響應面法優化虎斑烏賊墨多糖提取工藝的研究

江茂旺,高曉蘭,韓慶喜,彭瑞冰,蔣霞敏

(寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211)

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響應面法優化虎斑烏賊墨多糖提取工藝的研究

江茂旺,高曉蘭,韓慶喜,彭瑞冰,蔣霞敏*

(寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211)

為了探究虎斑烏賊墨多糖的最佳提取工藝,以虎斑烏賊墨為原料,通過單因素實驗研究了加酶量、料液比、加熱溫度、加熱時間和pH對虎斑烏賊墨多糖提取率的影響,在此基礎上對加酶量、料液比、加熱溫度和pH進行響應面優化。實驗結果表明:最佳組合為加酶量46 mg/g、料液比1∶19.7 g/mL、溫度54.1 ℃、pH9.0、加熱時間4 h,此時多糖得率高達2.140%。

虎斑烏賊,墨多糖,提取,響應面法,多糖得率

烏賊墨多糖(Squid ink polysaccharides,SIP)是一種新型海洋生物活性多糖,具有特殊結構及多種生物學功能,包括抗菌[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3-4]、抗癌[5]、化療保護及增強免疫力[6-7]等功能。同時,谷毅鵬等[8-9]研究得到通過SIP作用環磷酰胺對睪丸、卵巢的氧化損傷,能夠顯著抑制環磷酰胺導致超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活力降低和卵泡刺激素、黃體生成素等含量升高。烏賊墨多糖脫蛋白工藝研究表明[10],采用Sevag-酶法進行多糖脫蛋白處理效果較好,其作用較溫和,對多糖損失率及活性影響較小;而三氯乙酸酸性較強、作用劇烈,會導致多糖含量降低及活性物質的降解,從而影響多糖提取率及其活性。目前有關烏賊墨多糖提取方法及工藝的研究鮮有報道,僅見于吳金龍[11]、孫楠楠[12]采用正交實驗對曼氏無針烏賊(Sepiallamaindroni)和金烏賊(Sepiaesculenta)烏賊墨多糖進行提取。

虎斑烏賊(Sepiapharaonis)隸屬軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、烏賊科(Sepiidae)和烏賊屬(Sepia),是我國東海、南海重要的經濟頭足類[13]。其具有個體大(體重可達5 kg以上)、生長快、墨囊重達100 g以上等特點,是一種極具養殖發展前景的品種,國內外學者研究主要集中在營養成分[14]、繁殖生物學[15-16]和養殖技術[17]等方面。而在食品加工過程中,烏賊墨常作為廢棄物被處理,其藥用價值和潛在的經濟價值沒有得到較好的利用,值得進一步研究開發。有關虎斑烏賊墨多糖提取工藝未見報道,因此,本文采取單因素實驗和響應面優化法進行了烏賊墨多糖的提取工藝研究,為虎斑烏賊墨的綜合利用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

AEL-40SM型分析天平日本島津公司;S.HH.W21型三用電熱恒溫水浴箱北京長安科學儀器廠);GTSONIC-L3型超聲清洗機廣東固特超聲股份有限公司;UV-3900型紫外可見分光光度計日本日立公司;KDC-160HR型高速冷凍離心機科大創新股份有限公司中佳分公司;N-1000型旋轉蒸發儀托普儀器有限公司;FD-1A-50型真空冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司;-86 ℃超低溫冰箱Eppendorf Premium U570艾本德中國有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1虎斑烏賊墨多糖的提取將-80 ℃冷凍烏賊墨囊取出,放入冰箱(4 ℃)條件下解凍完全,用解剖刀剪開墨囊,去囊膜,取1.00 g墨汁,用蒸餾水調和墨汁成底物,取1L、10 mol/L的NaOH和1 mol/L的 HCl調節pH至8.0,超聲處理后,選取堿性蛋白酶,放入水浴鍋進行酶解。酶解后迅速放入100 ℃水浴中滅酶10 min,冷卻至室溫,采用高速冷凍離心機進行離心(8000 r/min)10 min,取上清液,加1/4(v/v)15%三氯乙酸,4 ℃冷藏12 h,旋轉蒸發至體積小于1/5,調節pH為7,加入4倍體積無水乙醇,4 ℃冷藏12～16 h,再冷凍離心(8000 r/min)10 min,棄上清液,采用真空冷凍干燥機冷凍干燥24～48 h,得到粗多糖樣品[18-19]。

