超濾對大鯢多肽抗氧化活性的影響

青　維,孫　強,白鑫華,冉　旭

(四川大學輕紡與食品學院,四川成都 610065)

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超濾對大鯢多肽抗氧化活性的影響

青維,孫強,白鑫華,冉旭*

(四川大學輕紡與食品學院,四川成都 610065)

大鯢,多肽,抗氧化活性,超濾

大鯢(Andriasdavidianus)屬兩棲綱(Amphibia)有尾目(Caudata)隱腮鯢科(Cryptobrachidae)[1-2],屬于國家二級水生野生保護動物。大鯢肌肉是一種低脂肪的優質蛋白源,具有極高的營養價值和食用價值。大鯢肌肉蛋白必需氨基酸含量豐富,組成比例好,較為符合人體需要模式[3]。研究表明,大鯢肌肉蛋白酶解后得到的多肽不但具有清除自由基的能力,而且具有天然、安全、易吸收的優勢,攝入體內具有提高機體抗氧化能力和補充營養的雙重作用[4]。然而,目前對于食源性抗氧化肽構效關系的研究還不夠深入。研究發現,影響抗氧化能力的因子有很多:氨基酸的組成與排列順序、肽的疏水性與結構、肽的分子量以及水解度都會影響到抗氧化肽的抗氧化能力[5],因此,不同分子量的大鯢多肽的抗氧化活性都會不同。

超濾是一種加壓膜分離技術,即在一定壓力下,使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的濾膜,而且截留大分子溶質,從而使溶液中不同分子量的物質得到分級分離。超濾技術因其具有操作方便、無相變、效率高、成本低等優點,已被廣泛應用于蛋白肽(如大豆肽[6]、乳蛋白多肽[7]、真鯛魚骨多肽[8]等)的分級分離,既可以分離不同相對分子質量的多肽,又有利于保持多肽的生理活性。郝更新等[9]采用超濾對牡蠣蛋白酶解產物中發揮抗氧化活性的肽片段進行組分分離,發現<4 ku超濾液的還原力均高于同濃度的原液和其他超濾組分。而目前有關超濾對大鯢多肽抗氧化活性影響的研究報道較少。

本研究采用不同截留分子量的卷式聚砜超濾膜對大鯢肉蛋白酶解物進行分級分離,通過3種體外自由基清除實驗,比較不同超濾組分多肽的抗氧化能力,為大鯢多肽在食品開發中的應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大鯢四川溪源水產養殖有限公司;中性蛋白酶(2×105U/g)、風味蛋白酶(1.5×104U/g)食品級,江蘇銳陽生物科技有限公司;氯化硝基四氮唑藍、吩嗪硫酸甲酯、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1,10-菲啰啉上海長哲生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)Sigma公司;硫酸亞鐵、雙氧水等均為分析純,成都科龍化工試劑廠。

752N紫外可見分光光度計上海精科實業有限公司;HH-4恒溫水浴鍋國華電器有限公司;JJ-60W電動攪拌器上海喬楓實業有限公司;pHS-3C酸度計成都世紀方舟科技有限公司;LGJ-30冷凍干燥機北京松源華興科技發展有限公司;LJ6T-SY04/W1X膜澄清實驗設備、聚砜卷式超濾膜成都連接流體分離科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1大鯢多肽的制備冷凍大鯢肌肉在室溫下解凍,然后洗凈切碎混勻,大小不超過1 cm3,按一定比例加入去離子水,用1 mol/L的NaOH和HCl溶液調至設定的pH,加酶恒溫攪拌酶解。參照徐陽等[10]確定的大鯢多肽最佳酶解工藝條件:風味蛋白酶和中性蛋白酶添加量均為6000 U/g,酶解溫度55 ℃,酶解時間3 h,料液比1∶8(w/w),初始pH=6.86。酶解結束后將酶解液煮沸15 min滅酶,冷卻至室溫。上述酶解液經0.22 μm微濾膜過濾即可得到得清澈大鯢多肽酶解液。

1.2.2大鯢多肽的膜分離分級在室溫條件下,依次采用截留分子量為20、5、2、0.3 ku的聚砜卷式超濾膜對大鯢多肽酶解液進行超濾分級分離,得到5個不同分子量段的多肽液,將各級多肽液分別冷凍干燥(控制多肽粉水分含量在7%以下),得各分子量段的多肽:ADMAP-1(>20 ku)、ADMAP-2(5～20 ku)、ADMAP-3(2～5 ku)、ADMAP-4(0.3～2 ku)、ADMAP-5(<0.3 ku)。四級膜分離的分離壓力分別為0.1、0.15、0.25、0.45 MPa。具體膜分離工藝流程如下:

