離子色譜-氫化物發生-原子熒光光譜(IC-HG-AFS)聯用技術檢測膠州灣海產品中硒的賦存形態

韓婷婷,崔　鶴,宋　田,姬泓巍,李慧新,朱倩林,蔡　峰,張　濤

(1.中國海洋大學化學化工學院,山東青島 266100;2.山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,山東青島 266002;3.燕山大學理學院,河北秦皇島 066004)

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離子色譜-氫化物發生-原子熒光光譜(IC-HG-AFS)聯用技術檢測膠州灣海產品中硒的賦存形態

韓婷婷1,2,崔鶴2,*,宋田3,姬泓巍1,李慧新2,朱倩林1,蔡峰2,張濤2

(1.中國海洋大學化學化工學院,山東青島 266100;2.山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,山東青島 266002;3.燕山大學理學院,河北秦皇島 066004)

建立了離子色譜-氫化物發生-原子熒光光譜聯用技術(IC-HG-AFS)測定膠州灣海產品中4種硒形態的方法。研究了色譜柱、流動相、提取劑、提取溫度及其儀器條件等對硒熒光信號值的影響。試樣用1.5 mol/L的氫氧化鉀溶液作提取液,采用AS11-HC(250 mm×4.1 mm,5.0 μm)陰離子色譜柱,20 mmol/L碳酸氫鈉溶液/2%乙腈為流動相,1.0 mL/min流速,可在8 min內同時分離檢測硒代胱氨酸(SeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、亞硒酸根Se(Ⅳ)和硒酸根Se(Ⅵ)。當4種形態的質量濃度范圍為 0～100 μg/L時,各形態均得到良好的線性關系,線性相關系數均大于0.996,各形態的檢出限分別為SeCys 1. 53 μg/L,SeMet 1.72 μg/L,Se(Ⅳ)0.30 μg/L,Se(Ⅵ)1.06 μg/L，相對標準偏差RSD均小5%(n=6),在最佳條件下,應用該方法測定了水產品中的硒形態,4種硒形態化合物加標回收率在86.1%～105.3%之間。該方法測定海產品中的硒形態準確、可靠、簡便靈敏,為科學有效地評價海產品質量和開展風險評估提供技術支撐。

離子色譜,氫化物發生原子熒光,膠州灣,海產品,硒形態

硒是生命活動中必須的微量元素之一,在動物體內硒蛋白含量有20多種,而海洋生物中硒蛋白含量較多[1]。硒的主要作用是參與生物體內酶的合成,其生物化學功能主要取決于硒蛋白含量,具有增強免疫力、抗衰老和預防多種疾病的作用[2],但過量攝入將會導致硒中毒。硒的形態可分為有機硒和無機硒兩大部分,有機硒存在于氨基酸結構中,主要有硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸等,這些有機硒對人體是有益的,硒代蛋氨酸是人類攝取硒元素的主要來源[3]。無機硒主要包括亞硒酸鹽和硒酸鹽,亞硒酸根毒性最強,硒酸根次之,從生物功能方面來講,Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)會導致生物體病變。因此,富硒食品尤其是對某種有機硒形態有目的的補充,對保持身體健康具有重要意義。

傳統的元素分析技術主要有電分析法、光譜分析法和色譜分析法[4]。電分析法由于耗時耗力,極易引入污染而限制了其應用。光譜分析法分為分子光譜法和原子光譜法,該方法是分子中價電子在基態-激發態之間躍遷吸收或釋放特定的電離能實現待測物質的檢測,在形態分析方面應用較為廣泛。色譜分析法按照流動相的狀態可分為液相色譜、氣相色譜和質譜,在色譜技術發展過程中色譜分析法著重解決元素分離問題,而大多數元素的化合形態并不能用色譜檢測器得到較高靈敏度[5]。因此,色譜技術單獨作為分離技術與其他高靈敏度的檢測器聯用成為元素形態分析發展的新趨勢。

聯用技術集高效分離與高靈敏度檢測技術于一體,目前已有的聯機類型主要有IC-ICP-MS、HPLC-AFS、HPLC-OES等,其中離子色譜與高效液相色譜相比在流動相的使用上具有更加環保、污染低的優勢,且試用范圍更為廣泛。原子熒光光譜儀憑借其成本低、檢出限低、靈敏度高等優勢而被廣泛應用[6-9],故本文選擇IC-AFS聯機技術來測海產品中硒形態。對于硒形態的研究就前處理方面多采用Tris-HCl、酸、酶等提取劑,但由于酸具有腐蝕性、Tris-HCl的致癌性、酶的提取效率對有機硒更準確對無機硒提取一般等缺陷[10-13],建立一個成熟、準確、有效的硒形態的分析方法已成為迫切需求。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