1.2.2虎斑烏賊墨多糖得率的測定采用苯酚-硫酸法測定樣品中多糖含量[20]:用水溶解一定量粗多糖產物,定容至50 mL,取0.2 mL于25 mL比色管中,以蒸餾水補至2 mL,依次加入5%苯酚液1.0 mL、濃硫酸5.0 mL混勻。室溫靜置30 min后,490 nm處測定吸光度值,吸光度與多糖換算回歸方程為:C=0.1231A+0.0012,R2=0.9956;其中C為吸光值,A為葡萄糖含量(mg/mL)。

1.2.3單因素實驗設計

綜上所述，在進行公路道路施工的時候，通過運用改性瀝青，能夠顯著的提升公路的質量，因此，其有著十分廣闊的發展空間。通過對改性瀝青進行使用，能夠有效的提升路面的抗壓性，以此來延長其使用壽命，減少各種不必要的維護費用。除此之外，在運用改性瀝青的時候，相關的工作人員務必要對其進行精心的拌和以及運輸，盡自己最大的努力來避免由于操作不當而造成改性瀝青的性能出現下降的情況。

1.2.3.1不同加酶量對虎斑烏賊墨多糖得率的影響選取加酶量(堿性蛋白酶的質量與底物質量的比值)35、40、45、50、55 mg/g五個梯度,放入水浴鍋進行酶解,控制料液比1∶15 g/mL、溫度50 ℃、酶解時間4 h。

1.2.3.2不同料液比對虎斑烏賊墨多糖得率的影響選取料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL五個梯度,固定加酶量為45 mg/g,加熱溫度為50 ℃,加熱時間4 h,pH為8,其他條件同1.2.1。

1.2.3.3不同加熱溫度對虎斑烏賊墨多糖得率的影響選取加熱溫度為40、45、50、55、60 ℃五個梯度,加酶量為45 mg/g,料液比為1∶20 g/mL,加熱時間4 h,pH為8,其他條件同1.2.1。

1.2.3.4不同加熱時間對虎斑烏賊墨多糖得率的影響選取加熱時間為1、2、3、4、5 h五個梯度,加酶量為45 mg/g,料液比為1∶20 g/mL,加熱溫度為55 ℃,pH為8,其他條件同1.2.1。

1.2.3.5不同pH對烏賊墨多糖得率的影響選取pH為7.0、8.0、9.0、10.0和11.0五個梯度,加酶量為45 mg/g,料液比為1∶20 g/mL,加熱溫度為55 ℃,加熱時間為4 h,其他條件同1.2.1。

1.2.4響應面實驗設計由單因素實驗結果,選取加酶量、料液比、加熱溫度和pH四個因素,根據Box-Beknhen中心組合實驗設計原理,設計4因素3水平的響應面實驗,響應面實驗因素與水平見表1。

表1　響應面實驗因素與水平表

1.3數據分析與統計

所有實驗重復三次,實驗數據采用Excel 2003和SPSS 17.0統計分析軟件進行相關分析,以p<0.05作為差異顯著性判斷標準;Box-Beknhen實驗設計和結果分析采用Design-Expert 8.0.6軟件。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1不同加酶量對虎斑烏賊墨多糖得率的影響由圖1可知,在加酶量為45 mg/g,多糖得率達到最高(1.63%±0.06%),并與其他加酶量條件時提取率差異極顯著(p<0.01),隨著加酶量的增加,多糖得率出現先增后減的趨勢,這與孫楠楠等[10]報道一致。加酶量過少底物反應不充分,多糖得率不足;加酶量過多會造成堿性蛋白酶浪費,增加成本投入。故根據實驗結果,選取加酶量為45 mg/g作為響應面考察條件。