1.2.3不同超濾組分抗氧化活性的測定

1.2.3.1DPPH自由基清除活性的測定DPPH自由基清除活性的測定方法參照Shimada等人[11]的方法,略作修改:將多肽粉配制成不同濃度樣品液,量取4 mL樣品液于試管中,加入4 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L,溶于95%乙醇),振蕩混勻后在室溫下避光反應20 min,以去離子水調零,在517 nm下測定吸光值Ai;空白組為4 mL樣品液,加入4 mL 95%乙醇溶液,測定吸光值為Aj;對照組為4 mL DPPH溶液加上4 mL去離子水,測定吸光值為A0。DPPH清除率按公式(1)計算。

(1)

式中:Ai:樣品組吸光值;Aj:空白組吸光值;A0:對照組吸光值。

1.2.3.2·OH自由基清除活性的測定·OH自由基清除活性的測定參照Wang等[12]的方法。在該法中,H2O2和Fe2+發生Feton反應產生的·OH自由基能將二價鐵離子氧化成三價鐵離子。二價鐵離子能與1,10-菲啰啉結合生成紅色化合物,該化合物在波長為536nm處有吸收。

取1mL1,10-菲啰啉(1.865mmol/L)與2mL樣品液于具塞試管中混合,再加入1mLFeSO4·7H2O(1.865mmol/L),最后加入1mLH2O2溶液(0.03%,v/v),將試管置于37 ℃溫度下反應60min,于536nm處測量吸光度A,同時以蒸餾水代替樣品液作陰性對照Aj,以蒸餾水代替過氧化氫作空白對照A0。樣品對·OH自由基的清除率按公式(2)計算。

(2)

式中:A:樣品組吸光度;Aj:陰性對照吸光度;A0:空白對照組吸光度。

(3)

式中:A0:空白對照吸光度;A:樣品組吸光度。

1.2.4水解度的測定

1.2.4.1總氮和蛋白質含量的測定參照GB 5009.5-2010采用凱氏定氮法測定。

1.2.4.2游離氨基態氮的測定參考趙新淮等人[14]的甲醛滴定法測定大鯢酶解液中的游離氨基態氮含量。

1.2.4.3水解度的計算依據公式(4)計算水解度(DH):

(4)

1.2.5多肽得率的測定多肽得率是指酶解液中多肽含量占原料總蛋白質的百分比。首先參照魯偉等人[15]的方法,采用加入等量的10%(W/V)三氯乙酸沉淀大分子蛋白質,然后采用雙縮脲法測定酶解液中多肽的含量,具體步驟參照《2010版中國藥典》的《蛋白質含量測定法》。多肽得率的計算如公式(5)。

表1　大鯢肉酶解液超濾分級結果

(5)

2　結果與分析

2.1大鯢抗氧化肽超濾分級

大鯢肉酶解液經超濾分級后冷凍干燥,所得組分采用直接干燥法測水分含量。各組分含量如表1所示。

由表1可知,大鯢肉酶解液經0.22 μm微濾膜處理后,酶解液中多肽分子量均小于20 ku。酶解液中各組分含量依次是:ADMAP-4>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2,大鯢酶解物中82.5%為分子量0.3～5 ku的多肽,說明超濾可有效分離各分子量段抗氧化肽。

2.2不同超濾組分對DPPH自由基的清除作用

不同超濾組分不同濃度對DPPH自由基的清除作用如圖1所示。

圖1　不同超濾組分對DPPH自由基的清除作用Fig.1　DPPH· scavenging activity of different UF fractions

由圖1可以看出,大鯢多肽濃度在0～4 mg/mL的范圍內,各超濾組分DPPH自由基清除率隨著大鯢多肽濃度的增加而不斷上升。當大鯢多肽濃度超過4 mg/mL后,DPPH自由基清除能力無顯著提高。由于EC50(ADMAP-2)>EC50(ADMAP-5)>EC50(ADMAP-3)>EC50(ADMAP)>EC50(ADMAP-4),說明大鯢多肽各超濾組分對DPPH·自由基清除能力從大到小的順序為:ADMAP-4>ADMAP>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2。當各組分濃度為4 mg/mL時,清除率由高到低依次為93.24%、91.67%、82.32%、80.57%、55.69%。其中,ADMAP-4表現出的清除能力最強(p<0.05),比同濃度VC對DPPH·自由基的清除活性低2.54%,有明顯差異(p<0.05),其EC50值為0.4 mg/mL。ADMAP-2表現出的清除能力最小,說明分子量過大的多肽對DPPH自由基清除能力較低。超濾前的ADMAP也表現出較強的清除能力,其EC50約為1 mg/mL。結果表明,超濾處理能夠有效分離得到大鯢多肽中對DPPH·自由基清除活性較強的組分。如圖1所示,不同分子量分布的大鯢多肽對DPPH自由基清除活性不同(p<0.05),分子量在0.3～2 ku范圍內的多肽清除DPPH自由基能力最強。