舌頭魚、扇貝、海帶、海紅、黃尖子魚、秋刀魚、帶魚、鲅魚、蝦、墨魚、章魚、鯖魚均為青島膠州灣不同季節海產品;硝酸(GR)、鹽酸(GR)、乙酸(AR)、硼氫化鉀(AR)、碘化鉀(GR)、氫氧化鉀(AR)、碳酸氫鈉(AR)均購買自國藥集團藥業股份有限公司;乙腈HPLC,德國默克公司;硒酸根標準溶液物質(GBW10033)、亞硒酸根標準溶液物質(GBW10032)、硒代蛋氨酸標準溶液物質(GBW10034)、硒代胱氨酸標準溶液物質(GBW08669)均購買自中國計量科學研究院;水為重蒸水(Millipore裝置純化后使用);0.22 μm微孔濾膜天津科技發展有限公司。

AFS-9130型原子熒光光譜北京吉天儀器有限公司;SA-20型原子熒光形態分析儀北京吉天儀器有限公司;CIC-160型離子色譜儀青島盛瀚色譜技術有限公司;AS11自動進樣器青島盛瀚色譜技術有限公司;Milli-Q去離子水制備裝置賽默飛世爾科技公司;AS11-HC分離柱賽默飛世爾科技公司;AG11-HC保護柱賽默飛世爾科技公司;原子熒光空心陰極燈;MS 3 basic混旋儀IKA集團;Terminal 740(pH電極,SenTix-41);散射式渾濁度儀德國WTW公司;KQ-500DE型數控超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司;TGL-20B離心機上海安亭科學儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1離子色譜條件色譜柱為AS11-HC分離柱(250 mm×4.1 mm,5.0 μm);流動相為20 mmol/L碳酸氫鈉溶液/2%乙腈;流速為1.0 mL/min;25 μL定量環。

1.2.2氫化物發生條件載流:8% HNO3溶液;氧化劑:3.5 g/L KOH和1.5 g/L KI;還原劑:3.5 g/L KOH和20 g/L KBH4;間隔氣:空氣;泵速:80 r/min;紫外燈(UV):開。

1.2.3AFS的儀器參數硒燈總電流:90 mA;光電倍增管負高壓:300 V;屏蔽氣流量:800 mL/min;載氣流量:400 mL/min。

1.2.4標準溶液的制備Se(IV)、Se(VI)、SeCys、SeMet標準儲備液均為2 mL,分別移取相應量的4種標準儲備液稀釋得到2 mg/L的混合標準溶液儲備液,放置于4 ℃冰箱中保存備用。分別取2 mg/L的混合標準逐級稀釋成5.0、20、40、80、100 μg/L的標準使用液,現配現用。

1.2.5前處理方法稱取經粉碎混合均勻的樣品1.00 g(精確至0.001 g)于50 mL離心管中,加入10 mL 1.5 mol/L氫氧化鉀溶液,渦旋振蕩混勻后,70 ℃超聲1.5 h,靜置冷卻后加入甲酸調節pH=12～13,加水定容至25 mL,5000 r/min離心10 min,上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾,待上機測定。

1.2.6提取率的計算提取率(%)=試樣經恒溫超聲浸提1.5 h各種形態硒含量的總和/現行國標試樣經酸消解后測得的總硒含量的比值×100[14]。

2　結果與討論

2.1色譜條件選擇

2.1.1色譜柱的選擇實驗過程中分別對Agilent ZORBAX SB-C8液相柱、Hamilton PRP-X100液相柱以及AS11-HC色譜柱的分離效果進行了探索,其中Agilent ZORBAX SB-C8色譜柱,以二次水做流動相Se(Ⅳ)、SeCys、Se(Ⅵ)在6 min內可全部出峰,SeMet未出峰,后用磷酸氫二銨/1 mol/L十六烷基三甲基溴化銨/2%乙腈作流動相,并調節其pH,但SeMet仍未出峰。用Hamilton PRP-X100色譜柱,以30 mmol/L磷酸二氫銨為流動相SeCys、Se(Ⅵ)將出現重疊現象,當調節流動相pH=6時,Se(Ⅵ)的色譜峰可出現一半,分離效果不理想。最終選擇AS11-HC色譜柱,用20 mmol/L碳酸氫鈉溶液/2%乙腈做流動相,并將流動相pH調節至12～13之間,此時SeMet、Se(Ⅳ)、SeCys、Se(Ⅵ)四種形態可在7 min中內依次全部出峰(圖1),并且分離效果較好,故最終選擇AS11-HC色譜柱。

