全自動固相萃取-高效液相色譜法同時測定飲用水中3種微囊藻毒素

徐瀟穎,劉　柱,梁晶晶,周　霞,羅金文

(浙江省食品藥品檢驗研究院,浙江杭州 310052)

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全自動固相萃取-高效液相色譜法同時測定飲用水中3種微囊藻毒素

徐瀟穎,劉柱,梁晶晶,周霞,羅金文*

(浙江省食品藥品檢驗研究院,浙江杭州 310052)

建立全自動固相萃取-高效液相色譜法同時測定飲用水中3種微囊藻毒素的方法。采用全自動固相萃取儀代替傳統的前處理方式,對大體積水樣進行富集,以KH2PO4(pH=3.0)-甲醇(43∶57,v∶v)為流動相,采用二極管陣列檢測器進行檢測,結果3種微囊藻毒素在0.1～10.0 μg/mL范圍內線性關系良好,相關系數r2≥0.999,3種不同微囊藻毒素的檢出限均可達到0.05 μg/L(S/N=3),加標回收率在86.3%～99.7%范圍內,標準偏差為1.70%～2.72%(n=6),該方法用于測定飲用水中3種微囊藻毒素具有操作簡單、快速,精密度高、準確可靠等特點。

全自動固相萃取,微囊藻毒素YR,微囊藻毒素LR,微囊藻毒素RR,飲用水

由于水體富營養化及污染問題日益嚴重,導致藍藻水華頻發,隨之產生的微囊藻毒素污染問題也日益受到重視。微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是藍藻釋放的有毒代謝物[1-2],現今已發現不同的微囊藻毒素同分異構體共60余種,其中MC-RR,MC-LR,MC-YR最為常見,該類毒素毒性很強,主要對哺乳動物的肝臟產生損害[3]。世界衛生組織在其推薦的飲用水標準指導中也增加了微囊藻毒素(MC-LR,1 μg/L),而國內現行《生活飲用水衛生規范》和《地表水環境質量標準》中也規定微囊藻毒素LR≤0.001 mg/L[4]。

目前用于檢測水體及藍藻中微囊藻毒素的方法有酶聯免疫法(ELISA)[5]、蛋白磷酸酶抑制法(PPIA)[6]、生物分析法[7],以及常用的高效液相色譜法[8-9]和液相色譜質譜聯用法[10]。在采用高效液相色譜法和液相色譜質譜聯用法對水體中微囊藻毒素進行測定的過程中,由于微囊藻毒素在飲用水中的殘留量低,水樣體積大,前期富集大多存在費時費力或消耗大量有機溶劑等缺點,除馮桂學[11]等進行了簡化前處理研究外,他人尚無研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

飲用水市售;MC-LR,MC-YR,MC-RR標準品(純度≥95%)美國Enzo公司;甲醇(色譜純)德國Merck公司;實驗所用其它試劑均為分析純,北京化學試劑公司。

表1　全自動固相萃取儀富集洗脫條件

高效液相色譜儀Agilent 1260型,配備二極管陣列(DAD)檢測器,Aglient化學工作站;全自動固相萃取儀(Fotector plus)Reeko;Milli-Q純水儀密里博。

1.2實驗方法

1.2.1全自動固相萃取儀富集條件采用全自動固相萃取儀設定洗脫程序,利用HLB固相萃取柱(Waters,500 mg,6 mL)按表1進行富集洗脫程序設定,對500 mL水樣進行前處理富集。

1.2.2色譜條件色譜柱:Shim-pack VP-ODS C18(250×4.6 nm,5 μm);柱溫:40 ℃;檢測器:二極管陣列;檢測波長:238 nm;進樣量:10 μL;流速:0.9 mL/min;流動相條件1(等度洗脫):KH2PO4緩沖溶液∶甲醇=43∶57;流動相條件2(等度洗脫):乙腈∶水(0.04% TFA)=38∶62;流動相條件3(等度洗脫):乙腈∶水(0.04% TFA)=40∶60。

1.2.3標準曲線繪制將MC-LR、MC-YR、MC-RR標準品各0.1 mg分別用甲醇定容至5.0 mL,配制成20 μg/mL的標準儲備液,于-20 ℃保存。用甲醇配制濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的混合標準溶液。以儀器響應的峰面積Y對應濃度X(μg/mL)進行線性回歸。

1.2.4樣品溶液制備樣液經過全自動固效萃取儀的富集程序后,40 ℃下氮氣吹干,用洗脫液定容至1.0 mL。用0.22 μm濾膜過濾后,待上機。

1.2.5回收率實驗對陰性樣品進行三個不同濃度水平的加標實驗,加標濃度分別為0.3、0.6、1.0 μg/L,每個濃度進行6組平行性實驗。

1.2.6精密度實驗對陰性樣品進行三倍檢出限加標測定,在0.15 μg/L濃度下進行6組平行實驗,計算標準偏差。

2　結果與討論

2.1色譜條件的選擇

據報道[12],利用高效液相色譜對微囊藻毒素進行測定,多采用甲醇∶磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)=57∶43(v/v)或乙腈∶水(0.04% TFA)=38∶62(v/v)做為流動相。本實驗分別對兩種不同流動相進行優化,結果表明:當選用乙腈/水(0.04% TFA)作為流動相時,標樣色譜圖見圖1,出峰時間短,但MC-YR和MC-RR峰中包含雜質,分離度較差。改變流動相比例為乙腈∶水(0.04% TFA)=40∶60(v/v)進行分離后,這兩種微囊藻毒素回收率偏低,見圖2。在選用甲醇∶磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)=57∶43(v/v)對三種微囊藻毒素進行分離時,三種不同的微囊藻毒素可達到有效分離,色譜圖見圖3。故優選甲醇∶磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)=57∶43(v/v)為流動相進行微囊藻毒測定。