圖1　加酶量對虎斑烏賊墨多糖得率的影響Fig.1　Effect of enzyme dosage on extraction yield of Sepia pharaonis squid ink polysaccharides注:圖中不同字母表明差異性顯著(p<0.05),相同字母表示無顯著性差異(p>0.05),圖2～圖5同。

2.1.2不同料液比對虎斑烏賊墨多糖得率的影響由圖2可知,隨著料液比的增加,多糖得率出現先增后減的趨勢,當料液比達到1∶20 g/mL,多糖得率達到最高(1.65%±0.04%),并與其他料液比條件時提取率差異顯著(p<0.05),這與孫楠楠等[10]報道一致。料液比太高,會使酶的作用濃度減少,影響酶解效率;同時會引起后續操作體積過大而增加消耗。故根據實驗結果,選取料液比為1∶20 g/mL作為響應面考察條件。

圖2　料液比對虎斑烏賊墨多糖得率的影響Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of Sepia pharaonis squid ink polysaccharides

2.1.3不同加熱溫度對虎斑烏賊墨多糖得率的影響由圖3可知,當水解溫度為55 ℃,多糖得率達到最高(1.92%±0.03%),并與其他加熱溫度條件時提取率差異極顯著(p<0.01),這與孫楠楠等[10]報道一致,隨著溫度的升高,多糖得率出現先增后減的趨勢。可能是因為酶解溫度較低時,堿性蛋白酶的水解活性較低,同時溫度較低時化學反應速率較低;當溫度過高會影響酶活，同時會增加多糖的降解,多糖得率反而會下降。故根據實驗結果,選取加熱溫度55 ℃作為響應面考察條件。

圖3　加熱溫度對虎斑烏賊墨多糖得率的影響Fig.3　Effect of reaction temperature on extraction yield of Sepia pharaonis squid ink polysaccharides

2.1.4不同加熱時間對虎斑烏賊墨多糖得率的影響由圖4可知,隨著加熱時間增加,多糖得率出現先增后減的趨勢,在加熱時間為4 h時,多糖得率最高(1.89%±0.08%),這與吳金龍等[9]報道一致。但隨著加熱時間增加,多糖得率差異不顯著(p>0.05)。故實驗中選擇4 h進行多糖的萃取,并且不作為響應面考察條件。

圖4　加熱時間對虎斑烏賊墨多糖得率的影響Fig.4　Effect of reaction time on extraction yield of Sepia pharaonis squid ink polysaccharides

2.1.5不同pH對烏賊墨提取率的影響由圖5可知,pH為9時,多糖得率最高(1.93%±0.05%),并與其他pH條件時提取率差異顯著(p<0.05),說明烏賊墨多糖在pH為9時,穩定性及溶解性較好。pH過高、過低都會使堿性蛋白酶的結構發生改變,水解速率下降,對多糖得率影響較大。故根據實驗結果,選取pH=9作為響應面考察條件。

圖5　pH對虎斑烏賊墨多糖得率的影響Fig.5　Effect of pH on extraction yield of Sepia pharaonis squid ink polysaccharides

2.2響應面優化實驗設計

2.2.1響應面模型的建立采用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗數據進行處理,實驗數據通過二次多項式逐步回歸擬合,得到二次多元回歸模型:PY=2.15+0.034A-5.83310-3B-0.039C-0.012D+0.04AB+0.022AC+0.09AD+0.29BC-0.17BD-0.088CD-0.086A2-0. 42B2-0.17C2-0.33D2,R2=0.9937。

