分子對接模擬與光譜法研究沒食子酸丙酯和牛血清白蛋白的相互作用

朱國飛,滕　騰,鄧　斌

(1.貴州理工學院制藥工程學院,貴州貴陽 550003;2.四川大學生命科學學院,四川成都 610065)

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分子對接模擬與光譜法研究沒食子酸丙酯和牛血清白蛋白的相互作用

朱國飛1,滕騰2,鄧斌1

(1.貴州理工學院制藥工程學院,貴州貴陽 550003;2.四川大學生命科學學院,四川成都 610065)

運用熒光光譜法、紫外吸收光譜法等方法對沒食子酸丙酯(PG)與牛血清白蛋白(BSA)之間的相互作用進行了研究。熒光猝滅計算結果表明PG與BSA間的結合作用較強,猝滅機制為靜態猝滅,測得其299 K時的結合常數KA為1.03×105L·mol-1,兩者的作用距離為1.71 nm。熱力學參數計算結果表明PG與BSA相互作用力主要為范德華力與氫鍵作用力。通過探針分子取代反應確定了PG在BSA上的結合位點是亞級結構域IIA。圓二色譜的測定結果表明PG的結合導致了蛋白中α-螺旋結構的減少以及無規則卷曲的增加。本文最后通過計算機模擬分子Dock的方法模擬出了PG與BSA的結合構象,所得到的結合參數與之前的計算結果相符。

沒食子酸丙酯,牛血清白蛋白,熒光光譜法,相互作用

沒食子酸丙酯[1](Propyl Gallate,PG),又稱櫧酸丙酯,化學名為3,4,5-三羥基苯甲酸丙酯。PG是一種常見的抗氧化劑,它的抗氧化性來源于它能自身氧化,從而降低周圍環境的含氧量,它能與蛋白質結合抑制某些氧化酶的活性[2],還能提供氫原子與脂肪自由基進行結合,終止油脂的自動氧化連鎖反應[3-4]。由于其安全無毒性抗氧化,因此已被廣泛應用于食品行業,以防止食品的變質和腐敗。此外,一些研究發現,PG對一些組織和細胞還具有生理活性,例如,PG可以作為抗氧化劑防止上皮細胞免除H2O2的損害[5],在小鼠耳腫脹實驗中PG具有典型的抗炎活性[6],最近一些實驗還發現,PG能抑制一些腫瘤細胞的生長,誘導腫瘤細胞的凋亡[7-9]。因此,PG在功能性保健食品開發中具有廣泛的應用前景。

在血液中,血清白蛋白(Serum Albumin,SA)是血漿中含量最豐富的蛋白質,起著貯存外源小分子和內源代謝產物的重要作用,是最為重要的藥物結合蛋白。它可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質結合,作為它們的載體。研究PG與SA之間的相互作用,有助于了解PG在體內的運輸和分布情況,對闡明PG的生理活性有著非常重要的意義。研究表明,PG可通過疏水作用與人血清蛋白HSA(Human Serum Albumin)發生靜態結合,結合位點位于HSA亞結構域IIA(藥物結合位點I)處,同時研究表明,PG與HSA的結合會導致HSA二級結構發生變化,主要表現為α螺旋結構減少[10-11]。但是到目前為止,還沒有關于PG與牛血清蛋白BSA(Bovine Serum Albumin)相互作用的文獻報道。因此,作為PG與SA相互作用研究的補充,本文采用分子對接模擬以及光譜法等方法,詳細研究了PG與BSA的結合過程,希望能進一步闡明PG在血液中的結合與運輸,為PG作為食品抗氧化劑、功能性保健食品、新藥組分等的設計和開發提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牛血清蛋白純度≥98%,上海麗珠東風生物技術有限公司;沒食子酸丙酯純度≥98.0%,HPLC,美國Sigma公司;膽紅素純度≥95.0%,UV,美國Sigma公司;撲爾敏純度≥99.0%,美國Sigma公司;其它化學試劑分析純。

PHS-4C+型pH計成都方舟科技有限責任公司;高壓滅菌鍋上海申安醫療有限責任公司;Hitachi-F4500型熒光分光光度計日本日立公司;Unico 2808型紫外可見光分光光度計上海尤尼科儀器有限公司;AVIV Model 400型圓二色譜儀美國Aviv。