2.3不同超濾組分對·OH自由基的清除作用

不同超濾組分不同濃度對·OH自由基的清除作用如圖2所示。

圖2　不同超濾組分對·OH自由基的清除作用Fig.2　·OH scavenging activity of different UF fractions

由圖2可以看出,大鯢多肽濃度在0～4 mg/mL的范圍內,隨著大鯢多肽濃度的增加,各超濾組分·OH自由基清除率不斷上升,表明大鯢多肽不同超濾組分對·OH自由基的清除率具有明顯的量效關系。當大鯢多肽濃度超過4 mg/mL后,·OH自由基清除能力變化不明顯。在多肽濃度相同時,各組分對·OH自由基清除能力依次為:ADMAP-4>ADMAP>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2。如表1所示,各組分的分子量大小順序為:ADMAP-2>ADMAP-3>ADMAP-4>ADMAP-5。由上述結果可以推斷得出:各超濾組分的分子量太大或太小,大鯢多肽的·OH自由基清除活性都不高,適中分子量范圍(0.3～2 ku)的大鯢多肽·OH自由基清除活性最強。

圖3　不同超濾組分對自由基的清除作用Fig.· scavenging activity of different UF fractions

3　結論

大鯢多肽酶解液經20、5、2、0.3 ku的超濾膜超濾分離后得到四種不同分子量范圍的多肽,大鯢酶解物中82.5%的多肽分子量集中在0.3～5 ku。在體外抗氧化實驗中,各超濾組分均表現出一定的體外抗氧化能力,且各超濾組分與酶解原液的清除DPPH·能力、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子能力均為ADMAP-4>ADMAP>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2,說明分子量在0.3～2 ku的大鯢多肽表現出較強的抗氧化能力,這一結果為大鯢抗氧化多肽在保健食品的應用提供理論基礎。

[1]陳德經. 大鯢黏液、皮膚及肉中氨基酸分析[J]. 食品科學,2010(18):375-376.

[2]費梁. 中國兩棲動物圖鑒[M]. 鄭州:河南科學技術出版社,1999:38-40.

[3]王立新,鄭堯,艾閩,等. 中國大鯢肌肉、尾脂營養成分分析與評價[J]. 西北農林科技大學學報:自然科學版,2011,39(2):68-74.

[4]Pappenheimer J R,Volpp K. Transmucosal impeunce of small intestine:correlation with transport of sugars and amino acids[J]. American Journal of Physiology-Cell Physiology,1992,263(2):480-493.

[5]Di Bernardini R,Mullen A M,Bolton D,et al. Assessment of the angiotensin-I-converting enzyme(ACE-I)inhibitory and antioxidant activities of hydrolysates of bovine brisket sarcoplasmic proteins produced by papain and characterization of associated bioactive peptidic fractions[J]. Meat Science,2012,90(1):226-235.

[6]孫月梅,李楊,江連洲. 超濾技術在抗氧化大豆肽制備中的研究[J]. 食品工業科技,2009(2):94-96.

[7]李明浩,李曉東,張玲,等. 超濾法生產全乳蛋白濃縮物的工藝參數研究[J]. 食品工業,2014,35(8):34.

[8]鄭捷,李素,胡愛軍,等. 不同分子量真鯛魚骨多肽抗氧化活性的研究[J]. 食品工業科技,2014,35(2):108-111.

[9]郝更新,曹文紅,郝記明,等. 超濾法濃縮富集牡蠣蛋白抗氧化活性肽[J]. 食品工業科技,2013(11):77-80.

[10]徐陽,孫強,青維,等. 復合酶法制備大鯢多肽的研究[J]. 食品工業科技,2015(24):180-185.

[11]Shimada K,Fujikawa K,Yahara K,et al. Antioxidative properties of xanthan on the antioxidantion of soybean oil in cyclodextrin emulsion[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1992,40(6):945-948.

[12]Wang B,Li Z R,Chi C F,et al. Preparation and evaluation of antioxidant peptides from ethanol-soluble proteins hydrolysate of Sphyrna lewini muscle[J],Peptides,2012,36(2):240-250.

[13]陳日春. 鰱魚魚鱗膠原蛋白肽的制備及其抗氧化活性的研究[D]. 福州:福建農林大學,2013.

[14]趙新淮,馮志彪. 大豆蛋白水解物水解度測定的研究[J]. 東北農業大學學報,1995(2):178-181.

[15]魯偉,任國譜,宋俊梅. 蛋白水解液中多肽含量的測定方法[J]. 食品科學,2005,26(7):169-171.

Effects of UF(ultrafiltration)on the antioxidant activity ofAndriasdavidianuspeptides

QING Wei,SUN Qiang,BAI Xin-hua,RAN Xu*

(College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Andriasdavidianus;peptides;antioxidant activity;ultrafiltration

2016-03-30

青維(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail：qwlbl702@sina.com。

冉旭(1968-)，男，博士，副教授，研究方向：農產品加工與貯藏，E-mail：ranxu01@sina.com。

TS201.1

A

1002-0306(2016)18-0139-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.018