人工髖關節假體無菌性松動滑膜中TLR4及TLR5的表達分析

閆威

人工髖關節假體無菌性松動滑膜中TLR4及TLR5的表達分析

閆威

目的 觀察人工髖關節假體無菌性松動時，滑膜中Toll樣受體4（TLR4）、Toll樣受體5（TLR5）表達變化及其臨床意義。方法 21例人工髖關節假體無菌性松動（觀察組）及同期30例股骨頸骨折患者（對照組）入選本研究，采取免疫組織化學法測定滑膜TLR4及TLR5表達水平，分析TLR4及TLR5表達水平與無菌性松動之間的相關性。結果 兩組髖關節滑膜中均有TLR4和TLR5表達，而觀察組的表達陽性率及表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05）。兩組TLR4表達水平均高于TLR5（P＜0.05）。結論 人工髖關節假體無菌性松動時，滑膜中TLR4和TLR5表達水平均顯著升高，其水平變化與無菌性松動發生具有密切關聯。

人工髖關節；無菌性松動；滑膜；Toll受體；

人工髖關節置換術臨床較為常見，該手術能夠緩解、消除患者疼痛及重建關節功能，并對提高患者生活質量具有重要意義［1］。調查研究表明［2］，目前世界范圍內每年約50余萬患者接受人工關節置換或翻修手術治療。有文獻報道［3］，髖關節置換術雖經快速發展，取得較佳效果，但其遠期并發癥逐漸受到臨床重視。人工髖關節無菌性松動為影響髖關節置換術遠期療效的重要負面因素之一，但其發病機制尚未明確。有研究報道［4］，Toll樣受體（TLR）對啟動及調節機體免疫及誘導獲得性免疫過程具有重要作用，本研究旨在探討TLR4及TLR5水平變化與無菌性假體松動之間的關系。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選擇本院于2011年1月～2015年1月收治的因人工髖關節假體無菌性松動需行翻修手術治療患者21例（觀察組）及同期股骨頸骨折患者30例（對照組）入選本研究，均經患者及家屬知情同意，且得到醫院倫理委員會批準。觀察組中，男13例，女8例，年齡49～78（56.8±9.5）歲；左側11例，右側10例。對照組中，男18例，女12例，年齡45～75（54.3±10.2）歲；左側16例，右側14例。兩組年齡、性別構成等均無統計學差異（P＞0.05）。

1.2 納入及排除標準 納入標準：患者年齡≥18歲，且＜80歲；均符合人工髖關節假體無菌性松動診斷標準［5］；術中所切除標本HE染色后經病理診斷為類似于纖維瘢痕樣的滑膜組織；人工髖關節假體周圍組織經切片后，中性白細胞數目＞5個/高倍視野。排除標準：合并先天性心臟病、嚴重肝腎功能不全或者其他重大疾病不能耐受手術者；合并類風濕關節炎患者、自身免疫性疾病及腫瘤患者。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 觀察組取翻修術中切除的假體周圍滑膜組織為檢測標本，對照組取人工髖關節置換術中切除的髖關節滑膜組織為檢測標本，新鮮標本均經甲醛固定，然后脫水、透明、石蠟包埋固定，連續切片、編號。

1.3.2 免疫組織化學染色 將標本切片于60℃烤箱中過夜后，置于二甲苯浸泡20min，乙醇梯度脫水，PBS液漂洗3min×3次。放入滅活內源性過氧化物酶+30%雙氧水+9份蒸餾水中浸泡10min，蒸餾水漂洗3次。將切片置于抗原修復緩沖液5～10min，滴加5%BSA封閉液，置于37℃恒溫箱30min。滴加一抗孵育，置于4℃冰箱過夜。復溫20 min，使用PBS液清洗20 min×2次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，置于37℃下30 min，使用PBS清洗20 min×2次。滴加SABC孵育，再應用PBS清洗30min×3次。使用DAB顯色試劑盒顯色。將標本置于蘇木素5min，再沖洗，置于75%鹽酸酒精溶液30 s。經70%、80%、90%、95%乙醇、無水乙醇，各5 min，置于二甲苯10min。切片風干后滴中性樹脂蓋片，置于鏡下觀察。每種抗體均設置陽性對照及陰性對照組。