1.2實驗方法

用50×10-3mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)配制濃度為3.0×10-6mol/L的BSA溶液,備用。

1.2.1熒光發射光譜檢測PG與BSA的相互作用取2 mL濃度為3.0×10-6mol/L的BSA溶液加入石英比色杯中,用微量進樣器每次加入定量的PG溶液并充分混勻(保證總體積幾乎不變的前提下使混合溶液中PG的終濃度分別為0、1、5、10、15、20、25×10-6mol/L),每次加入混勻靜置作用10 min后開始進行檢測。檢測條件:激發狹縫5 nm,發射狹縫10 nm,激發電壓700 V,激發波長分別為278 nm和295 nm,用熒光光譜儀掃描溶液在200～400 nm的熒光光譜數據。為了檢測PG與BSA的結合方式,分別在299 K和309 K兩個恒溫溫度條件下(299 K接近室溫,309 K接近體溫)測定其猝滅常數。每個濃度條件下測定5次,計算平均值,重復實驗3次。樣品光譜均扣除了緩沖液的背景光譜。

1.2.2PG與BSA結合距離的計算取2 mL濃度為3.0×10-6mol/L的BSA溶液加入石英比色杯中,用微量進樣器加入PG溶液使混合溶液中PG的終濃度同樣為3.0×10-6mol/L,充分混勻。熒光發射光譜檢測:激發狹縫5 nm,發射狹縫10 nm,激發電壓700 V,激發波長為278 nm,波長掃描范圍300～400 nm,299 K恒溫條件;紫外吸收光譜檢測:波長掃描范圍200～700 nm,299 K恒溫條件。掃描次數5次,計算平均值,重復實驗3次,樣品光譜均扣除緩沖液的背景光譜。

1.2.3PG與BSA結合位點的判定取2 mL濃度為3.0×10-6mol/L的BSA溶液加入石英比色杯中,用微量進樣器加入PG溶液使混合溶液中PG的終濃度同樣為3.0×10-6mol/L,充分混勻。用微量進樣器每次加入定量的膽紅素(保證總體積幾乎不變的前提下使混合溶液中膽紅素的終濃度分別為0、3、6、9、12、15、18×10-6mol/L)每次加入混勻之后靜置,299 K溫度下充分作用10 min后開始進行檢測。熒光發射光譜檢測:激發狹縫5 nm,發射狹縫10 nm,激發電壓700 V,激發波長為278 nm,波長掃描范圍300～400 nm,299 K恒溫條件。每個濃度條件下測定5次,計算平均值,重復實驗3次,樣品光譜均扣除了緩沖液的背景光譜。同種方法,以撲爾敏為探針,重復以上實驗。

1.2.4金屬離子對PG與BSA結合作用的影響取2 mL濃度為3.0×10-6mol/L的BSA溶液加入石英比色杯中,用微量進樣器加入AlCl3溶液使混合溶液中Al3+的終濃度同樣為3.0×10-6mol/L,充分混勻。再用微量進樣器每次加入定量的PG溶液并充分混勻(保證總體積幾乎不變的前提下使混合溶液中PG的終濃度分別為0、1、5、10、15、20、25×10-6mol/L),299 K溫度下靜置作用10 min后開始進行熒光發射光譜檢測。檢測條件:激發狹縫5 nm,發射狹縫10 nm,激發電壓700 V,激發波長為278 nm,掃描波長范圍200～400 nm。每個濃度條件下測定5次,計算平均值,重復實驗3次,樣品光譜均扣除了緩沖液的背景光譜。采用同種方法,重復以上實驗檢測Ca2+、Co2+以及Cu2+對PG與BSA結合作用的影響。

1.2.5同步熒光光譜測定PG對BSA構象的影響樣品處理方法與熒光發射光譜檢測(1.2.1)相同。檢測條件:激發狹縫5 nm,發射狹縫10 nm,激發電壓700 V,恒溫299 K,波長掃描范圍250～350 nm,分別記錄Δλ=15 nm和Δλ=60 nm(Δλ=激發光波長-發射光波長)時的熒光光譜數據。每個濃度條件下測定5次,計算平均值,重復實驗3次,樣品光譜均扣除了緩沖液的背景光譜。

