地衣芽孢桿菌Bacitracin A高產工業培養基優化

徐　超,呂鳳霞,別小妹,陸兆新

(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

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地衣芽孢桿菌Bacitracin A高產工業培養基優化

徐超,呂鳳霞,別小妹,陸兆新*

(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

為了降低桿菌肽工業發酵生產成本,提高有效成分桿菌肽A產量,采用單因素實驗,尋找目前發酵培養基中黃豆粉與玉米粉的廉價替代成分,并通過Box-Behnken響應面法優化篩選后工業培養基。結果表明:小麥麩皮可以取代玉米粉與黃豆粉,作為發酵培養基中唯一有機碳氮源,有效降低發酵成本。響應面優化工業培養基為:麩皮50.3 g/L,硫酸銨1.53 g/L,磷酸二氫鉀1.43 g/L,在此條件下預測桿菌肽A最大產量為1.70 g/L。經實驗驗證,桿菌肽A產量可以達到1.78 g/L。使用優化后的培養基,發酵結束后,菌體芽孢數量及轉化率較高,芽孢數可以達到1.25×1011CFU/mL。本研究提供的培養基可同時達到高產,降低成本,高芽孢形成率的效果。

桿菌肽A,高產,響應面

飼料中添加微生態制劑,能夠改善動物腸道菌群平衡,提高動物免疫力,提高畜產品的質量[1-2]。芽孢是芽孢桿菌的休眠體,能夠幫助微生態制劑通過胃部低酸環境[3],到達腸道發揮作用。所以芽孢數是衡量芽孢桿菌類微生態制劑產品優劣的標準。地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis),能產生多種多肽類抗菌素[4],豐富的胞外酶[5-6]及生物活性物質[7],并且產生的物質對環境和有機體沒有危害,是FDA[8]公認安全菌株,桿菌肽[9]是由地衣芽孢桿菌產生的一種對革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌有廣譜抑制作用的環肽[10]。根據氨基酸組成和位置的不同,現已發現15種同系物,其中bacitracin A分子式為:C66H103N17O16S,是其中主要的活性物質,生物活性也最強[11]。桿菌肽有高效、無殘留及無毒副作用、不產生耐藥性及交叉耐藥性、排泄快等優點[12],因此桿菌肽及地衣芽孢桿菌微生態制劑廣泛應用于飼料農業[13-14]等。

桿菌肽發酵生產使用地衣芽孢桿菌,目前發酵生產培養基以玉米淀粉、豆粕粉、黃豆粉為主要的碳、氮源[15-16],發酵過程需要補料和控制pH,過程復雜能耗高而且培養基成本較高。一些研究通過代謝調控及基因工程可以提高桿菌肽的產量[17-19],但是包括培養基優化在內的研究均使用現有培養基,沒有對培養基成本進行考慮,成本較高。如果能夠找到取代黃豆粉和玉米粉的廉價培養基成分,并減少培養基組成,可以有效地降低生產成本,提高利潤。我國作為農業大國,有很多谷物加工的副產物,僅小麥麩皮的年產量就超過2000 t。如果能以谷物加工副產物取代黃豆粉與玉米粉,不但能提高低值副產品的利用率,還能大幅度降低桿菌肽生產成本,提高經濟效益。

麩皮作為谷物加工的主要副產物[20],有豐富的營養價值,可以為微生物生長代謝提供足夠營養物質。本文以麩皮為研究對象,探究了以麩皮為主要碳氮源來發酵生產桿菌肽A的可能性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

出發菌株菌種實驗室保存地衣芽孢桿菌F2-X1;桿菌肽標準品(桿菌肽A含量47.1%)德國Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈、三氟乙酸色譜純，德國默克公司;其他試劑均為分析純,國藥集團;種子培養基(g/L)酵母膏5.0,胰蛋白胨10.0,氯化鈉10.0,pH調至7.0,1.00×105Pa滅菌30 min;發酵培養基(g/L)黃豆粉40.0,玉米粉15.0,硫酸銨1.0,磷酸氫二鉀0.40,pH調至7.0,1.00×105Pa滅菌30 min。

TOMY SX-700高壓蒸汽滅菌鍋日本TOMY公司;PYX-DHS-50X65隔水式電熱恒溫培養箱上海躍進醫療器械廠;全溫搖瓶柜江蘇太倉實驗設備廠;電子精密天平北京賽多利斯天平有限公司;AY120萬分之一天平日本島津公司;超凈工作臺蘇凈集團安泰公司;804R高速冷凍離心機Eppendorf公司;pH計美國Orion公司;LABOROTA-4001旋轉蒸發儀德國Heidolph公司;Dionex UltiMate 3000高效液相色譜系統美國賽默飛公司。