1.4 結果判定標準

1.4.1 TLR4及TLR5陽性判定標準［6］顯微鏡10×40倍視野下，每張切片隨機選擇5個非重疊視野進行觀察，染色顆粒主要位于細胞質或者細胞膜，其中，細胞未著色即陰性（-）；染色陽性細胞占視野炎性細胞0～25%為弱陽性 （+）；陽性細胞占25%～50%為陽性（++）；陽性細胞所占比例＞50%為強陽性（+++）［7］。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，采取成組設計兩樣本比較的秩和檢驗比較兩組TLR4及TLR5表達水平，并應用Spearman等級相關分析TLR4及TLR5表達之間相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組TLR4表達情況比較 兩組髖關節滑膜均有TLR4表達，其中對照組主要見于血管內皮細胞及滑膜表層細胞，觀察組主要見于滑膜表層細胞及巨噬細胞，少量成纖維細胞及血管內皮細胞也可見表達；觀察組TLR4表達陽性強度顯著高于對照組（P＜0.05，表1）。

表1　兩組TLR4表達情況比較［n（%）］

2.2 兩組TLR5表達情況比較 對照組髖關節滑膜中，TLR5主要表達于血管內皮細胞及滑膜表層細胞，且陽性程度較弱；觀察組假體周圍均有TLR5表達，主要見于巨噬細胞、成纖維細胞及血管內皮細胞；觀察組TLR5表達陽性強度顯著高于對照組（P＜0.05，表2）。

表2　兩組TLR5表達情況比較［n（%）］

2.3 兩組TLR4及TLR5表達比較 觀察組TLR4及TLR5表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05）。另外，兩組TLR4表達水平均高于TLR5（P＜0.05），見表3。

表3　兩組TLR4及TLR5表達水平比較

3 討論

髖關節置換為臨床重要手術之一，隨著臨床研究深入，其遠期療效及壽命問題逐漸受到臨床重視。研究報道［8］，目前超過70%需行髖關節翻修術原因為假體松動造成，假體松動已成為制約人工假體壽命的重要制約因素。正因如此，研究假體松動發生機制、原因具有重要臨床價值。

目前，假體松動發生機制并未闡明，有文獻報道［9］，部分患者發生假體松動常伴有假體周圍骨溶解，此可能為假體松動發生的直接原因之一。研究表明［10］，巨噬細胞在假體松動過程中參與了骨溶解，此可能為機制之一。Toll樣受體與其配體結合，可經過一系列信號轉導，導致NF-κB表達增強，進而導致具有溶骨作用的腫瘤壞死因子、白細胞介素等細胞因子大量釋放。Toll樣受體首先于果蠅上發現，可經復雜信號轉導參與細胞因子合成及分泌，進而激活宿主防御機制，發揮抗真菌感染作用［11］。相關研究表明［12］，Toll樣受體表達于單核巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞，其識別并結合后可致下游信號及轉錄因子激活，進而誘導抗生物分子及化學趨化因子、細胞因子表達，發揮作用。本研究測定假體松動患者髖關節周圍組織TLR4及TLR5水平，結果表明均顯著升高（P＜0.05），表明TLR4及TLR5表達上調與假體無菌性松動具有密切關聯。有研究報道［13］，TLR4與透明質酸信號及透明質酸誘導的炎性反應具有密切關聯，此可能與其參與假體松動機制之一。

TLR4主要配體為LPS，而LPS為致感染性休克的常見激活劑之一。已有研究表明［14］，LPS對磨損顆粒具有高度親和力，可引起炎癥反應。本研究進一步分析假體松動組TLR4及TLR5表達水平，結果TLR4顯著高于TLR5表達水平，但二者之間并無明顯相關性，可能TLR4及TLR5通過不同通路參與假體無菌性松動。

總之，人工髖關節假體無菌性松動時，滑膜中TLR4及TLR5表達水平顯著升高，其水平變化與無菌性松動發生具有密切關聯。

［1］Amstutz HC，Le Duff MJ.Aseptic loosening of cobalt chromium monoblock sockets after hip resurfacing［J］.Hip Int，2015，29（7）：110-113.

［2］Voort PV，Pijls BG，Nieuwenhuijse MJ，et al.Early subsidence of shape-closed hip arthroplasty stems is associated with late revision［J］.Acta Orthop，2015，24（11）：1-11.