1.2.6圓二色譜測定PG對BSA二級結構的影響BSA樣品濃度3.0×10-6mol/L,PG處理終濃度分別為0、3、15×10-6mol/L。在AVIV Model 400型圓二色譜儀上記錄遠紫外圓二色譜。掃描范圍為200～260 nm,激發光和發射光狹縫均設為1 nm,掃描速度設為中速,光譜校正設為開啟以消除光柵和檢測器響應的波長依賴性。每個濃度條件下測定5次,計算平均值重復實驗3次。

1.2.7結合模擬(Docking)采用Autodock軟件(Scripps研究所),對PG和BSA的分子對接進行模擬。Docking工具采用Autodock 4.2版本(MGL Tools for win)。配體與受體文件分別來源于Protein Data Bank(www.rcsb.org)與Pubchem(pubchem. ncbi. nlm.nih.gov)。后期使用Accelrys-Discovery Studio進行分析和輸出。

1.3數據處理

1.3.1Stern-Volmer方程計算熒光猝滅機制

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

式(1)

其中:F0為未加猝滅劑時的熒光強度,F為加猝滅劑后的熒光強度,[Q]為猝滅劑濃度,Ksv為Stern-Volmer動態猝滅常數,Kq為動態熒光猝滅速率常數,τ0為生物大分子熒光平均壽命,大約為10-8s[10-11]。

1.3.2PG與BSA結合常數和結合數的計算

lg[(F0-F)/F]=lg KA+n·lg[Q]

式(2)

其中F0與[Q]同上,KA為結合常數,n為結合位點數[12]。

1.3.3結合模式的判定范氏霍夫方程:

lnΔ(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

式(3)

ΔG=-RTlnK

式(4)

ΔS=-(ΔG-ΔH)/T

式(5)

其中T1、T2為不同溫度,K1、K2為不同溫度下藥物與蛋白質結合的結合常數,R為氣體分子常數,ΔH為焓變,ΔG為吉布斯自由能變化值,ΔS為熵變。在藥物與生物大分子的反應中,其主要作用類型可根據反應前后熱力學參數ΔH焓變和ΔS熵變的大小來判斷。

當ΔH>0,ΔS>0時為疏水作用力;當ΔH<0,ΔS<0時為氫鍵和范德華力;當ΔH≈0,ΔS>0時為靜電引力[13]。

1.3.4結合距離的計算F?rster的偶極-偶極非輻射能量轉移理論:

E=R06/(R06+r6)

式(6)

R06=8.8×10-25K2n-4ΦJ

式(7)

J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ/∑F(λ)Δλ

式(8)

E是授體與受體間能量轉移效率,F和F0分別為存在和不存在能量接受體時能量給予體的熒光發射強度,R0是轉移效率為50%時的臨界距離,K2為偶極空間取向因子,n為介質的折射指數,Φ為授體的熒光量子產率,J為授體的熒光發射光譜與受體的吸收光譜間的光譜重疊積分,F(λ)為熒光授體在波長λ處的熒光強度,ε(λ)為受體在波長λ處的摩爾消光系數,r為藥物與蛋白質結合時結合位置處蛋白質分子中熒光發射基團之間的距離[14-15]。

1.3.5分子探針相關判定Sudlow等提出的探針取代計算方法[16]:

P(Probe displacement)(%)=F2/F1×100

式(9)

1.3.5結合模擬(Docking)相關軟件及說明均來自http://autodock. scripps. edu/和http://accelrys. com/[10]。

2　結果與討論

2.1熒光發射光譜檢測PG與BSA的相互作用

不同的熒光基團在有特定的熒光激發波長的情況下能發出內源性熒光。在BSA中含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基,均有內源熒光現象,并且它們的內源熒光對BSA的三級結構和構象穩定性的改變非常敏感,所以它們的光譜測定和分析可以作為研究BSA構象改變的工具。

