殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗的保護作用及相關代謝產物的影響

王夢雨，王文霞，趙小明，尹 恒

(1.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧大連 116023； 2.中國科學院大學，北京 100049)

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殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗的保護作用及相關代謝產物的影響

王夢雨1，2，王文霞1，趙小明1，尹 恒1

(1.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧大連 116023； 2.中國科學院大學，北京 100049)

為了解殼寡糖對低溫脅迫下小麥的保護作用，對兩個小麥品種(小偃22和西農9871)幼苗噴施100 mg·L-1殼寡糖和0℃低溫脅迫96 h，檢測葉片的損傷面積及丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、還原糖含量，并調查復溫后返青率。結果表明，與常溫對照組相比，低溫脅迫48 h后殼寡糖處理的小麥葉片損傷面積和丙二醛含量增幅較低，其中小偃22和西農9871的損傷面積相對于低溫對照分別減少了25.3%和28.8%，丙二醛含量分別降低了16.9%和33.7%；同時，兩個品種葉片脯氨酸含量分別提高了15.8%和26.7%，還原糖含量分別提高了25.6和14.3%，可溶性糖含量也表現出增高的趨勢。經過復溫培養，殼寡糖處理下小偃22和西農9871的返青率分別提高了4.6%和5.9%。說明殼寡糖可通過促進小麥苗脯氨酸、還原糖等低溫抗性相關次生代謝物的表達，提高其對低溫寒害的抵抗能力。

殼寡糖；小麥；低溫脅迫；次生代謝物

低溫凍害是農業生產中主要的自然災害之一，嚴重影響作物正常的生長發育和經濟產量[1]。冬小麥是我國北方主要的糧食作物，因其冬前播種、越冬休眠、冬后返青拔節的生長特點，極易受到低溫凍害的影響[2-4]。低溫脅迫會使小麥的脂質過氧化，質膜結構受到破壞，造成光合作用效率降低，能量產生和物質合成受阻，同時為了維持正常的代謝活動，植株的呼吸作用增強，能量消耗增加，會嚴重抑制小麥的正常生長發育，甚至導致植株死亡，使小麥生產遭受巨大損失[5]。因此，研究能夠提高小麥抗寒性的技術手段，以保證植株正常生長發育，對小麥高產穩產具有重要意義。

殼寡糖[Chitooligosaccharide(COS)]是幾丁質脫乙?；?經酸解或酶解得到的可溶性堿性寡糖[6]，是一種具有植物激發子效應的天然產物，可誘導和提升植物對病蟲害的抗性，因而其應用效果和機制已經得到廣泛而深入的研究[7]。殼寡糖不僅可激發植物應對病蟲害的生物脅迫抗性，還可以提高植物的非生物脅迫抗性。研究表明，殼寡糖能夠誘導油菜等作物抗旱，干旱脅迫下噴施殼寡糖后油菜幼苗葉片凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度顯著提高[8]。殼寡糖對鎘脅迫下的小麥幼苗生長有促進作用，受到殼寡糖處理的小麥抗氧化酶活性顯著增加[9]。在低溫下殼寡糖處理后水稻幼苗的葉綠素含量和根系活力均顯著提高[10]。本實驗室的研究發現，殼寡糖對低溫脅迫下小麥有一定的保護作用，可以減少低溫對小麥產量造成的損失[11]，但殼寡糖的作用機制尚不明確。本試驗檢測了殼寡糖處理后麥苗在低溫脅迫下的損傷和次生代謝物含量的變化，以期揭示殼寡糖提高小麥低溫抗性的機制。

1　材料與方法

1.1材 料

供試小麥品種為小偃22和西農9871，均由西北農林科技大學農學院提供。殼寡糖粉劑由中國科學院大連化學物理研究所制備，用去離子水溶解后殼寡糖水溶液中脫乙酰度> 95%，聚合度為3～10。

1.2處理方法

1.2.1幼苗培養

小麥種子用去離子水浸種8 h后，播種于直徑15 cm、高18 cm的花盆中，盆中裝泥炭土與蛭石3∶1(v/v)的混合介質，泥炭土中有機質含量70%±5%，pH 5.0～6.0，胡敏酸含量40%±2%，總氮含量1%～2.5%，總P2O5含量0.3%，總K2O含量0.21%，總 Fe 含量1%～3%，C/N 15～20，C.E.C 80～150 me·100 mg-1(Panda peat，China)，每個花盆種植15棵麥苗。將麥苗置于氣候室內生長，生長條件：晝夜溫度22±1 ℃，晝夜時間16 h/8 h，光照強度400 μmol·m-2·s-1，相對濕度50%。待麥苗出現第4 片真葉(第三片葉全展)時，用15 mL濃度為100 mg·L-1的殼寡糖水溶液噴施葉片(濃度由之前的預試驗得到)，對照組噴施等量去離子水。噴施24 h后將殼寡糖和對照處理的一半小麥幼苗移入到低溫氣候室進行低溫脅迫。這樣形成4個處理組：常溫殼寡糖處理組、常溫對照組、低溫殼寡糖處理組和低溫對照組，各處理組重復3次。