［3］Abele JT，Swami VG，Russell G，et al.The accuracy of single photon emission computed tomography/computed tomography arthrography in evaluating aseptic loosening of hip and knee prostheses［J］.JArthroplasty，2015，31（21）：98-103.

［4］Ryu KJ.Corr insights：what host factors affect aseptic loosening after THA and TKA［J］？Clin Orthop Relat Res，2015，14（11）：95-99.

［5］Tomankova T，KriegováE，Fillerova R，et al.Low expression of Tlr-1，-2，-4 a il-2，-2r，-10，-10r and TgFb1 in pseudosynovial tissue collected at revision total knee arthroplasty for aseptic loosening［J］.Acta Chir Orthop Traumatol Cech，2015，82（1）：67-75.

［6］Wang FD，Gao YZ，Yuan W，et al.Augmentative locking compression plate （LCP）combined with bone graft for the treatment of aseptic femoral shaft nonunion after intramedullary nailing［J］.Zhong guo Gu Shang，2014，27（10）：815-818.

［7］Ding Y，Qiu Y，Zou L，et al.Three conserved MyD88-recruiting TLR residues exert different effects on the human TLR4 signaling pathway［J］.Immunol Res，2015，7（9）：1185-1189.

［8］Zhu YX，Wang XB，Wang J，et al.Influence of TLR2-and TLR4-activated mesenchymal stem cells on migration of cord blood CD34（+）cells［J］.Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2015，23（2）：512-516.

［9］Wang W，Yuan HY，Liu GM，et al.Escherichia coli maltose-binding protein induces M1 polarity of RAW264.7 macrophage cells via a TLR2-and TLR4-dependent manner［J］. Int JMol Sci，2015，16（5）：9896-9909.

［10］Yang H，Li J，Wang Y，et al.Role of CD14 and TLR4 in type I，type Ⅲ collagen expression，synthesis and secretion in LPS-induced normal human skin fibroblasts［J］.Int JClin Exp Med，2015，8（2）：2429-2434.

［11］Wang C，Sun H，Song Y.Pterostilbene attenuates inflammation in rat heart subjected to ischemia-reperfusion：role of TLR4/NF-κB signaling pathway［J］.Int JClin Exp Med，2015，8（2）：1737-1746.

［12］Rashidi N， Mirahmadian M， Jeddi-Tehrani M，et al. Lipopolysaccharide- and lipoteichoic acid-mediated proinflammatory cytokine production and modulation of TLR2，TLR4 and MyD88 expression in human endometrial cells［J］.JReprod Infertil，2015，16（2）：72-81.

［13］Tahoun A，Jensen K，Corripio-Miyar Y，et al.Functional analysis of bovine TLR5 and association with IgA responses of cattle following systemic immunisation with H7 flagella［J］.Vet Res，2015，46（1）：9-12.

［14］Meena NK，Ahuja V，Meena K，et al.Association of TLR5 gene polymorphisms in ulcerative colitis patients of north India and their role in cytokine homeostasis［J］.PLoSOne，2015，10（3）：15-21.

Analysis of expression of TLR4 and TLR5 in aseptic loosened synovium of artificial hip prosthesis

Yan Wei
Departmentof Orthopaedics，Nanzhang People′s Hospital，Nanzhang，Hubei，441500，China

Objective To observe the changes in the expression of TLR4 and TLR5 in aseptic loosened synovium of artificial hip prosthesis and the clinical significance of the changes.Methods 21 patientswith aseptic loosening of artificial hip prosthesis（the observation group）and 30 patients with femoral neck fracture in the corresponding period （the control group）were enrolled in this study.The expression levels of TLR4 and TLR5 in the two groups were determined by immunohistochemicalmethod to analyze the correlation between the expression levels and aseptic loosening.Results There was expression of TLR4 and TLR5 in hip joint synovium.The positive expression rate and expression levels in the observation group were much higher than those in the control group（P＜0.05）.The expression levels of TLR4 in the two groups were higher than those of TLR5（P＜0.05）.Conclusion The expression levels of TLR4 and TLR5 in aseptic loosening of artificial hip prosthesis aremuch higher，and changes in the levels are closely related to the aseptic loosening.

artificial hip prosthesis；aseptic loosening；synovium；toll-like receptor

R 687.4

A

1004-0188（2016）10-1102-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.10.004

2016-04-07）

441500湖北 南漳，南漳縣人民醫院骨科