如圖1(A)所示,在298 K的溫度條件下,當激發波長λex=278 nm時(色氨酸為熒光的主要貢獻基團),BSA所發出內源性熒光的波峰位于342 nm左右,而PG本身在這附近沒有熒光發射峰,表明其色氨酸殘基處于一個相對疏水環境下[10-12]。固定BSA濃度,隨著PG作用濃度的增加,BSA的內源性熒光強度發生了規律性的減弱,這說明PG與BSA發生了較強的相互作用并導致了BSA內源性熒光發生猝滅[10-12]。光譜學證明,熒光峰值的移動表明發色基團所處的微環境發生了空間構象變化。研究結果顯示隨著PG作用濃度的增加,本身位于342 nm處的熒光峰值有輕微藍移(藍移0.5 nm),這暗示了色氨酸殘基周圍微環境的疏水性有微弱增加[10-12],但是值得注意的是不管是波峰位置還是波形的變化都不是非常的明顯,造成這一現象的原因可能是其它的熒光基團對色氨酸的熒光光譜產生了干擾,因此,在下文中將采用同步熒光光譜進行驗證。當激發波長λex=295 nm時(圖1B),與色氨酸的熒光光譜相似,隨著PG作用濃度的增加,酪氨酸殘基熒光強度也明顯發生淬滅,波峰幾乎沒有發生移動,暗示PG與BSA發生了較強的相互作用,但是酪氨酸殘基的微環境并沒有發生明顯變化。同時研究還發現,當檢測溫度為308 K(略)時,實驗結果與299 K條件下相似。因BSA包含了兩個色氨酸殘基,分別位于其氨基酸序列的134位和213位上,134位Trp殘基暴露于親水環境中,而213位Trp殘基則處于疏水腔中,并可與多種配體基團結合[16],所以后文將重點對激發光λex=278 nm時情況進行探討。

圖1　PG與BSA相互作用的熒光光譜圖Fig.1　BSA fluorescence spectra in the presence of PG注:圖A和圖B分別是激發光為278 nm和295 nm時PG與BSA相互作用的熒光發射光譜。檢測條件:pH=7.4,溫度為298 K,BSA的濃度為3×10-6 mol/L,曲線1～7分別代表PG的作用濃度為0、1、5、10、15、20、25×10-6 mol/L。

2.2PG對BSA猝滅方式的判定

眾所周知,根據熒光猝滅機制的不同,猝滅方式可分為動態猝滅和靜態猝滅兩種。在不同溫度條件下檢測樣品體系的熒光特征,能夠有效的區分這兩種淬滅方式。簡單的說,如果是動態淬滅,隨著檢測溫度的升高,熒光物質分子與猝滅劑之間的有效碰撞次數、能量轉移效率均會增加,從而導致淬滅常數升高;相反,假如是,靜態淬滅隨著檢測溫度的升高,會降低猝滅劑-熒光分子復合物的穩定性,從而導致淬滅常數的降低[10-11]。根據Stern-Volmer方程[公式(1)],將F0/F對[Q]作圖,可求得Ksv與Kq。從圖2中可以看到,在兩個溫度條件下,按Stern-Volmer方程作圖分別得到一條直線,即斜率均是固定值,這表明在檢測體系中只存在一種熒光體,并且對于淬滅體都是可接近的。隨著溫度的增加,擬合曲線的斜率減小,即猝滅常數變小,這表明由于PG與BSA形成了復合物,復合物在溫度升高時穩定性降低導致熒光猝滅效應變弱,這是靜態猝滅的標志性特點[17]。并且通過計算,Kq的數量級為1012(表1),遠遠大于最大擴散控制的碰撞猝滅速率常數為2.0×1010L·mol-1·s-1,從另一個方面證實了PG對BSA的熒光猝滅方式為靜態猝滅[17]。

圖2　不同溫度下PG猝滅BSA的Stern-Volmer曲線Fig.2　The Stern-Volmer polts of BSA quenched by PG注:激發波長λex=278 nm,pH=7.4,直線1和2分別為檢測溫度為299 K和309 K時的Stern-Volmer擬合曲線。

溫度(K)Ksv(×104L·mol-1)Kq(×1012L·mol-1·s-1)r2991.12501.12500.9873090.76300.76300.991

