產脂肪酶極端絲狀真菌的篩選及其酶學特性

金　鵬,黨愛麗,雷湘南,Suren Singh,劉曉光,*,王正祥,路福平,*

(1.天津科技大學化工與材料學院,天津 300457;2.天津科技大學生物工程學院,工業發酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457;3.南非德班理工大學應用科學學院,德班 4001)

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產脂肪酶極端絲狀真菌的篩選及其酶學特性

金鵬1,2,黨愛麗2,雷湘南2,Suren Singh3,劉曉光1,2,*,王正祥1,2,路福平2,*

(1.天津科技大學化工與材料學院,天津 300457;2.天津科技大學生物工程學院,工業發酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457;3.南非德班理工大學應用科學學院,德班 4001)

從南非德班市及其周邊地區采集的76個土樣中篩選得到99株嗜堿絲狀真菌和51株嗜熱絲狀真菌,利用橄欖油乳化法以及對硝基苯酚法篩選得到三株具有底物專一性的菌株F4-173、F4-262、F8-67,經ITS分子生物學鑒定方法分別鑒定為Aspergillusfumigatus、Penicilliumverrucosum、Penicilliumchrysogenum。其中,AspergillusfumigatesF4-173可專一性分解菜籽油,其最適作用條件40 ℃、pH8.0,PenicilliumverrucosumF4-262可專一性分解對硝基苯酚月桂酸酯,其最適作用條件為40 ℃、pH8.0,PenicilliumchrysogenumF8-67可專一性分解大豆油,其酶液最適作用條件為50 ℃、pH6.5。

脂肪酶,耐熱,耐堿,底物專一性,酶學特征

脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)是一種酯鍵水解酶,能在油水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交換等有機合成反應[1]。因其來源豐富、穩定性好、種類繁多、可改造性強等被廣泛應用[2]。尤其微生物來源的脂肪酶具有選擇性、穩定性、底物特異性、功能多樣性等特點,在洗滌劑、食品與飼料等工業生產及商業應用方面顯示出巨大的潛能[3-4]。其中堿性脂肪酶的添加可降低洗滌用品對環境的污染而使其備受關注。國外報道的堿性脂肪酶產生菌主要有假單胞菌[5]、芽孢桿菌[6-7]、無色桿菌[8]、不動桿菌[9]、毛霉[10]、圓弧青霉[11]、假絲酵母[12]等。由于許多工業用酶的催化反應過程要求耐受較高的溫度,因此可在高溫環境中篩選在高溫下有活性且熱穩定性好的脂肪酶產生菌。

Jiao-Jiao Shangguan[13]測得在大腸桿菌中表達的Aspergillusfumigatus脂肪酶基因對短鏈酯尤其是對硝基苯酚乙酸酯的分解能力較強。Kamariah Long[14]測定了四種曲霉屬菌種在非水相中對植物油的分解能力,從而確定了這四株菌的底物專一性。都是根據一種酶只能對一種底物或一類底物起催化作用,對其他底物無催化作用的底物專一性特點來實現對相應產酶菌株的篩選。

本研究以前期篩選自南非德班市的耐熱、耐堿絲狀真菌為基礎,分別采用橄欖油乳化法和對硝基苯酚法篩選具有底物專一性的脂肪酶的產生菌,進一步通過酶學特征的分析,獲得耐熱、耐堿的脂肪酶。這將有利于發掘酶學特性優良的新型脂肪酶,為脂肪酶的工業化應用提供更多的候選資源和研究基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

絲狀真菌的分離物篩選自南非德班市及其周邊地區,由本實驗室和南非德班理工大學合作團隊實驗室共同保藏;聚乙烯醇、橄欖油國藥集團化學試劑有限公司;菜籽油、花生油、大豆油市售油脂;對硝基苯酚索萊寶生物科技有限公司;對硝基苯酚丁酸酯(C4)、對硝基苯酚癸酸酯(C8)、對硝基苯酚月桂酸酯(C12)以及對硝基苯酚棕櫚酸酯(C16)Sigma公司,分析純;其它普通生化試劑國產分析純;種子培養基(g/L)土豆200 g,蔗糖20 g;發酵培養基(g/L)豆粕粉30 g,可溶性淀粉10 g,橄欖油10 g,硫酸銨1 g,磷酸氫二鉀2 g,硫酸鎂0.1 g。