1.2.2低溫脅迫處理

低溫脅迫從22 ℃始，以2 ℃·h-1的速率逐漸降溫至0 ℃。晝夜時間16 h/8 h，光照強度400 μmol·m-2·s-1。溫度降至0±1 ℃脅迫處理4 d，每2 d取樣一次，取樣時間為當天氣候室內進入白晝后的第2小時，樣品液氮凍存備用。

消費者食品安全意識淡薄。正是因為消費者食品安全意識淡薄，導致食品生產企業對食品質量安全不夠重視。當前，我國居民大多為中低收入消費者，他們的消費能力沒有那么高，并且尚未樹立正確的食品安全意識，在部分人的認知中，只追求低價格，輕視了食品的質量安全問題。

1.3測定項目與方法

1.3.1 葉片損傷面積的測定

低溫脅迫48 h后，利用Evans blue法[12]染色4個處理組，用ImageJ軟件計量葉片面積與染上顏色的損傷面積。損傷面積比率=染色面積/葉片面積×100%。

1.3.2代謝產物含量的測定

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸反應法測定[13]，脯氨酸含量采用磺基水楊酸比色法測定[14]，可溶性糖含量采用蒽酮法測定[15]，還原糖含量用3,5-二硝基水楊酸法[16]。

1.3.3小麥返青率的測定

幼苗培養與脅迫處理同1.2.1和1.2.2，各處理組分別取50株形態均一的小麥苗，經過4 d 0±1 ℃低溫脅迫后，放置于4±1 ℃培養室內平衡24 h，之后再放入22±1 ℃培養。小麥生長3 d后調查其存活的植株數。

返青率=返青株數/處理前株數×100%

數據用SPSS Statistics Program 19.0 (IBM,New York,USA)進行ANOVA 檢驗，利用最小顯著性差異法 (LSD，Least-significant difference)確定不同處理組之間的顯著性差異。

2　結果與分析

2.1殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗葉片損傷的影響

噴施殼寡糖和低溫脅迫48 h后，與低溫對照組相比，小麥品種小偃22和西農9871的葉片損傷程度分別降低了25.3%和28.8%，說明殼寡糖預處理后小麥的低溫抗性顯著提高。兩個品種對低溫均有明顯的反應，且存在顯著差異，經過低溫脅迫后，小偃22的葉片損傷程度比西農9871低59%(圖1和圖2)。

XY22: 小偃22；XN9871：西農9871；CK-NT: 常溫對照組；CK-LT:低溫對照組；COS-NT: 常溫殼寡糖處理組；COS-LT:低溫殼寡糖處理組。下同

XY22: Xiaoyan 22; XN9871: Xinong 9871; CK-NT: CK-normal temperature; CK-LT: CK-low temperature; COS-NT: COS-normal temperature; COS-LT: COS-low temperature. The same as below

圖1通過Evans blue染色法顯示低溫脅迫對小麥幼苗葉片的損傷

Fig.1Damage area of wheat seedling under low temperature stress detected by Evans blue

圖柱上的字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同

Different letters on the columns indicate the significant differences among the treatments at 0.05 level.The same as below

圖2殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗葉片損傷的影響

Fig.2Effect of COS on damage area of wheat seedling under low temperature stress

2.2殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗葉片丙二醛含量的影響

低溫脅迫后，小偃22和西農9871幼苗的丙二醛(MDA)含量均顯著上升(圖3)。低溫脅迫48 h時兩個小麥品種殼寡糖處理的MDA含量都顯著低于低溫對照組， 降幅分別為16.9%和33.7%。而低溫脅迫96 h時，殼寡糖處理與低溫對照組沒有顯著差異。兩個小麥品種MDA含量對低溫脅迫的反應有顯著差異，西農9871的MDA含量在低溫脅迫后均高于小偃22，而且這種差異無論經殼寡糖處理與否均存在。