注:Ksv為Stern-Volmer動態猝滅常數,Kq為動態熒光猝滅速率常數,r是Stern-Volmer方程的相關系數。

2.3PG與BSA結合常數和結合數的計算

在蛋白和小分子相互作用的過程中,結合常數KA通常用來表示蛋白和小分子結合的強度,而結合數n表示小分子與蛋白結合作用時兩者數量之比。它們的測算對于后續研究藥物與蛋白的相互作用關系非常重要,而在靜態猝滅過程中,它們之間的關系滿足公式(2)[12]。以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖,可以求出n和KA。

通過計算,在299 K條件下,PG與BSA的結合常數KA=1.0281×105L·mol-1(表2),明顯比一般配體-蛋白的結合常數要大[18-19],這表明PG同BSA具有較高的親和能力,發生了較強的相互作用,暗示PG能夠通過BSA蛋白在體內進行儲存和運輸,同時也意味著PG在功能性食品開發中具有廣泛的潛在應用前景。當測試溫度升高到309 K時,研究發現PG與BSA的結合常數降低了接近10倍,表明在較高溫度下,PG-BSA復合物發生了分解,進一步暗示PG與BSA作用方式為靜態結合。同時通過計算還發現,在299 K和309 K兩個溫度條件下,PG與BSA的結合數n分別為0.848和1.035,這兩個數值都非常接近于1,反映出PG與BSA可能采取1∶1分子比的方式進行結合,暗示在BSA上可能只有一個PG的結合位點[10]。

圖3　利用雙對數作圖求得不同溫度下PG與BSA的結合常數Fig.3　Double-logarithm plot of PG quenching effect on BSA fluorescence at different temperature

溫度(K)KA(×105L·mol-1)結合數nr2991.02810.8480.9953090.11481.0350.992

注:檢測條件:pH=7.4;激發波長λex=278 nm。KA為結合常數,n為結合位點數,r是方程的相關系數。

2.4PG與BSA結合作用力的判定

通過考察蛋白與小分子之間結合作用力的判定,可以對其結合作用進行更深入的闡釋,它們相互之間的結合力主要有疏水作用力、靜電作用力、范德華力及氫鍵作用等。Ross等[13]總結了一系列熱力學的規則,并提出了判斷生物大分子與小分子結合力性質和生物大分子自身結合力性質的模型。當反應溫度變化在一個小范圍的時候,反應的焓變ΔH可以視為一個固定的常數。因此根據熱力學模型利用方程(3)～(5)求解,即可確定分子間作用力的類型與結合的模式.

計算結果見表3,可知ΔH<0且ΔS<0,這種情況通常是由氫鍵和范德華力引起[13],因此PG與BSA間的結合應該主要由氫鍵與范德華力進行維持。

表3　PG與BSA相互作用的熱力學參數

注:檢測條件:pH=7.4;激發波長λex=278 nm。ΔH為焓變,ΔG為吉布斯自由能變化值,ΔS為熵變。

2.5PG與BSA結合距離的計算

根據F?rster的偶極-偶極非輻射能量轉移理論,當給體與受體濃度相近時,如給體熒光光譜與受體紫外吸收光譜存在疊加且兩者距離小于7 nm,那么有可能發生非輻射能量轉移[14]。圖4為299 K溫度條件下BSA的熒光光譜與PG的紫外吸收光譜(309 K的圖略),根據公式(6)～(8)可求出該PG與BSA的結合距離(表4)。當K2、n-4、Φ分別取2/3、1.36和0.15時[15],299 K溫度條件下求出PG與BSA間能量轉移效率為52.17%,轉移效率為50%時的臨界距離R0=1.74 nm,PG與BSA結合距離r=1.71 nm。當溫度升高到309 K時,PG與BSA間能量轉移效率下降到42.86%,同時結合距離r變大,造成這一現象的原因是在較高溫度下,PG-BSA復合物的穩定性降低,結合常數下降。同時研究還發現,不同溫度條件下所得r值均遠遠小于7 nm,這表明供體BSA色氨酸殘基與受體PG在空間上靠的非常接近,暗示BSA與PG發生并形成了非輻射能量轉移。

圖4　BSA的熒光光譜與PG的紫外吸收光譜Fig.4　The overlap of the fluorescence spectrum of BSA and the absorbance spectrum of PG注:激發波長為278 nm;pH=7.4;T=299 K;CBSA=CPG=3.0×10-6 mol L-1。