多功能酶標儀瑞士TUCAN公司;紫外分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;Axiostar plus光學顯微鏡德國Zeiss公司;PTC-200PCR儀美國MJ公司;HB-100恒溫金屬浴杭州博日科技有限公司;瓊脂糖凝膠水平電泳系統北京六一儀器有限公司;凝膠成像儀美國SYNGENE;ZHWY211B控溫搖床上海志誠設備廠。

1.2實驗方法

1.2.1脂肪酶酶活的測定分別將前期篩選得到的99株嗜堿絲狀真菌和51株嗜熱絲狀真菌由培養斜面接種到含有50 mL種子培養基的250 mL三角瓶中,于34 ℃和50 ℃及200 r/min條件下培養48 h,制成液體菌種,然后按2%的接種量轉接到含有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中,在34 ℃和50 ℃及200 r/min下進行發酵實驗,每24 h取樣測定發酵液中脂肪酶的活力。

1.2.1.1橄欖油乳化法測定脂肪酶活力按照中華人民共和國國家標準(GB/T 23535-2009)進行。在測定條件下,1 mL固體酶粉(或1 mL液體酶),1 min水解底物產生1 μmol的可滴定的脂肪酸,即為1個酶活力單位,以U/g(U/mL)表示。

取99株嗜堿絲狀真菌34 ℃、200 r/min搖瓶培養96 h的發酵液和51株嗜熱絲狀真菌50 ℃、200 r/min搖瓶培養96 h的發酵液作為粗酶液,以橄欖油、菜籽油、花生油、大豆油四種油脂的乳化液為測定底物。

1.2.1.2對硝基苯酚法測定脂肪酶活力按照Thomas Vorderwullbecke對硝基苯酚法的改進方法進行測定[15],在測定條件下,1 mL固體酶粉(或1 mL液體酶),1 min釋放出1 μmol對硝基苯酚,即為1個酶活力單位(U)。

取99株嗜堿絲狀真菌34 ℃、200 r/min搖瓶培養96 h的發酵液和51株嗜熱絲狀真菌50 ℃、200 r/min搖瓶培養96 h的發酵液作為粗酶液測定脂肪酶活力,測定底物分別為對硝基苯酚丁酸酯、對硝基苯酚辛酸酯、對硝基苯酚月桂酸酯、對硝基苯酚棕櫚酸酯。

1.2.2具有底物專一性的脂肪酶的篩選分別選取橄欖油和三種天然油脂(菜籽油、大豆油、花生油)的乳化液作為底物,按照1.2.1.1方法進行酶活力測定。選取4種對硝基苯酚類酯:對硝基苯酚丁酸酯(C4)、對硝基苯酚癸酸酯(C8)、對硝基苯酚月桂酸酯(C12)、對硝基苯酚棕櫚酸酯(C16)作為底物,按照方法1.2.1.2測定脂肪酶酶活力。篩選具有底物專一性的脂肪酶。其中乳化液為4%聚乙烯醇溶液與油脂以3∶1(v/v)高速勻漿后的混合物。

1.2.3菌種鑒定

1.2.3.1形態學鑒定菌種經過一段時間培養后,觀察菌落的生長狀態,如菌落直徑、菌落顏色、菌落質地、滲出液和反面顏色等,再通過挑取菌絲體做顯微形態觀察切片,于普通光學顯微鏡下觀察,記錄菌種的顯微形態。

1.2.3.2ITS分子生物學快速鑒定分離物的鑒定采用分子鑒定法,方法按文獻[16]進行,所得到的ITS序列經NCBI-BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比對,構建進化樹,最終確定上述篩選到的菌株F4-173為Aspergillusfumigatus,F4-262為Penicilliumverrucosum,F8-67為Penicilliumchrysogenum。

