PCR method

如表4所示，動物雙歧桿菌BB-12樣品5 個質量濃度樣品的Ct值的標準偏差在0.02～0.18之間，相對標準偏差在0.09%～0.66%之間；乳雙歧桿菌Bi-07樣品各質量濃度DNA擴增Ct值的標準偏差在0.07～0.20之間，相對標準偏差在0.40%～0.74%之間，均小于1%，在可接受范圍內；其他6 株雙歧桿菌重復性檢測結果與動物雙歧桿菌BB-12和乳雙歧桿菌Bi-07一致（數據未在此呈現），因此，建立的實時熒光PCR檢測體系具有較好的重復性。

2.4實時熒光PCR體系抗干擾能力

表5　實時熒光PCR體系培養物水平抗干擾能力Table5　Anti-disturbance ability of the real-time PCR method at the culture level

在實際的微生態制劑檢測中，檢測對象往往不是單一菌株，而是目標菌和雜菌的混合物，因此在培養物水平和純基因組DNA水平上對建立的熒光定量PCR體系進行抗干擾實驗。培養物水平實驗結果（表5）表明：存在102CFU/mL和106CFU/mL大腸桿菌ATCC25922的條件下，該熒光PCR反應體系對雙歧桿菌的檢測靈敏度未受顯著影響，檢出限仍維持在1×104CFU/mL；不同濃度青春雙歧桿菌ATCC15703培養物，分別添加102CFU/mL和106CFU/mL大腸桿菌，對檢出Ct值無顯著影響，均不影響雙歧桿菌的檢出。

表6　實時熒光PCR體系純基因組DNA水平抗干擾能力Table 6 Anti-disturbance ability of the real-time PCR method at the level of the genome

純基因組DNA水平實驗結果（表6）表明：不同濃度青春雙歧桿菌ATCC15703 DNA，分別添加300 pg、3 ng和30 ng大腸桿菌ATCC25922 DNA，各質量濃度水平DNA檢出Ct值未受顯出影響，均不影響雙歧桿菌的檢出。

2.5實際樣品的測定結果

圖2　實際測試樣品DNA的PCR擴增結果Fig.2　PCR results for 25 commercial samples

對25 份市售實際樣品測定結果表明，所有樣品采用細菌通用引物時均可擴增出目的條帶（圖2A），表明所有樣品都成功提出適合擴增的DNA；采用雙歧桿菌屬16S rDNA tuf基因引物可在除1、7、8、9、11號樣品為模板的擴增中出現目的條帶（圖2B），表明1、7、8、9、11號樣品中沒有檢測出雙歧桿菌。

表7　實際樣品實時熒光PCR檢測結果Table7　Results of real-time PCR detection of commercial products

采用建立的雙歧桿菌實時熒光PCR方法進行擴增時（表7），在1、7、8、9、11號樣品中沒有顯著的熒光信號，即無陽性擴增曲線；表明上述5 個樣品未檢出雙歧桿菌成分。這一結果與雙歧桿菌屬普通PCR檢測結果一致。

3　討 論

添加雙歧桿菌的食品作為重要的益生菌制劑越來越受到消費者的重視。衛生部曾發布發酵乳等含益生菌食品安全國家標準，標準中只規定益生菌限量不小于1×106CFU/g（mL）［23］。目前對于益生菌菌種、菌株的檢測鑒定缺乏相應的標準。在市場上，通常宣稱“添加”了雙歧桿菌的食品，比普通乳酸菌食品售價要高出1～3 倍。受利益驅使，我國益生菌制劑魚龍混雜，核心的菌株依賴進口。

GB 4789.34—2012《食品微生物學檢驗：雙歧桿菌的鑒定》規定了雙歧桿菌的檢驗鑒定，該標準利用傳統培養基進行細菌形態和生化鑒定，并結合氣相色譜法測定雙歧桿菌的有機酸代謝產物，但此方法耗時耗力，難以在實際檢測中推廣［24］。近年來，基于分子生物學的多種手段已被用于雙歧桿菌菌株鑒定，Sheu等［22］根據雙歧桿菌16S rDNA tuf基因設計通用引物，采用普通PCR方法檢測食品中雙歧桿菌，但普通PCR法操作繁瑣，不適用于大批量產品快速檢測；吳燕濤等［25］利用實時熒光定量PCR法測定發酵乳中雙歧桿菌數量，但沒有對方法的特異性、靈敏度及重復性做進一步研究。

基于此，本研究利用雙歧桿菌屬16S rRNA基因保守區建立了實時熒光PCR方法用于檢測食品中雙歧桿菌成分。經實驗室的全面測試，建立的檢測方法特異于雙歧桿菌屬的檢測，且具有很好的重復性；檢測方法可穩定檢測到的DNA量可達到2 pg，相對靈敏度為104CFU/mL雙歧桿菌成分；且建立的熒光PCR方法在培養物水平和純基因組DNA水平都有很強的抗干擾能力，可以滿足日常檢測的要求。對市售實際樣品的檢測結果表明，25 份樣品有5 份未檢出雙歧桿菌成分，表明存在不按照產品標識添加益生菌的可能性。

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Identification of Bifi dobacterium Strains in Foods by Real-Time PCR

XIAO Qisheng1,2, YANG Jielin2, YANG Huiqin2, DING Zhuoping1, HE Yuping2,*
（1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Shanghai Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China）

A real-time PCR method was developed to identify Bifi dobacterium in foods. Specifi c primers and probes targeting the conserved region of the 16S rRNA gene of Bifi dobacterium were designed. The specifi city, sensitivity, reproducibility and system anti-interference ability of the proposed method were verifi ed. Twenty-fi ve commercial products labeled “containing Bifidobacterium” were tested by the real-time fluorescence PCR assay. Results showed that the developed method was highly specifi c for Bifi dobacterium detection. The detection limits were 2 pg using eight species of Bifi dobacterium as the templates, and the relative detection limits were 104CFU/mL. Standard deviations and relative standard deviations （RSDs）of Ct values for fi ve DNA concentrations were all in the acceptable range. The Ct values were not affected by a mixture of Bifi dobacterium adolescentis ATCC15703 and Escherichia coli ATCC25922 at both the culture level and genomic DNA level, which showed that the fluorescence PCR method has good anti-interference ability. Five samples were detected without Bifi dobacterium. Thus, considering its high specifi city, sensitivity and repeatability, the real-time PCR could be used to rapidly and accurately identify Bifi dobacterium in foods.

real-time polymerase chain reaction （RT-PCR）； Bifi dobacterium； 16S ribosomal RNA； identifi cation

10.7506/spkx1002-6630-201620030

TS207.4

A

1002-6630（2016）20-0177-06

肖其勝, 楊捷琳 楊惠琴, 等. 實時熒光PCR法鑒定食品中雙歧桿菌［J］. 食品科學, 2016, 37（20）： 177-182. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201620030. http：//www.spkx.net.cn

XIAO Qisheng, YANG Jielin, YANG Huiqin, et al. Identification of Bifidobacterium strains in foods by real-time PCR［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 177-182. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620030. http：//www.spkx.net.cn

2016-01-26

上海市科委長三角聯合科技攻關項目（14495810200）；國家質檢總局項目（2015IK227）

肖其勝（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品營養與安全。E-mail：xiaoqsheng@163.com

何宇平（1964—），男，研究員，本科，研究方向為食品質量與安全。E-mail：heyuping@shciq.gov.cn