溫度(K)E(%)R0(nm)r(nm)29952.171.741.7130942.861.741.82

注:E是授體與受體間能量轉移效率,R0是轉移效率為50%時的臨界距離,r為PG與結合位置處BSA色氨酸熒光發射基團之間的距離。

2.6PG與BSA結合位點的判定

BSA包含了兩個色氨酸殘基,分別位于其氨基酸序列的134位和213位上。134位Trp殘基暴露于親水環境中,而213位Trp殘基則處于疏水腔中,并可與多種配體基團結合[16]。Klaus J Fehske[20]的研究表明,藥物在SA上的結合部位存在著以下三個:吲哚及苯二氮卓結合部位;華法令及阿扎丙宗結合部位;洋地黃毒甙結合部位,每個結合部位都包含了兩個亞域。在控制藥物濃度的前提下,通過使用結合部位已知的熒光探針(即標記配體),可以和對應的藥物分子在蛋白的結合部位上進行競爭結合,以此便可以確定藥物在蛋白質上的結合部位。按Sudlow等提出的探針取代計算方法[公式(9)][16],選擇膽紅素(結合位點為亞結構域IIA)和撲爾敏(結合位點為亞結構域IIIA)作為熒光探針[10],對PG是否被取代進行檢測,從而判定PG在BSA上的結合位置。

由圖5可以看出,探針濃度不斷增大時,實驗結果發生以下變化:加入撲爾敏探針后,反應體系的熒光強度并沒有發生明顯的變化;相反,在加入膽紅素后,反應體系的相對熒光強度發生明顯降低。實驗結果表明膽紅素很可能取代了PG在BSA上的結合,因膽紅素在BSA上的結合位點位于亞結構域IIA上,這也就暗示PG在BSA上的結合位點也位于亞結構域IIA。

圖5　以膽紅素和撲爾敏為探針取代PG在BSA結合部位Fig.5　Probe displacement of PG-BSAby bilirubin and chlorpheniramine maleate注:激發光波長278 nm;溫度298 K;pH=7.4;CBSA=CPG=3.0×10-6 mol/L;撲爾敏:C撲爾敏/CBSA=0、1、2、3、4、5、6;膽紅素:C膽紅素/CBSA=0、1、2、3、4、5、6。

2.7金屬離子對PG與BSA結合作用的影響

PG含多個酚羥基,有較強的金屬螯合能力,可與多種金屬離子形成配合物,而且所得配合物均為多個PG分子與單個金屬離子形成[12]。因此金屬離子的存在對PG的活性可能存在影響,以下對常見的幾種金屬離子存在時的結合過程進行研究,得到的計算結果見表5。

表5　不同金屬離子條件下PG與BSA的結合常數

注:激發波長278 nm;pH7.4;溫度299 K;無金屬離子存在條件下KA=1.03×105L·mol-1。

從表5中可以看到金屬離子的存在對PG與BSA的結合存在一定程度影響,在有金屬離子存在的條件下,PG與BSA的結合常數明顯降低,表明PG與BSA的結合能力下降,其中,以Co2+降低最多,Cu2+降低最少。根據前面結合位點的判定,初步認為可能是由于多個PG分子與金屬離子螯合形成配合物(其中以Co2+最易與PG形成配合物),使得PG分子結構增大,對其進入Trp213所在疏水腔產生一定阻礙作用,所以導致以上結合常數都有不同程度的降低。

表6　PG對BSA的二級結構的改變

注:采用CDNN軟件對BSA二級結構進行估算,實驗獨立重復次數為3次。

2.8同步熒光測定PG對BSA構象的影響

在光譜學研究中發現,氨基酸殘基的最大熒光波長與其所處環境的疏水性有關。如果氨基酸所處環境的疏水性降低,將對其熒光性質產生影響,表現為其最大發射波長紅移,因此根據熒光波長的改變可判斷蛋白質構象的變化。蛋白質內,多種內源熒光生色基團會產生不同熒光,而普通的熒光光譜中能檢測到的發射峰存在一定程度的重疊,不易區分,而采用同步熒光光譜則可以將其區分開來,因此采用同步熒光光譜對BSA構象變化進行研究。