2.3殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗葉片脯氨酸含量的影響

在常溫條件下噴施殼寡糖24 h后，小麥品種小偃22和西農9871的脯氨酸含量顯著提高，增幅分別為15.8%和26.7%，并且隨后續的生長，小麥的脯氨酸含量呈增加的趨勢。經過48 h的低溫脅迫，兩個品種殼寡糖處理的脯氨酸含量均顯著高于低溫對照組，增幅分別為7.7%和10.1%。經過96 h的低溫脅迫后，殼寡糖處理組和低溫對照組沒有顯著的區別。經過低溫脅迫48 h后，小偃22的脯氨酸含量比西農9871高26.1%，說明兩個品種的脯氨酸對低溫脅迫的響應存在顯著差異(圖4)。

圖3　殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗葉片 丙二醛(MDA)含量的影響Fig.3　Effect of COS on MDA content of wheat seedling under low temperature stress

圖4　殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗 葉片脯氨酸含量的影響Fig.4　Effect of COS on proline of wheat seedling under low temperature stress

2.4殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗葉片可溶性糖含量的影響

經殼寡糖處理24 h后，小偃22和西農9871的可溶性糖含量都無顯著性變化(圖5)。低溫脅迫48 h后，兩個小麥品種的可溶性糖含量較常溫對照組都顯著增加，增幅分別為25.6%和14.3%，而殼寡糖處理與低溫對照組相比表現出增加的趨勢，但沒有顯著性差異。在低溫脅迫96 h后，麥苗的可溶性糖含量相對于低溫48 h時有所降低，殼寡糖處理與低溫對照組也沒有顯著性差異。

2.5殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗葉片還原糖含量的影響

經殼寡糖處理24 h后，小偃22和西農9871的還原糖含量都比常溫對照組顯著提高，增幅分別為19.2%和14.1%(圖6)。經過低溫脅迫48和96 h后，兩個品種的還原糖含量表現出增加的趨勢，但殼寡糖處理組與低溫對照組相比都沒有表現出顯著性差異。而小麥品種間還原糖含量的差異比較明顯，小偃22在低溫脅迫48和96 h后比西農9871分別高出10.2%和12.5%。此外，常溫下不同處理組間還原糖含量沒有明顯的差異。

圖5　殼寡糖對低溫脅迫下小麥 幼苗葉片可溶性糖含量的影響Fig.5　Effect of COS on water soluble(WSS) sugar of wheat seedling under low temperature stress

圖6　殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗 葉片還原糖含量的影響Fig.6　Effect of COS on reducing sugar of wheat seedling under low temperature stress

2.6殼寡糖對低溫脅迫下麥苗返青率的影響

調查結果(圖7)表明，低溫脅迫96 h的麥苗再復溫3 d后，雖然兩個小麥品種都受到了嚴重的低溫損傷，但殼寡糖處理的小麥返青率明顯高于低溫對照組。其中，小偃22的返青率提高了的4.6%，西農9871的返青率提高了5.9%。

圖7　殼寡糖對低溫脅迫下小麥幼苗死亡率的影響Fig.7　Effects of COS on reviving rate of wheat seedling under low temperature stress

3　討 論

殼寡糖作為一種植物激發子，其作用機制已經得到廣泛研究。本研究結果表明，殼寡糖有增強小麥抗寒能力的作用。低溫會直接破壞細胞膜，造成細胞內物質的流失和細胞膜脂類的氧化，利用Evans blue染色和檢測脂質過氧化的產物MDA，可以顯示葉片細胞膜受到低溫損傷的程度[12-13]。本研究中，殼寡糖噴施處理的小麥在經過低溫脅迫后，受到的損傷面積明顯低于沒有經過殼寡糖處理的低溫對照組。此外，經過殼寡糖處理的小麥經過低溫脅迫后，生理生化指標的變化顯示出低溫抗性得到了增強。脯氨酸和糖含量的增加可以減弱低溫對植物組織液的冷滯效應，保證植物細胞中溶質的流動性[17]，同時脯氨酸合成過程中產生的NADPH及還原糖可以為細胞提供還原力[18-19]，降低低溫下產生的氧化自由基的損傷，并對維持低溫脅迫下光合作用的穩定起到重要作用。經過殼寡糖處理后，小麥脯氨酸合成量在低溫脅迫初始階段就顯著提高，說明殼寡糖可以促進小麥的脯氨酸合成，這為減少后續到來的低溫脅迫所造成的損傷提供了預保護的作用。這與干旱條件下油菜上殼聚糖的處理效果相一致。在本實驗中，殼寡糖對低溫脅迫下小麥的可溶性糖含量沒有顯著的影響，但經過96 h的低溫脅迫后，殼寡糖處理的小麥可溶性糖含量與低溫對照組相比有增高的趨勢。先前的研究顯示，殼寡糖對小麥的葉綠素含量有顯著的影響[9]，這表明殼寡糖可能存在保護低溫下植物光合作用，進而維持植株物質代謝的效應。殼寡糖處理后的小麥在低溫脅迫發生前就表現出較高的還原糖含量，這同樣為減少后續到來的低溫脅迫所造成的損傷提供了預保護的作用。