1.2.4酶學特性

1.2.4.1最適作用溫度根據1.2.2的實驗結果確定最佳底物,在不同溫度條件下(嗜熱絲狀真菌來源的脂肪酶的測定溫度為30、40、45、50、55、60和70 ℃;嗜堿絲狀真菌來源的脂肪酶的測定溫度為20、30、35、40、45、50和60 ℃),分別按照1.2.1.1和1.2.1.2的方法,菌株AspergillusfumigatusF4-173、PenicilliumverrucosumF4-262和PenicilliumchrysogenumF8-67的發酵液作為粗酶液,在不同溫度下對其酶活進行測定,最大的酶活作為100%,其他的實際酶活除以最大酶活的百分數為相對酶活,并繪制溫度-相對酶活曲線。

1.2.4.2最適作用pH分別以菌株AspergillusfumigatusF4-173、PenicilliumverrucosumF4-262和PenicilliumchrysogenumF8-67的發酵液作為粗酶液,在不同pH條件下(嗜熱絲狀真菌來源的脂肪酶的測定pH為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0;嗜堿絲狀真菌來源的脂肪酶的測定pH為6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0),pH調節所用的緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀(pH5.0～9.0)和甘氨酸-氫氧化鈉(pH10.0)緩沖液。按照方法1.2.1.1、1.2.1.2測定脂肪酶活力,并繪制pH-相對酶活曲線。

1.2.4.3金屬離子對脂肪酶活性的影響分別以菌株AspergillusfumigatusF4-173、PenicilliumverrucosumF4-262和PenicilliumchrysogenumF8-67的發酵液作為粗酶液,分別在反應體系中添加1 mmol/L的金屬離子Fe2+、Ca2+、K+、Zn2+、Mg2+、Na+和Cu2+,按照1.2.1.1、1.2.1.2方法測定脂肪酶活力,研究其對脂肪酶活力的影響。

1.3數據處理

本文測得的ITS序列通過NCBI網站比對,通過MEGA 6.06 構建系統進化樹,相關實驗均設置三個平行實驗,數據分析借助Origin 8.0軟件處理完成,統計分析采用F檢驗法進行。

2　結果與分析

2.1產脂肪酶菌株的篩選及其底物專一性的測定

2.1.1橄欖油乳化法測定不同來源的脂肪酶的底物專一性根據1.2.1.1所示方法測定粗酶液的脂肪酶酶活力,部分測定結果如表1所示。

表1　采用橄欖油乳化法測定不同絲狀

由表1可知,F4-173可專一性分解菜籽油,菌株F8-67可專一性分解大豆油。其生長狀況如圖1所示,F4-173在PDA平板上培養,菌絲的顏色有綠色,分生孢子梗直立,頂端球形膨大,分生孢子串生于小梗頂端,輻射狀排列,單個的孢子球形,可初步鑒定為曲霉[17]。F8-67在PDA平板上培養,會產生大量的藍綠色孢子,在顯微鏡下,無明顯的特征,因此根據菌落形態可初步判定為青霉[18]。

圖1　F4-173和F8-67菌落形態和顯微結構Fig.1　Colony morphology and microstructure of the F4-173 and F8-67

2.1.2對硝基苯酚法測定不同來源的脂肪酶的底物專一性根據1.2.1.2所示方法測定粗酶液的脂肪酶酶活力,部分測定結果如表2所示。

表2　對硝基苯酚法測定不同絲狀真菌來源的

由表2可知,F4-262可專一性分解對硝基苯酚月桂酸酯,其生長狀況如圖2所示,F4-262在PDA平板上培養,會產生大量的藍綠色孢子,根據生長狀況以及顯微鏡下觀察菌絲、菌落形態可初步判定為青霉[18]。

圖2　F4-262菌落形態和顯微結構Fig.2　Colony morphology and microstructure of the F4-262

按照方法1.2.3.2,擴增菌株的ITS序列,在NCBI-BLAST網站進行同源性比對,利用MEGA 6.06構建菌株的ITS基因系統進化樹。結果表明,F4-173為Aspergillusfumigatus,F4-262為Penicilliumverrucosum,F8-67鑒定為Penicilliumchrysogenum。由圖3可見,Aspergillusfumigatus與Penicilliumverrucosum、P.chrysogenum雖然屬于不同的屬,但是遺傳距離相對較近。