圖1　3種微囊藻毒素標準溶液色譜圖(以乙腈∶水(0.04% TFA)=38∶62為流動相)Fig.1　Chromatogram of Mcs with ancetonitrile-water(0.04% TFA)as mobile phase

圖2　3種微囊藻毒素標準溶液色譜圖(以乙腈∶水(0.04% TFA)=40∶60為流動相)Fig.2　Chromatogram of Mcs with ancetonitrile-water(0.04% TFA)as mobile phase

2.2線性評價及檢出限

按照優化后的色譜條件對3種微囊藻毒素進行檢測,在0.1～10.0 μg/mL范圍內以儀器響應的峰面積Y對應濃度X(μg/mL)進行線性回歸,結果表明MC-RR、MC-LR、MC-YR在0.1～10.0 μg/mL范圍內線性關系良好,相關系數R2≥0.999,采用空白水樣加標的方法,以儀器信噪比(S/N=3)計算方法檢出限(LOD)可達到0.05 μg/L,結果見表2。該方法檢出限要低于吳振興等[13]利用高效液相質譜聯法獲得的1 μg/L。

表2　3種微囊藻毒素的線性方程及檢出限

圖3　3種微囊藻毒素標準溶液色譜圖(以甲醇/磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)=57∶43為流動相)Fig.3　Chromatogram of Mcs with phosphate buffer solution(pH=3.0)-methanol(57∶43)as mobile phase

2.3精密度實驗

對某品牌飲用水A(陰性樣品)進行三種微囊藻毒素的精密度測定,定量限加標濃度為0.15 μg/L,進行6組平行實驗,測定結果見表3。從表3中可看出,3種微囊藻毒素的測定結果相對標準偏差在1.70%～2.72%,表明采用全自動固相萃取儀進行富集,各水平下測定值均呈現良好的穩定性,該方法具有較高的精密度,且平行性較好。

表3　3種微囊藻毒素精密度實驗結果(n=6)

2.4回收實驗

對某品牌飲用水A(陰性樣品)進行不同水平的加標回收實驗,加標濃度分別為0.3、0.6、1.0 μg/L,每一濃度進行6組平行實驗,結果見表4,除MC-RR在0.3 μg/L濃度下回收率為86.3%外,其余加標水平的回收率在91.1%～99.7%,說明該方法具有良好的準確性。

表4　回收實驗結果(n=6)

表5　樣品測定結果

注:ND即視為低于檢出限0.05 μg/L。

2.5實際樣品測定

按照本方法對市售5個品牌飲用水A,B,C,D,E進行微囊藻毒素的測定,測定結果見表5。其中一個品牌飲用水中檢出MC-YR,為陽性樣品,而該指標在現行國標中并未做出規定。

3　結論

實驗采用全自動固相萃取儀代替傳統的人工過柱,相對于傳統的前處理方法,該方法在設定洗脫程序的流速后,可達到儀器的全自動化,通過6個相對獨立蠕動泵可同時進行6個樣品的富集。大大縮短了洗脫時間,提高了洗脫效率,控制了洗脫速度,減小了由前處理造成的實驗誤差。通過不同水平的加標實驗,發現3種微囊藻毒素在0.1～10.0 μg/mL范圍內呈現良好的線性關系,相關系數r2≥0.999,3種不同微囊藻毒素的檢出限均可達到0.05 μg/L,精密度實驗中獲得標準偏差在1.70%～2.72%之間,加標回收率在86.3%～99.7%范圍內,證明本實驗方法可達到飲用水中微囊藻毒素的檢測準確度和精確度。

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Determination of three microcystins in drinking water by automatic-SPE and HPLC

XU Xiao-ying,LIU Zhu,LIANG Jing-jing,ZHOU Xia,LOU Jin-wen*

(Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310052,China)

Three microcystins were determined by automatic solid phase extraction(SPE)and high performance liquid chromatography(HPLC)in this study. Instead of the traditional pretreatment methods,Reeko automatic-SPE system was used for a fast enrichment process. Samples were chromatographed isocratically using a KH2PO4(pH3.0)buffer solution-methanol mobile phase on a C18column in-line by diode array detector. Good linear relation were presented in the range of 0.1～10.0 μg/mL for all microcystins with the correlation coefficientsR2≥0.999. The detection limits of three microcystins were 0.05 μg/L(S/N=3).Recoveries of these microcystins at three different concentration levels were studied. The recoveries of this method were 86.3%～99.7% with a good relative standard deviations of 1.70%～2.72%(n=6). This method was easy,fast and accurate and suitable for a rapid determination of microcystins in drinking water.

automatic-SPE;microcystin(YR);microcystin(LR);microcystin(RR);drinking water

2016-02-17

徐瀟穎(1989-)，女，碩士，助理工程師，研究方向：食品安全與分析技術，E-mail:net_easexxy@126.com。

羅金文(1974-)，男，碩士，高級藥師，研究方向：食品安全與分析技術，E-mail:luojw31@163.com。

浙江省科學技術廳重大科技專項重大農業項目(2014C02001)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)18-0060-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.003