1.2實驗方法

1.2.1桿菌肽A的HPLC檢測

1.2.1.1HPLC條件以A:水+0.1%三氟乙酸;B:乙腈+0.1%三氟乙酸,為流動相進行梯度洗脫,其中,A相由30%線性增長為40%,時間為20 min。進樣量20 μL,檢測波長為220 nm,柱溫25 ℃。

1.2.1.2標準曲線的繪制精密配制濃度為2.00、1.00、0.80、0.60、0.40、0.20 g/L桿菌肽標準溶液,HPLC檢測峰面積,每個濃度檢測3次。以桿菌肽A峰面積平均值為縱坐標,桿菌肽A濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

1.2.2不同培養基發酵效果比較用接種環挑取斜面保藏菌種,接種于種子培養基,37 ℃,180 r/min培養12 h作為種子液。

分別以小米糠、米糠、小麥麩皮取代發酵培養基中的玉米粉和黃豆粉,添加量均為55.0 g/L,其他成分不變,裝于250 mL三角瓶中,裝液量為50 mL,接種量1%,37 ℃,180 r/min培養48 h。發酵結束后,取10 mL發酵液10000 r/min,4 ℃離心10 min除菌體和殘渣,取上清加兩倍體積乙醇振蕩30 min,離心,取上清過0.22 μm濾膜,HPLC法檢測桿菌肽A產量。每組實驗重復3次。不同培養基成分見表1。

表1　不同培養基組成

1.2.3單因素實驗以1.2.2中4號培養基為基礎培養基,進行單因素實驗。發酵條件與1.2.2所述相同,發酵結束后HPLC法測定桿菌肽A產量,以考察不同成分的添加量的范圍,每組實驗重復3次。其中,麩皮添加水平為20.0、40.0、60.0、80.0 g/L;硫酸銨添加水平為0.50、1.00、1.50、2.00 g/L;磷酸氫二鉀添加水平為0.60、1.00、1.40、1.80 g/L。當麩皮、硫酸銨、磷酸二氫鉀水平分別變化時,另外兩個因素不變且添加量與1.2.2中4號培養基相同。

1.2.4響應曲面優化利用Design-Expert軟件,根據單因素實驗,以麩皮、硫酸銨、磷酸二氫鉀為自變量,以桿菌肽A產量為響應值,根據Box-Behnken中心組合實驗原理,設計三因素三水平實驗[17]。因素水平見表2。

表2　Box-Benhnken實驗因素與水平

1.2.5優化后培養基芽孢生成量使用文中1.2.4優化后培養基,37 ℃,180 r/min培養48 h,發酵結束后,取1 mL發酵液進行梯度稀釋,計算菌體數,記為A。另取1 mL發酵液,80 ℃水浴20 min,同樣進行梯度稀釋,計算芽孢數,記為B。計算芽孢轉化率。其中,轉化率(%)=A/B×100。

1.2.6數據處理實驗中數據處理采用Origin軟件,對實驗所得數據進行平均值及標準差計算。相應曲面實驗設計及統計分析使用Design-Expert軟件。

2　結果與分析

2.1桿菌肽A標準曲線

采用方法1.2.1所述桿菌肽A檢測方法,所得峰面積采用Origin軟件取平均值,以桿菌肽A峰面積平均值為縱坐標,桿菌肽A質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。得到線性回歸方程為y=23.45x-1.04,線性范圍為0.094～0.94 g/L,相關性系數為0.9991。

圖1　桿菌肽A標準曲線Fig.1　Standard curve of Bacitracin A

2.2培養基的確定

以不同種麩皮為主要碳氮源取代黃豆粉和玉米粉進行發酵,發酵結束后HPLC法檢測桿菌肽A產量,如圖2所示,其中小麥麩皮發酵產量達到1.41 g/L,高于黃豆粉、玉米粉培養基的1.31 g/L,表明,小麥麩皮可以取代黃豆粉與玉米粉。黃豆粉或玉米粉的價格是小麥麩皮3～5倍,現在生產用培養基中黃豆粉和玉米粉添加量在50.0 g以上,可以有效降低生產成本。

圖2　不同培養基產量Fig.2　Different medium composition

小麥麩皮效果明顯優于小米糠和米糠,而小米糠和米糠則達不到原有產量。當以不同麩皮進行1∶1配比時,產量同樣沒有黃豆粉、玉米粉培養基高,且遠低于小麥麩皮培養基。雖然麩皮、小米糠與米糠都是谷物加工過程中的副產物,主要營養成分種類基本相同,但含量之間存在差別,麩皮中碳水化合物含量在40%以上[21],而米糠和小米糠中碳水化合物含量低于30%。推測麩皮中的營養成分組成更適合地衣芽孢桿菌利用,并代謝產生桿菌肽A。所以選擇小麥麩皮為培養基主要碳氮源進行發酵生產桿菌肽A。