圖3　菌株Aspergillus fumigatus、Penicillium verrucosum、P. chrysogenum的進化樹Fig.3　Phylogenetic tree of Aspergillus fumigatus，Penicillium verrucosum，P. chrysogenum

相對于報道比較多的細菌和酵母來說,除了產脂肪酶的耐熱絲狀真菌中疏棉狀嗜熱絲孢菌的研究較多[17-18]以外,具有專一性分解某類底物的產耐堿、耐熱脂肪酶絲狀真菌的報道較少。Paola Panizza[19]篩選得到Pseudomonassp.突變體,可專一性分解長鏈(C18)底物,Karel Stransky[20]測得Geotrichumsp.只對甘油三酯的sn-1(或sn-3)有特殊的水解能力,Matheus HM Avelar[21]從蓖麻子的種子中篩選得到可以催化分解植物油的脂肪酶,其對菜籽油的分解能力可達(96.1±2.3) U/g。由于菜籽油中含有的膽固醇很少或幾乎不含,適合于需控制膽固醇攝入量的人食用,但菜籽油中介酸含量較高,關于其是否會引起心肌脂肪陳菊和心臟受損暫時還存在很大爭議,本研究中PenicilliumverrucosumF4-173可專一性分解菜籽油,降低人們關于菜籽油食用的疑慮。

2.3酶學特征初步分析

2.3.1酶的最適作用溫度在pH=7.5測定不同溫度對AspergillusfumigatusF4-173,PenicilliumverrucosumF4-262和PenicilliumchrysogenumF8-67的酶液的影響。

結果如圖4所示,在一定的溫度范圍內,隨著溫度的升高,酶活力不斷升高,達到最適作用溫度后,酶活力隨著溫度的升高不斷減小。在50 ℃時,嗜熱絲狀真菌LichtheimiaramosaF8-67的酶液的酶活力最高,隨著溫度的升高或降低,酶活力快速下降,在30 ℃和70 ℃時,相對酶活力降為不足10%;嗜堿絲狀真菌AspergillusfumigatusF4-173和PenicilliumverrucosumF4-262酶液的最適作用溫度均為40 ℃,隨著溫度的升高,酶活力均快速下降,但溫度降低至35 ℃時,其酶活力仍能保持在70%以上。

圖4　溫度對不同來源脂肪酶活力的影響Fig.4　Effects of temperature on the activity of lipases from different fungi

2.3.2最適作用pH在40 ℃條件下,測定不同的pH對嗜堿絲狀真菌AspergillusfumigatusF4-173和PenicilliumverrucosumF4-262酶液的影響,在50 ℃條件下,測定不同的pH對嗜熱絲狀真菌PenicilliumchrysogenumF8-67的酶液的影響,結果如圖5所示。

圖5　pH對不同來源的脂肪酶活力的影響Fig.5　Effects of pH on the activity of lipases from different fungi

由圖5可知,隨著pH的增加,酶活力在不斷增加,達到酶的最適作用pH后,酶活力的大小隨著pH的增加而不斷減小,PenicilliumchrysogenumF8-67酶液的最適作用pH為6.5,在pH6.5周圍,酶活力變化較快,AspergillusfumigatusF4-173和PenicilliumverrucosumF4-262在pH8.0的條件下酶活力最高,在pH6.5～9.0范圍內測定脂肪酶酶活力,酶活力仍能達到60%以上。

2.4.3金屬離子對酶活力的影響在40 ℃、pH8.0條件下,測定終濃度為10 mmol/L的金屬離子對嗜堿絲狀真菌AspergillusfumigatusF4-173和PenicilliumverrucosumF4-262酶液的影響,在50 ℃、pH6.5條件下,測定測定終濃度為10 mmol/L的金屬離子對嗜熱絲狀真菌PenicilliumchrysogenumF8-67的酶液的影響。

圖6　不同金屬離子對酶活力的影響Fig.6　The influence of metal ions on the activity of lipases from different fungi