此外，通過考察小麥的返青率發現，經過低溫脅迫并復溫生長后，殼寡糖處理的麥苗成活率明顯高于低溫對照組，這直接表現了殼寡糖對小麥低溫抗性的提高效應。

在試驗中，小偃22表現出較強的低溫抗性，其低溫損傷水平明顯低于西農9871，同時各種有利于提高低溫抗性的次生代謝物含量也高于西農9871。經過殼寡糖處理后，西農9871的低溫損傷顯著減少，低溫抗性得到了顯著的提升，這說明殼寡糖對兩個小麥品種都有明顯增強低溫抗性的效果。

綜上所述，殼寡糖處理后可以減少小麥葉片受到的低溫損傷，增加植株脯氨酸、還原糖等次生代謝物的含量，提高了小麥經受低溫脅迫后的返青率，這些都說明殼寡糖可以增強小麥對低溫脅迫的抵抗能力。在低溫脅迫初始，植物未及啟動應對的調控機制，此時的低溫對植物傷害最嚴重[20]，而噴施處理后就顯著提高脯氨酸和還原糖含量，說明殼寡糖可以為小麥提供預保護的作用，以應對即將到來的低溫脅迫。這種效果為殼寡糖應用于早冬寒害和倒春寒提供了良好思路。為了更好地利用殼寡糖對小麥的低溫保護作用，其調控低溫抗性相關基因的作用機制、品種的響應差異以及小麥不同的生長階段的作用效果都有待進一步研究。

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Effect of Chitooligosaccharide on Reducing Cryoinjury and Improving Metabolite of Winter Wheat Seedlings under Low Temperature Stress

WANG Mengyu1,2,WANG Wenxia1,ZHAO Xiaoming1,YIN Heng1

(1.Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian,Liaoning 116023,China;2.University of the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

In order to study the effects of Chitooligosaccharide (COS) on protecting wheat from low temperature stress,two cultivars,Xiaoyan 22 (XY22) and Xinong 9871 (XN9871),were pretreated with 100 mg·L-1COS under 0 ℃ low temperature stress for 96 hours. The area of cold damage,the content of malonaldehyde (MDA),proline,water soluble sugar (WSS),reducing sugar and reviving rate were detected every 48 hours during the study. The results showed that COS decreased the low temperature damage area by 25.3% in XY22 and 28.8% in XN9871,respectively. Meanwhile,COS improved metabolite of the both wheat seedlings under the low temperature stress: the content of MDA was reduced by 16.9% in XY22 and 33.7% in XN9871; proline was increased by 15.8% in XY22 and 26.7% in XN9871; and reducing sugar was increased by 25.6% in XY22 and 14.3% in XN9871,respectively. In addition,the reviving rate raised by 4.6% in XY22 and 5.9% in XN9871,which revealed COS have remarkable effect on protecting wheat from low temperature stress. It is worth noting that the expression level of proline and reducing sugar in wheat seedling significantly accumulated when pretreated with COS in 24 hours before low temperature stress,which implied that COS provide pre-protection for wheat seedlings to the upcoming low temperature stress. The study indicates that COS could reduce cryoinjury and increase the secondary metabolism production of winter wheat seedlings under low temperature stress.

Chitosan oligosaccharides (COS); Wheat; Low temperature stress; Secondary metabolites

時間：2016-05-10

2015-12-01

2016-01-05

海洋公益性行業科研專項(201305016-2)；中科院青年創新促進會項目(2015144)；中國科學院科技服務網絡計劃-山東省主要設施蔬菜綠色安全種植及保鮮 (技術集成與示范KFJ-EW-STS-085)

E-mail：huawusuo@126.com

尹 恒(E-mail：yinhengi@dicp.ac.cn)

S512.1；S311

A

1009-1041(2016)05-0653-06

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160510.1625.034.html