當BSA濃度一定,PG濃度不斷增加時,采用同步熒光光譜記錄Δλ=15 nm和Δλ=60 nm條件下熒光光譜數據,如圖6所示。

圖6　PG與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.6　Synchronous fluorescence spectra of PG-BSA注:測試溫度299 K,pH=7.4,BSA濃度為3.0×10-6 mol/L;圖A和圖B分別為Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時PG與BSA相互作用的同步熒光光譜;曲線1～7分別代表PG作用濃度為0、1、5、10、15、20、25×10-6 mol/L。

實驗結果表明:當Δλ=15 nm時,隨著PG的濃度增加,同步熒光波峰強度略微降低,降低幅度為9.20%,而波峰位置幾乎沒有發生任何變化,這表明BSA中的酪氨酸殘基的疏水性和極性沒有發生明顯變化。而Δλ=60 nm時,同步熒光波峰強度明顯降低,降幅為31.18%,并且最大發射波長位置出現輕微的藍移(2 nm),這表明色氨酸殘基的環境極性減弱、疏水性逐漸增強,肽鍵的伸展程度有所減弱,PG與BSA的作用改變了色氨酸殘基的微環境,色氨酸殘基“包埋”狀態增加[10-11],這與前文激發光為278 nm時發射光譜的結果吻合。這也證明PG分子是可以進入BSA的立體結構中的,不但使色氨酸殘基的熒光強度發生淬滅,而且還能導致色氨酸殘基的微環境發生改變,疏水性增加。

2.9圓二色譜分析PG對BSA構象的影響

遠紫外圓二色譜可以較為精確的測定蛋白二級結構的變化,因此本文采用Far-UV CD光譜對PG和BSA的結合過程進行了研究,以探討PG是否能夠誘導BSA的二級結構的變換。如圖7所示,BSA在208 nm和222 nm處有兩個負峰,屬于典型的高比例α-螺旋結構蛋白。

圖7　遠紫外圓二色譜分析PG與BSA的結合作用Fig.7　The far-UV CD spectra of PG with BSA注:測試溫度299 K,pH=7.4,BSA濃度為3.0×10-6 mol/L;曲線1～3分別代表PG作用濃度為0、3、15×10-6 mol/L。

通過CDNN軟件對二級結構的估算發現,由于PG的結合導致了BSA中規則二級結構的減少以及無規則卷曲的增加,其中主要是α-螺旋結構的減少(表6)。天然狀態下的BSA含有54.3%α-螺旋,9.8%β-折疊,14.1%β-轉角以及21.8%無規則卷曲。而與PG進行結合后,α-螺旋所占比例降低到52.9%,而無規則卷曲比例增加到22.6%,β-折疊和β-轉角的比例在結合前后沒有顯著的變化,這說明PG對其并未產生顯著的影響。

2.10分子結合模擬

為研究PG與BSA的結合位點,還可以采用分子對接模擬的方法。配體與受體的相互作用是分子識別的過程,其中主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華作用等。通過分子模擬,可以預測兩者之間的結合模式、作用距離和作用力等,從而進行藥物的虛擬篩選等研究工作[13]。Autodock是一套Scripps的Olson科研小組開發的分子對接軟件包,采用模擬退火和遺傳算法來尋找受體和配體最佳的結合位置,用半經驗的自由能計算方法來評價受體和配體之間的匹配情況用來自動分子對接的軟件,可以預測小分子是如何與已知三維結構的受體結合的[14]。通過Autodock軟件,在之前研究的基礎上,對PG和BSA的分子對接實現了模擬(圖8)。

圖8　PG與BSA結合的分子對接Fig.8　The docking result of PG with BSA注:A、B和C分別為PG與BSA結合分子對接的表面、二級結構以及微環境示意圖。

在圖8A、B中,通過展示分子表面,可以發現PG結合點位于BSA的Trp213附近的疏水腔內(即BSA的亞域結構IIA中),此位置可結合大多數的小分子藥物。為進一步查看PG與BSA作用的微環境,列出了結合位點附近對結合作用貢獻較大的氨基酸殘基(圖8C),分別是Aeg208、Ala209、Ala212、Trp213、Leu346、Ala349、Lys350和Glu353。其中PG與Trp213在空間上非常靠近,距離僅為1.84 nm,與之前計算得到PG-BSA的結合距離1.71 nm非常接近。這也解釋了為什么PG與BSA結合會導致內源熒光發生淬滅的原因:PG通過結合到Trp213附近的疏水腔,引起周圍氨基酸殘基微環境發生變化,導致Trp213周圍包埋度增加,空間結構更加嚴密,從而表現出BSA內源熒光的猝滅變化。