圖1　AS11-HC色譜柱分離硒形態混合標準譜圖Fig.1　Chromatogram of mix standard with AS11-HC column

2.1.2流動相的選擇在選用AS11-HC色譜柱后,分別NaOH和NaHCO3作為流動相考察了不同流動相對硒形態分離的影響。選用氫氧化鈉做流動相,4種硒形態不能完全分離,最終選擇碳酸氫鈉作為流動相,并在流動相中加入適量乙腈以提高增敏效果,改變流動相濃度(20～40 mmol/L)和流速(0.6～1.0 mL/min)來考察流動相濃度和流速對分離度和熒光信號的影響,當選用20 mmol/L碳酸氫鈉溶液/2%乙腈并調節pH=12～13時,硒的4種形態可在7 min中內完成分離,且分離效果較好。

2.2儀器工作條件

2.2.1氧化劑載流還原劑當使用K2S2O8和KOH作為氧化劑時,不會得到Se(VI)的譜圖,當用3.5 g/L KOH和1.5 g/L KI作氧化劑時,硒的4種形態可得到完全分離。還原劑當選用3.5 g/L KOH和 20 g/L KBH4時,熒光信號較3.5 g/L KOH和 10 g/L KBH4更強(圖2),故選用20 g/L KBH4。改變載流濃度(6%,8%,10%),對于SeMet、SeCys、Se(VI)三種形態的熒光信號影響不大,但Se(IV)的熒光信號由高到低依次是8%>6%>10%,因此應選擇熒光信號較高時8%硝酸溶液作為載流以得到更高的靈敏度。

圖2　不同濃度硼氫化鉀的硒形態混合標準譜圖Fig.2　Chromatogram of mix standard with different concentration of KBH4

2.2.2載氣和屏蔽氣流速氬氣作為載氣和屏蔽氣在原子熒光檢測中是不可或缺的,氬氣的流量影響著測定效果,載氣流量小會因氬氫火焰的不穩定影響結果的重現性,載氣流量過大則會稀釋原子蒸氣,降低熒光信號。屏蔽氣的作用是保持氬氫火焰的穩定,防止原子化器中樣品氣體被空氣氧化,氣流小時信號穩定,綜合考慮,最終選擇載氣流速為400 mL/min,屏蔽氣流速為800 mL/min。

2.2.3燈電流和負高壓原子熒光元素燈電流的大小將會決定激發光源的發射強度,所以一定范圍內隨著燈電流的增加,其熒光強度也會相應增加,但燈電流太高將發生自吸效應,使基線噪聲增加,此外也將減少燈的使用壽命。現通過控制變量法對燈電流進行60、70、80、90、100 mA一系列的討論,60、70、80 mA的熒光強度較低,而100 mA的熒光強度與90 mA的熒光強度相差無幾,但100 mA的基線噪聲高,故最終選擇元素燈的燈電流為90 mA。負高壓將直接影響信號的放大倍數,隨著負高壓的加大熒光信號也將增強,但同時也會使背景和噪聲增加。因此,負高壓也需要進行討論篩選,最終將負高壓定為300 mA。

2.2.4原子化器高度原子化器高度決定了檢測時原子化器的溫度,而原子化器溫度又決定了氣態氫化物轉化為基態原子的效率。因此,原子化器越高轉化效率越高,但相應的檢出限會越低。實驗通過將原子化器高度進行7、8、9、10 mm一系列的調節,當調節至9、10 mm時雖然穩定性高,基線噪聲小,但檢出限也相應降低,對于硒微量元素而言,將會直接影響樣品的檢測。當為7 mm時的譜圖背景和噪聲已超出檢測所能承受的范圍,故將原子化器高度定至8 mm。

2.2.5蠕動泵轉速泵速的改變會使經色譜柱分離后的硒與還原劑、載流和氧化劑反應的速度發生改變,選取蠕動泵速60、70、80、90 r/min來考察其對結果的影響。泵速越大,氫化反應越完全,其靈敏度也越高,但太大將會使反應不完全,當泵速為90 r/min時,較80 r/min而言,其靈敏度沒有明顯的提高,且試劑消耗量也較大,容易造成試劑的浪費和環境污染,當泵速在60、70 r/min的靈敏度明顯低于80 r/min,綜合以上分析選取蠕動泵速為80 r/min。