表2　響應曲面法優化實驗設計及結果

2.2.2回歸模型的方差分析對該模型進行方差分析,由(表3)可知,模型F=158.54,p<0.0001,說明所用模型具有高的顯著性。失擬項不顯著(p>0.05),表明失擬項相對于純誤差來說不顯著,該失擬項說明模型的擬合性較好,可以用于模型分析。其中決定系數R2=0.9937,表明超過99.37%的實驗數據可用該模型進行解釋,說明該模型的擬合程度高,可靠性強。在一次項中,A、C具有極顯著的影響(p<0.01),其他因素影響不顯著,由F值可知,各因素對多糖得率的影響大小依次為:加熱溫度>加酶量>pH>料液比;在二次項中,加熱溫度、提取液pH達到極顯著水平(p<0.01);在交互項中,AB、AC、AD、BC、BD對提取率的交互作用顯著(p<0.05),而其他因素之間的交互作用不顯著。表明各實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系,而是呈二次關系。

表3　回歸模型的方差分析結果

2.2.3響應曲面分析

2.2.3.1加酶量和料液比之間的交互作用的分析由圖6可知,加酶量不變的條件下,料液比在1∶10～1∶20增大時,多糖得率急劇增加,并在1∶20附近達到極大值后緩慢降低,與單因素實驗結果吻合;而料液比不變時,多糖得率隨加酶量無明顯變化。由回歸模型的方差分析可知,加酶量對多糖得率影響是明顯的(p<0.01),料液比對多糖得率影響卻是不明顯的(p=0.5292)。

圖6　加酶量和料液比對多糖得率影響的響應面圖Fig. 6　Response surface graph of enzyme dosage and solid-liquid-ratio on the degree of polysaccharide yield

2.2.3.2加酶量和加熱溫度之間的交互作用的分析由圖7可知,加酶量不變的條件下,隨加熱溫度的提高,多糖得率呈現先增加后降低趨勢;而當加熱溫度不變時,多糖提取量隨加酶量的增加呈現逐漸增加趨勢,但增速趨緩。由回歸模型的方差分析可知,加酶量與加熱溫度間的交互作用顯著(p<0.01);且等高線沿加酶量和加熱溫度軸向方向較溫度的密集,說明加酶量和加熱溫度對多糖得率影響都較大。

圖7　加酶量和加熱溫度對多糖得率影響的響應面圖Fig.7　Response surface graph of enzyme dosage and reaction temperature on the degree of polysaccharide yield

2.2.3.3加酶量和pH之間的交互作用的分析圖8與圖6變化趨勢接近,加酶量不變的條件下,pH在7～9增大時,多糖得率急劇增加,并在9附近達到極大值后降低,與單因素實驗結果吻合;而pH不變時,多糖得率隨加酶量無明顯變化。由回歸模型的方差分析可知,加酶量與pH間的交互作用顯著(p<0.01),等高線沿加酶量軸向方向比pH軸向密集,說明加酶量對多糖得率的影響度比pH的影響大。

圖8　加酶量和pH對多糖得率影響的響應面圖Fig.8　Response surface graph of enzyme dosage and pH on the degree of polysaccharide yield

2.2.3.4料液比和加熱溫度之間的交互作用的分析由圖9可知,料液比不變的條件下,隨加熱溫度的提高,多糖得率呈現先增加后降低趨勢,并在加熱溫度55 ℃、料液比1∶20達到極大值。由回歸模型的方差分析可知,料液比和加熱溫度間的交互作用顯著(p<0.01),等高線沿加熱溫度軸向方向比料液比軸向密集,說明加熱溫度對多糖得率的影響度比料液比的影響大。

圖9　料液比和加熱溫度對多糖得率影響的響應面圖Fig.9　Response surface graph of solid-liquid-ratio and reaction temperature on the degree of polysaccharide yield

2.2.3.5料液比和pH之間的交互作用的分析由圖10可知,當pH不變時,多糖得率隨料液比的升高而先上升后又下降,且在pH為9左右變化最顯著(p<0.01);當料液比不變時,隨pH10～11之間的增加,多糖得率迅速下降。由回歸模型的方差分析可知,料液比和pH間的交互作用顯著(p<0.01),等高線沿pH軸向方向比料液比軸向密集,說明pH對多糖得率的影響度比料液比的影響大。