3　結論

利用光譜法對蛋白結構改變進行研究,是比較經典的技術手段,本文通過應用光譜法,對PG和BSA的相互作用進行了較為詳細的考察和論述。研究發現PG對BSA的內源熒光產生了猝滅作用,進一步的光譜分析表明其猝滅機制是靜態猝滅,兩者通過形成藥物-蛋白復合物,使得BSA熒光峰值發生藍移。通過計算得到了其結合作用的結合常數、結合數等基本參數,在熱力學模型的指導下,還進一步得出了其作用力類型主要是氫鍵和范德華力,結合距離約為1.71 nm。根據Sudlow等[16]提出的探針取代方法,利用膽紅素和撲爾敏兩種結合在BSA不同位點的探針,對PG進行競爭結合后表明其結合部位與膽紅素一致,位于BSA上的亞域結構IIA,這一位點還可結合華法令、p-ABE、DNSA等小分子藥物,位于Trp213附近的疏水腔內,這一結果,與先前PG與HSA相互作用的結果非常類似[10]。經過遠紫外圓二色譜的測定發現PG對BSA的二級結構產生了影響。BSA是典型的α-螺旋結構為主的蛋白,氫鍵對其結構的穩定性維持是非常重要的,而遠紫外圓二色譜的結果表明BSA在PG存在的情況下,α-螺旋結構發生減少,無規則卷曲結構增加。同步熒光光譜結果表明PG與BSA的結合導致BSA的構象發生了一定程度的變化,表現為色氨酸殘基的環境極性減弱、疏水性逐漸增強,色氨酸殘基“包埋”狀態增加。這證明PG分子的確可以進入BSA的立體結構中,使得BSA構象發生變化。同時,采用分子對接的方式模擬PG與BSA的結合,通過計算自由能,推算了最佳結合構象,研究結果表明PG正是通過進入Trp213附近的疏水腔,與周圍氨基酸殘基相互作用,從而引起了BSA的上述一系列變化。其結合距離與之前熱力學模型所得計算值較為相符,能夠相互印證。此外本文還考察了在常見金屬離子的存在情況下,PG與BSA結合作用受到的影響,提出了PG-金屬螯合物的出現影響PG-BSA結合作用這一初步解釋。

本文通過研究PG與BSA的結合過程,初步闡明了PG與BSA的相互作用的基本信息,為PG在血液中的結合與運輸模式研究以及其作為食品抗氧化劑、藥物的設計和開發工作提供了理論基礎。

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Study on the interaction between propyl gallate and bovine serum albumin using fluorescence spectroscopy and molecular docking

ZHU Guo-fei1,TENG Teng2,DENG Bin1

(1.Guizhou Institute of Technology,Guiyang 550003,China;2.College of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

The interaction between propyl gallate(PG)and BSA was studied by the spectroscopy methodinvitro. The quenching mechanism was a static quenching procedure,and the binding constants KAbetween PG and BSA was obtained to be 1.03×105L·mol-1while the binding distance was calculated as 2.2 nm at 299 K. The thermodynamic calculations suggested the van der Waals interactions and the hydrogen bonds play a major part in the interaction between BSA and PG. The further study of binding site showed there was one PG-binding site in the subdomain IIA of BSA. CD spectroscopic further showed that drug complexation altered protein conformation by a major reduction ofα-helix inducing a partial protein destabilization. In addition,the result of autodocking for PG and BSA was simulated,and the parameters of the binding were accorded with the results of the calculation.

propyl gallate;bovine serum albumin;fluorescence spectroscopy;interaction

2016-04-11

朱國飛(1985-)，男，博士，副教授，研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail:1966243910@qq.com。

貴州省教育廳自然科學研究招標項目(黔教合KY字[2015]368)；貴州省科技合作計劃項目(黔科合LH字[2015]7102)。

TS202.3

A

1002-0306(2016)18-0158-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.022