結果如圖6所示,有些金屬離子能增強酶活力,如K+、Cu2+對PenicilliumchrysogenumF8-67來源的脂肪酶的活力有促進作用,Fe2+、Cu2+對AspergillusfumigatusF4-173產生的脂肪酶的酶活有增強作用,K+、Zn2+對菌株PenicilliumverrucosumF4-262產生的脂肪酶有增強作用;有些金屬離子對酶的活力有抑制作用,如Na+對PenicilliumchrysogenumF8-67產生的脂肪酶酶活有抑制作用,K+、Ca2+對菌株AspergillusfumigatusF4-173來源脂肪酶的酶活有抑制作用,如Na+對菌株PenicilliumverrucosumF4-262來源脂肪酶的酶活有抑制作用。

3　結論

本研究獲得3株菌在極端環境下生長良好,Aspergillusfumigatus所產脂肪酶可專一性分解菜籽油,其最適作用條件是40 ℃、pH8.0,Penicilliumverrucosum可專一性分解對硝基苯酚月桂酸酯,其最適作用條件為40 ℃、pH8.0,Penicilliumchrysogenum可專一性分解大豆油,其酶液最適作用條件為50 ℃、pH6.5。

此3株產脂肪酶的絲狀真菌的報道較少。它們發酵產生的粗酶液可在耐熱、耐堿環境下分解底物,對進一步的菌種改造、操作方便、降低成本起到了非常重要的作用。本研究中對這3株菌產酶酶學特性的初步分析,為絲狀真菌來源的脂肪酶開發提供了研究基礎。

[1]Abhishek Kumar Singh,Mausumi Mukhopadhyay. Overview of Fungal Lipase:A Review[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2012,166:486-520.

[2]汪小鋒,王俊,楊江科,等. 微生物發酵生產脂肪酶的研究進展[J]. 生物技術通報,2008(4):47-53.

[3]Chung Hong Tan,Pau Loke Show,Chien Wei Ooi. Novel lipase purification methods-a review of the latest developments[J]. Biotechnology Journal,2015,1(10):31-44.

[4]Jing Su,Fengli Zhang,Wei Sun,et al. A new alkaline lipase obtained from the metagenome of marine spongeIrciniasp.[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2015,31:1093-1102.

[5]Badgujar KC,Pai PA,Bhanage BM. Enhanced biocatalytic activity of immobilizedPseudomo-nascepacialipase under sonicated condition[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering,2016,39(2)：211-221..

[6]Goomber S,Kumar A,Singh R. Point mutation Ile137-Met near surface conferred psychrophi-lic behaviour and improved catalytic efficiency toBacilluslipase of 1.4 subfamily[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2016,178(4):753-765

[7]Khurana J,Kumar R,Kumar A,et al. New insight into oldBacilluslipase:solvent stable mesophilic lipase demonstrating enzyme activity towards cold[J]. Molecular Microbiology and Biotechnology,2015,25(5):340-348.

[8]Toshifumi Miyazawa,Tomoyuki Yukawa,Takashi Koshiba,et al. Enzymatic resolution of 2-phenoxy-1-propanols through the enantioselective acylation mediated byAchromobactersp. lipase[J]. Biotechnology Letters,2001,10(23):1547-1550.

[9]Wang H,Zhong S,Ma H,et al. Screening and characterization of a novel alkaline lipase from Acinetobacter calcoaceticus 1-7 Isolated from bohai bay in china for detergent formulation[J]. Brazilian journal of microbiology,2012,43(1):148-156.

[10]Canilho N,Jacoby J,Pasc A,et al. Isocyanate-mediated covalent immobilization ofMucor-mieheilipase onto SBA-15 for transesterification reaction[J]. Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2013,112:139-145.

[11]Zhongbiao Tan,Jianfang Li,Minchen Wu,et al. Enhancing the thermostability of a cold-active lipase fromPenicilliumcyclopiumby in silico design of a disulfide bridge[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2014,173:1752-1764.

[12]Wikmark Y,Engelmark Cassimjee K,Lihammar R. Removing the active site flap in Lipase A fromCandidaantarcticaproduces a functional enzyme without interfacial activation[J]. Chembiochem,2015,[Epub ahead of print].