圖10　料液比和pH對多糖得率影響的響應面圖Fig.10　Response surface graph of solid-liquid-ratio and pH on the degree of polysaccharide yield

2.2.3.6加熱溫度和pH之間的交互作用的分析由圖11可知,加熱溫度不變時,多糖得率隨pH增加呈現先增加后降低趨勢;pH不變時,多糖得率隨加熱溫度的增加呈現逐漸增加趨勢,但增速趨緩。pH和溫度的等高線圖接近圓形,說明二者之間的交互作用不顯著(p>0.05);等高線沿溫度軸向方向與pH軸差不多,pH和溫度對多糖得率的影響度程度相近。

圖11　加熱溫度和pH對多糖得率影響的響應面圖Fig.11　Response surface graph of reaction temperature and pH on the degree of polysaccharide yield

2.2.4驗證性實驗利用 Design-expert 8.0.6軟件求解回歸方程,得到烏賊墨多糖的最佳提取工藝條件為:加酶量45.92 mg·g-1、料液比1∶19.65 g·mL-1、加熱溫度54.1 ℃、pH=9.05,在此條件下烏賊墨多糖提取率理論可達2.158%。為檢驗該方法的可靠性,考慮到實際操作,將最佳工藝條件修正為:加酶量46 mg·g-1、料液比1∶19.7 g·mL-1、加熱溫度54.1 ℃、pH=9.0,在此條件下進行多糖提取的驗證實驗。3次平行實驗多糖的實際提取率分別為 2.153%、2.136%及 2.131%,平均值為2.140%,與理論預測值的相對誤差為0.83%,說明采用響應面法對虎斑烏賊墨多糖提取進行工藝優化具有實際可操作性。

3　結論

本實驗通過Box-Benhnken的中心組合設計響應面法建立了4 個影響因素(料液比、加酶量、提取溫度和pH)與響應值(多糖得率)相互作用的數學模型,采用三維圖優化了多糖提取指標,在實驗考察范圍內,各因素對烏賊墨多糖提取率的影響大小順序為:加熱溫度>加酶量>pH>料液比;最佳提取工藝參數為堿性蛋白酶加酶量46(mg/g)、料液比1∶19.7(g/mL)、提取溫度54.1 ℃、pH為9.0,多糖得率達到2.140%,與理論預測值的相對誤差為0.83%,說明采用響應面法對虎斑烏賊墨多糖提取進行工藝優化具有實際可操作性。

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Study on condition optimizing of extraction technique of squid ink polysaccharide fromSepiapharaonisby response surface methodology

JIANG Mao-wang,GAO Xiao-lan,HAN Qing-xi,PENG Rui-bing,JIANG Xia-min*

(School of Marine Sciences,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

To explore the optimum extraction conditions of squid ink polysaccharides fromSepiapharaonissquid ink,this study was conducted to provide a theoretical basis for the development and utilization of squid ink. By single factor tests,enzyme dosage,solid-liquid ratio,reaction temperature,reaction duration and pH were investigated. And on the basis of single factor tests,according to the(Box-Behnken)experimental design protocol,enzyme dosage,solid-liquid-ratio,reaction temperature,and pH were selected to the four factors and the response surface experiment was carried out by response surface analysis. The results showed that their optimal conditions were defined as follows:enzyme amount 46 mg/g,solid-liquid-ratio 1∶19.7,reaction temperature 54.1 ℃ and pH9.0. Under this condition,the polysaccharide yield was as high as 2.140%.

Sepiapharaonis;squid ink polysaccharides;extraction;response surface methodology;yield of polysaccharide

2016-01-06

江茂旺(1991-)，男，碩士研究生，研究方向:漁業資源開發與利用,E-mail:icandyjmw@qq.com。

蔣霞敏(1957-)，女，教授，研究方向:水產養殖與餌料生物培養,E-mail:jiangxiamin@nbu.edu.cn。

國家自然科學基金項目(41206114)；寧波市農業科技專項(2014C11001)；寧波市科技重點項目(2011C11002)。

TS254.1

B

1002-0306(2016)18-0261-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.041