2.3提取條件的選擇

2.3.1提取液對四種硒形態的影響分別選用二次水、1.0 mol/L氫氧化鉀溶液、1.5 mol/L氫氧化鉀溶液、5 mmol/L檸檬酸溶液、20 mmol/L乙酸銨溶液、0.1 mol/L乙酸溶液、1%鹽酸溶液、1%硝酸溶液、1.0 mol/L氫氧化鉀溶液/甲醇溶液(5∶1)9種提取液10 mL于50 mL離心管中加入1.00 g帶魚,按照前處理方法(1.2.5)進行實驗。結果見表1。

表1　不同提取液對帶魚中硒的提取率

表3　線性范圍、線性方程、相關系數和檢出限

表4　海產品硒含量及加標回收率(n=6)

由表1可知,在總硒含量均為0.26 mg/kg時加入相同量的不同提取液下,1.5 mol/L氫氧化鉀溶液在9種提取液中的提取率最高，1.0 mol/L氫氧化鉀溶液次之,少量甲醇溶液的加入并沒有得到較高的提取率,而乙酸、乙酸銨、檸檬酸的提取率比二次水還要低,故最終選擇1.5 mol/L氫氧化鉀溶液作為理想提取液。

2.3.2提取時間為探究提取時間對實驗結果的影響,在70 ℃恒溫下選定1、1.5、2 h三段提取時間進行實驗,結果表明當提取時間為1.5 h時最優,當為1 h時提取效率較低,當為2 h時提取效率與1.5 h相差不大,但耗費時間,故最終選擇1.5 h。

2.3.3提取溫度分別在不同溫度下恒溫超聲提取,結果見表2。

表2　不同溫度下的硒提取率(%)

表2可知,70 ℃恒溫超聲浸取1.5 h的效果最好,提取效率可達90%以上。

2.4線性范圍、檢出限和精密度

通過溶解相應量的Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeCys、SeMet 4種2 mg/L標準儲備液稀釋得到的100 mg/L混合標準溶液儲備液,取100 mg/L標準混合工作溶液逐級稀釋配制成濃度分別為5.0、20、40、80、100 μg/L的標準工作溶液,按照實驗條件從低濃度到高濃度分別注入。結果見表3。

從表3可知,4種形態均呈現很好的線性關系,相關系數均大于0.996。

2.5實際樣品的測定

在確定檢測方法后,對海帶、蝦、扇貝、鲅魚等12種測試對象,進行加標回收率和精密度實驗,以考察方法的準確度和重現性。實驗中稱取1.000 g樣品,分別加入0.125、0.25、0.625 mg/kg三個濃度水平,每個濃度平行測定六次,實驗結果見表4。墨魚樣品和加標回收實驗譜圖見圖3,用pH=13的二次水配制的標準譜圖見圖4。

從表4中可知,12種測試樣品的平均回收率都在86.1%以上,相對標準偏差小于5%,具有較高的靈敏度和精密度。

圖3　墨魚樣品和加標回收實驗譜圖Fig.3　The spectra of cuttlefish samples and standard addition recovery

圖4　pH=13的二次水配制的標準譜圖Fig.4　The standard spectra of pH=13 secondary water

3　結論

本文通過對4種硒形態提取率、加標回收率等實驗的研究,優化了海產品中硒形態的前處理和儀器條件,建立了以AS11-HC陰離子色譜柱,碳酸氫鈉溶液/乙腈為流動相,氫氧化鉀溶液作提取液測定海產品中硒形態的方法。該方法線性相關系數均大于0.996,各形態的最低檢出限為0.30 μg/L,相對標準偏差RSD均小5%(n=6),測定了12種水產品中4種硒形態化合物,其加標回收率在86.1%～105.3%之間。該方法測定海產品中的硒形態準確、可靠、簡便靈敏,為科學評價水產品質量、制定水產品中有毒無機硒限量標準提供了技術支撐和數據支持。

[1]蔣麗容,郎春燕,楊海波. 微波消解-雙通道原子熒光光譜法同時測定家禽內臟中的硒和汞[J]. 分析實驗室,2013(6):108-111.

[2]王巖,馬沖先,李莎莎. 雙道氫化物發生-原子熒光光譜法同時測定核電用鋼中痕量砷和銻[J]. 分析實驗室,2012(4):86-89.

[3]梁淑軒,吳虹,孫漢文. 氫化物發生原子熒光結合計算法測定大氣顆粒物中砷的形態[J]. 分析實驗室,2012(8):86-89.