[13]Jiaojiao Shangguan,Yuqiang Liu,Fujun Wang,et al. Expression and characterization of a novel lipasefrom Aspergillus fumigatus with high specific activity [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2011,165:949-962.

[14]Kamariah L,Huda H N,Azlina M D,et al. Substrate specificity of lipases from four species of Aspergillus towards hydrolysis of homoacid triacylglycerols and vegetable oils in non-aqueous system[J]. Journal of tropical agriculture and food science,2006,34(1):103-109.

[15]江慧芳,王雅琴,劉春國. 三種脂肪酶活力測定方法的比較與改進[J]. 化學與生物工程,2007,24(8):72-75.

[16]陳源源,陳浩,石貴陽，等. ITS序列在酵母批量分子鑒定中的適用性[J]. 食品與發酵工業,2012,38(4):11-14.

[17]Madsen JK,S rensen TR,Kaspersen JD,et al. Promoting protein self-association in non-glycosylatedThermomyceslanuginosuslipase based on crystal lattice contacts [J]. Biochimica et Biophysica Acta,2015,12:1914-1921.

[18]Avila-Cisneros N,Velasco-Lozano S,Huerta-Ochoa S,et al. Production ofthermostablelipaseby Thermomyces lanuginosus on solid-state fermentation:selective hydrolysis of sardine oil [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2014,11(5):1859-1872.

[19]Panizza P,Cesarini S,Diaz P,et al. Saturation mutagenesis in selected amino acids to shift Pseudomonas sp. acidic lipase Lip I. 3 substrate specificity and activity[J]. Chemical Communications,2015,51(7):1330-1333.

[20]Stránsky K,Zarevúcka M,Kejík Z,et al. Substrate specificity,regioselectivity and hydrolytic activity of lipases activated from Geotrichum sp.[J]. Biochemical Engineering Journal,2007,34(3):209-216.

[21]Avelar M H M,Cassimiro D M J,Santos K C,et al. Hydrolysis of vegetable oils catalyzed by lipase extract powder from dormant castor bean seeds[J]. Industrial Crops and Products,2013,44:452-458.

Isolation and preliminary characterization of lipases from fungi in extreme environments

JIN Peng1,2,DANG Ai-li2,LEI Xiang-nan2,Suren Singh3,LIU Xiao-guang1,2,*,WANG Zheng-xiang1,2,LU Fu-ping2,*

(1.College of Chemical Engineering and Materials Science,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;3.Department of Biotechnology & Food Technology,Faculty of Applied Sciences,Durban University of Technology,Durban 4001,South Africa)

From 76 soil samples,collected in South Africa,99 basophilic filamentous fungi strains and 51 thermophilic filamentous fungi strains were screened. Two measuring methods,including olive oil emulsification and p-NPP,had been used to test the activity of lipase and three filamentous fungi strains had been selected for hydrolyzing special substrate. They were F4-173,F4-262 and F8-67,identified asAspergillusfumigatus,Penicilliumverrucosum,Penicilliumchrysogenumby the method of ITS,respectively. The result showed that the strain F4-173 could hydrolyze canola oil and its optimal temperature and pH were 40 ℃ and 8.0,the strain F4-262 could hydrolyze p-nrophenyl laurate and the optimal temperature and pH of the enzyme were 40 ℃ and 8.0,the strain F8-67 could only hydrolyze soybean oil and its optimal temperature and pH value for lipase activity were 50 ℃ and 6.5 respectively.

lipase;heat-resistance;alkali-resistance;substrate specificity;enzymatic characteristics

2016-02-22

金鵬(1976-)，女，副教授，研究方向：工業酶制劑與工業微生物，E-mail:jinpeng@tust.edu.cn。

劉曉光(1963-)，男，教授，研究方向：絲狀真菌，E-mail:liu_xg@tust.edu.cn。

路福平(1967-)，男，教授，研究方向：應用微生物與酶工程，E-mail:lfp@tust.edu.cn。

國家自然科學基金國際(地區)合作與交流項目(31461143026)；天津市國際交流與合作項目(14RCGHSY00181)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)18-0213-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.032