2.3單因素實驗

2.3.1麩皮添加量對桿菌肽A產量的影響本實驗培養基中沒有葡萄糖等速效碳源,因為速效碳源被菌體很快利用后,分解代謝產物對次級代謝酶類的合成有阻遏作用,只有這些速效碳源消耗盡之后,阻遏作用被解除,菌體才轉入次級代謝產物合成階段。而地衣芽孢桿菌可以產生纖維素酶[5]和蛋白酶[6],降解麩皮中的纖維素和蛋白類物質,為菌體生長提供有機碳氮源,也可提供桿菌肽合成的氨基酸前體。

從圖3可以看出,麩皮添加量對桿菌肽A產量有很大影響,當麩皮含量由20.0 g/L增加到40.0 g/L時,產量提高了1倍左右。因為實驗所用培養基成分簡單,麩皮為主要的營養成分且營養豐富[22],當培養基中麩皮含量較低時,不能達到地衣芽孢桿菌營養需求,所以在提高麩皮含量的同時,桿菌肽A的產量增加。當麩皮濃度從40.0 g/L增加到80.0 g/L時,桿菌肽A產量降低。這是因為過多的麩皮會增加培養基的粘稠度,使溶氧降低,地衣芽孢桿菌經次級代謝途徑產生桿菌肽A時,需要氧作為電子受體,所以麩皮含量過高時,限制桿菌肽A產生的主要因素變為溶氧[23]。同時溶氧過低也會導致菌體密度下降,進而影響次級代謝產物積累。

圖3　不同添加量麩皮對產量的影響Fig.3　The influence of different bran addition on the production

2.3.2硫酸銨添加量對桿菌肽A產量的影響硫酸銨添加量對桿菌肽A產量的影響如圖4所示,當硫酸銨添加量增加到1.50 g/L時,產量達到最大。在生長初期,麩皮中多肽或蛋白類物質沒有降解,無法提供有機氮源。氮源是微生物生長代謝所必須的元素,硫酸銨中銨離子可以為菌體生長和代謝提供無機氮源。

圖4　不同硫酸銨添加量對產量的影響Fig.4　The influence of different(NH4)2SO4addition on the production

2.3.3磷酸二氫鉀添加量對桿菌肽A產量的影響從圖5可以看出,隨著磷酸二氫鉀含量的增加,桿菌肽A產量先增加后降低,當添加兩位1.40 g/L時產量最高。磷酸鹽是地衣芽孢桿菌經非核糖體合成途徑合成桿菌肽[24]所必須的,氨基酸前體的活化及一些與代謝有關酶的合成都與磷酸根有關,而且添加量高與低都會抑制桿菌肽合成[25]。

圖5　不同磷酸二氫鉀添加量對產量的影響Fig.5　The influence of different KH2PO4addition on the production

2.4Box-Behnken實驗設計和響應面

2.4.1模型建立及顯著性檢驗以桿菌肽A產量為響應值,根據實驗結果,利用Design-expert軟件對數據進行二次回歸模擬,得到回歸方程:

桿菌肽A產量=1.60+0.33A+0.0028B+0.071C+0.024AB-0.094AC-0.13BC-0.31AA-0.098BB-0.14CC

表3　Box-Behnken實驗設計與結果

由表4可以看出,模型顯著,失擬項不顯著,模型的相關系數為R2=97.28%,調整后的R2=93.79%,模型能很好的預測發酵培養基組分與桿菌肽A產量的關系,可信度較高。因素A(麩皮)對桿菌肽A產量的線性效應是極顯著的(p<0.001),因素C(磷酸二氫鉀)的影響是顯著的(p<0.05)。BC的交互作用的顯著的(p<0.05)。

表4　方差分析

2.4.2響應面優化及分析由圖6～圖8可以看出，各因素對響應值(桿菌肽A產量)的影響。麩皮對桿菌肽A產量的影響最大,磷酸二氫鉀次之,硫酸銨最小。等高線圖中全部為橢圓形,表明個因素之間均有一定的交互作用。從圖6可以看出,當磷酸二氫鉀濃度一定的情況下,在麩皮含量較低時,隨著麩皮含量的增加,桿菌肽A的產量是增加的,當麩皮量增加到50.3 g/L時,隨著麩皮含量的增加,桿菌肽A的產量降低,二者存在交互作用。圖7表示了麩皮和硫酸銨的交互作用。在硫酸銨含量一定的情況下,桿菌肽A的產量隨麩皮含量的變化也是先增加后降低的,等高線的形狀為橢圓形,二者同樣有交互作用。圖8表示硫酸銨和磷酸二氫鉀的交互作用顯著。等高線磷酸二氫鉀的交點多于硫酸銨,表明磷酸二氫鉀的作用更明顯。當硫酸銨含量一定時,隨著磷酸二氫鉀含量的增加,桿菌肽A的產量先增加后降低,并且在不同的硫酸銨濃度下變化幅度存在差別,兩者交互作用明顯。