[4]徐永新,雒昆利. 氫化物發生-原子熒光光譜法對水中總硒含量測試方法改進研究[J]. 光譜學與光譜分析,2012,32(2):532-536.

[5]王丙濤,謝麗琪,林燕奎,等. 高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用檢測食品中的五種硒形態[J]. 色譜,2011,29(3):223-227.

[6]Kotrebai M,Tyson J F,Block E,et al. High-performance liquid chromatography of selenium compounds utilizing perfluorinated carboxylic acid ion-pairing agents and inductively coupled plasma and electrospray ionization mass spectrometric detection[J]. Journal of Chromatography A,2000,866(1):51-63.

[7]Zheng J,Ohata M,Furuta N,et al. Speciation of selenium compounds with ion-pair reversed-phase liquid chromatography using inductively coupled plasma mass spectrometry as element-specific detection[J]. Journal of Chromatography A,2000,874(1):55-64.

[8]仲娜,王小如,楊黃浩,等. 高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜聯用技術用于脅迫富硒海帶硒形態研究[J]. 高等學校化學學報,2008,29(1):77-80.

[9]Chatterjee A,Shibata Y,Tanaka A,et al. Determination of selenoethionine by flow injection-hydride generation-atomic absorption spectrometry/high-performance liquid chromatography-hydride generation-high power nitrogen microwave-induced plasma mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta,2001,436(2):253-263.

[10]邱建華,王秋泉,黃本立. 硒形態分析研究進展[J]. 光譜學與光譜分析,2006(09):1692-1701.

[11]李連平,范威,黃志勇,等. 蔬菜中硒總量及形態的氫化物發生-原子熒光光譜測定方法[J]. 光譜學與光譜分析,2008,28(12):2975-2978.

[12]喻宏偉,陳春英,高愈希,等. 高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法分析生物樣品中硒的化學形態[J]. 分析化學,2006,34(6):749-753.

[13]于振,李建科,李夢穎,等. 食品中微量硒測定方法研究進展[J]. 食品工業科技,2012,33(18):371-377.

[14]食品安全國家標準食品中硒的測定[S]. GB 5009.93-2010.

Selenium speciation analysis in aquatic products of Jiaozhou Bay by ion chromatographic hydride generation-atomic fluorescence spectrometry

HAN Ting-ting1,2,CUI He2,*,SONG Tian3,JI Hong-wei1,LI Hui-xin2,ZHU Qian-lin1,CAI Feng2,ZHANG Tao2

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266100,China;2.Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center,Qingdao 266002,China;3.College of Science,Yanshan University,Qinhuangdao 066004,China)

A sensitive analytical method was developed for speciation of aquatic products of Jiaozhou Bay by ion chromatography hydride generation-atomic fluorescence spectrometry(IC-HG-AFS). Learning the mobile phases,extraction reagents,extraction temperature and instrumental conditions was influence for selenium fluorescence signal value. The sample was extracted by the 1.5 mol/L Kalium hydroxide solution. Using the AS11-HC(250 mm×4.1 mm,5.0 μm)anion column,20 mmol/L Sodium hydrogen carbonate solution,2% acetonitrile mobile phase,1.0 mL/min velocity of flow. It could be separated simultaneously in 8 minutes,detecting the Selenocystine(SeCys),Selenomethionine(SeMet),Se(Ⅳ)and Se(Ⅵ). On the optimized conditions,linear relationships between values of fluorescence intensity and mass concentration of selenium species were found in the same range of 0～100 μg/L,with the correlative coefficients more than 0.996. The detection limits(3 s/k)of SeCys,SeMet,Se(Ⅳ),Se(Ⅵ)were 1.53,1.72,0.30,1.06 μg/L,respectively,and the relative standard deviations(n=6)for the selenium species were all less than 5%. Applying the present procedure to the speciation analysis of selenium in aquatic products,the spiked recoveries from 86.1% to 105.3% were obtained. The method for the determination of selenium species in aquatic products was accurate,reliable,simple and sensitive,and effectiveness for the scientific evaluation of the quality of aquatic products and to provide technical support for conduct risk assessments.

ion chromatography;hydride generationatomic fluorescence;Jiaozhou Bay;aquatic products;selenium speciation

2016-03-08

韓婷婷(1992-)，女，碩士，研究方向：儀器分析，E-mail：hantingtingouc@163.com。

崔鶴(1962-)，男，博士，研究員，研究方向：離子色譜開發研究，E-mail：cuihe88@aliyun.com。

國家重大科學儀器設備開發專項(2012YQ090229)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)18-0081-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.007