圖6　麩皮和磷酸二氫鉀對桿菌肽A產量影響Fig.6　Combined effects of barn and KH2PO4on the bacitracin A production

圖7　麩皮和硫酸銨對桿菌肽A產量影響Fig.7　Combined effects of barn and(NH4)2SO4on the bacitracin A production

圖8　硫酸銨和磷酸二氫鉀對桿菌肽A產量影響Fig.8　Combined effects of(NH4)2SO4 and KH2PO4on the bacitracin A production

2.5最佳培養基的確定及驗證

根據模型,得到的最佳培養基為:麩皮50.3 g/L,硫酸銨1.53 g/L,磷酸二氫鉀1.43 g/L,在此條件下預測最大產量為1.70 g/L。以此培養基進行發酵,桿菌肽A的產量為1.78 g/L,與預測值十分接近。

2.6芽孢形成量

發酵結束后,通過方法1.2.5所述方法計數,計算培養基中菌體數為(1.54±0.05)×1011CFU/mL,芽孢數為(1.25±0.04)×1011CFU/mL。芽孢轉化率達到了81%。菌體數與芽孢轉化率均在較高水平。有研究表明,與速效碳源缺乏的培養基相比,過多的速效碳源會導致生物量降低和能量利用率低[26-27]。本研究采用的培養基沒有速效碳源,碳源僅來自纖維素、淀粉等有機碳源降解產物,因此,有利于生物量的增加和能量利用率的提高,生物量的增加同時也增加次級代謝產物的積累,可以提高桿菌肽A的產量。有研究通過添加無機鹽來提高芽孢形成量[28],芽孢形成量為3.60×1010CFU/mL,低于本研究所用培養基。因為麩皮中有機氮源相對較少,實驗培養基中添加了無機氮源,有利于芽孢的形成。同時發酵過程中,由于胞外蛋白分泌較多及菌體密度較高,菌體處于低溶氧水平,也有利于芽孢形成[29]。

3　結論

麩皮可以很好的代替黃豆粉和玉米粉來發酵生產桿菌肽,以麩皮為主要碳氮源的工業化培養基價格低廉,可以降低生產成本。通過響應面法優化工業培養基,得到最佳配比為:為麩皮50.3 g/L,硫酸銨1.53 g/L,磷酸二氫鉀1.43 g/L,在此條件下桿菌肽A產量可以達到1.78 g/L。同時麩皮為主要碳氮源的培養基還可以實現高芽孢轉化率,芽孢數可以達到1.25×1011CFU/mL。因此,使用本實驗所優化培養基進行發酵,可達到高桿菌肽A產量,同時又實現了高芽孢生成量。在桿菌肽發揮效果的同時,產品還可以起到微生態制劑的效果。

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Optimization of bacitracin a high-yield industrial fermentation medium

XU Chao,LV Feng-xia,BIE Xiao-mei,LU Zhao-xin*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

In order to reduce the cost of bacitracin industrial fermentation,improve the bacitracin a production,single factor experiment was used to looking for cheap ingredients to replace soybean flour and corn flour. And screened industrial culture medium was optimized by the Box-Behnken response surface method. Results showed that,wheat bran could replace corn flour and bean flour,as carbon and nitrogen sources in fermentation medium,reduces the cost of fermentation medium cost. The screened medium was:bran 50.3 g/L,ammonium sulfate,1.53 g/L,potassium dihydrogen phosphate 1.43 g/L,the predicted maximum yield was 1.70 g/L under this condition. Through certification,Bacitracin A production could reach 1.78 g/L. This paper was found that,using the optimized medium,the ability of produce spore by bacterium was high,the number of spore could reach 1.25×1011CFU/mL. The culture medium could achieve high yield,cost down and high spore formation rate at the same time.

bacitracin A;high yield;response surface

2016-03-11

徐超(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：食品微生物及產物分析，E-mail：15063839264@163.com。

陸兆新(1957-)，男，教授，研究方向：酶工程、食品微生物、農產品加工，E-mail：fmb@njau.edu.cn。

國家科技部支撐計劃(2011BAD23B05)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)18-0197-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.029