補腎中藥復方對缺血性損傷大鼠薄型子宮內膜厚度及組織病理學的影響

李　楠　陳　梅　李　翡　孫　康

陜西中醫藥大學附屬醫院(咸陽712000)

?

·實驗研究·

補腎中藥復方對缺血性損傷大鼠薄型子宮內膜厚度及組織病理學的影響

李楠陳梅李翡孫康

陜西中醫藥大學附屬醫院(咸陽712000)

目的：觀察補腎中藥復方對缺血性損傷致薄型子宮內膜模型大鼠子宮內膜厚度及組織病理學的影響。方法：SD實驗大鼠隨機分為4組，分別為空白對照組、模型組、西藥組和中藥組。除空白對照組以外，其余3組均采用阻斷卵巢動脈的方法建立“缺血性損傷”薄型子宮內膜模型，造模成功后空白對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，西藥組給予小劑量阿司匹林灌胃，中藥組灌服補腎中藥復方，連續灌胃15d后處死。結果：模型組與空白對照組比較,子宮內膜厚度明顯萎縮變薄，其差異具有統計學意義；西藥組和中藥組的內膜厚度與模型組比較均增加，中藥組增加的幅度更顯著，差異有統計學意義，但與空白對照組比較，無統計學意義。同樣，中藥組與西藥組比較，雖然顯示出明顯增厚的趨勢，但差異無統計學意義。鏡下觀察模型組子宮內膜層變薄，腺體數量減少，排列疏松，間質致密、細胞變少、變小，血管分布稀疏。西藥組和中藥組子宮內膜腺體數量較模型組均明顯增加，間質血管分布密度集中。而中藥組內膜腺體及間質血管發育較西藥組成熟度更高。結論：阻斷卵巢血供后子宮內膜發生缺血性改變，可以導致內膜厚度變薄。補腎中藥復方在增加薄型子宮內膜厚度改善其組織形態中發揮著與小劑量阿司匹林相似且較優的效應。

30余年來，人類輔助生殖技術(Assisted reproduction technique，ART)經過不斷的發展成熟,給越來越多的不孕夫婦帶來了福音。然而在助孕周期中仍有相當一部分患者因為各種原因以失敗告終，其中子宮內膜過薄導致的子宮內膜容受性的改變是重要的原因之一。國外學者研究發現：子宮內膜血流減少與不明原因薄型子宮內膜發生有關。我們已通過阻斷卵巢動脈減少子宮內膜血供的方法成功建立了“缺血性損傷”薄型子宮內膜動物模型。本研究將基于此探討補腎中藥復方對該模型動物子宮內膜厚度及組織病理學的影響，旨在為補腎法及補腎中藥用于不孕癥及婦科內分泌疾病患者提供重要參考及依據。

1材料與方法1.1材料1.1.1實驗動物及分組:6-8周齡SD雌性大鼠，體重180-200g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，合格證號：合格證號：SCXK(陜)2012-003。大鼠被隨機分為4組：空白對照組、模型組、西藥組和中藥組，每組10只。

1.1.2 實驗藥物:補腎中藥復方組成：主要成分由紫河車、菟絲子、枸杞子、熟地、當歸、黃芪等共100g，藥物均為配方顆粒劑，購自陜西中醫藥大學附屬醫院。阿司匹林腸溶片(25mg/片，陜西白鹿制藥廠)。

1.1.3 主要試劑和儀器:蘇木素、伊紅染色液(碧云天生物技術研究所)；4%多聚甲醛、1%HCl-75%乙醇、堿液、80%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯、丙三醇、二甲苯、PBS(中國國藥集團)；冷凍切片機(Leica公司 CM3050S)；倒置顯微鏡(Leica公司 IX71)。

1.1.4 動物模型建立:運用10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/100g體重)麻醉大鼠，腹部常規消毒后，打開腹腔，暴露子宮，用微動脈夾阻斷雙側卵巢動脈血供20min，隨后恢復血流，逐層關腹，1個動情周期后進行實驗動物灌胃。

1.1.5 給藥方法和劑量:按照60kg成人與大鼠等效劑量比率為1:6，計算出大鼠灌胃劑量。中藥組：10g/kg·d，按1ml/100g灌胃；西藥組：小劑量阿司匹林0.5mg/kg·d，按1ml/100g灌胃；空白對照組及模型組每日灌服生理鹽水1ml/100g。各組大鼠連續灌胃15d后，剖腹取子宮。

1.2方法1.2.1大鼠子宮內膜厚度測定及組織病理學變化的觀察將大鼠斷頸處死，75%乙醇中浸泡消毒5-10min。無菌條件下，小心剖取大鼠子宮，-20℃保存。將大鼠子宮包裹于包埋劑后，于冷凍切片機上進行冷凍切片，設置切片厚度為5um。選取平整的切片進行HE染色。將切片于4%多聚甲醛中固定10～30s，水洗。染蘇木素3～5min，水洗。1%HCl-75%乙醇分化5～10s，水洗。堿水促藍20s，水洗。伊紅染色30～60s，水洗。80%乙醇洗3～5s，95%乙醇洗3～5s，無水乙醇洗3～5s，丙三醇封片。結果判定：子宮內膜厚度采用Leica Qwin Plus圖像處理軟件對HE染色后組織切片進行測量。形態學變化運用光鏡觀察子宮內膜厚度、腺體及螺旋動脈分布、腺上皮細胞形態、間質細胞形態變化。

2結果2.1各組大鼠子宮內膜厚度比較 模型組與空白對照組比較,子宮內膜厚度明顯萎縮變薄，其差異具有統計學意義(P<0.05),說明阻斷卵巢血供后子宮內膜發生缺血性改變，可以導致內膜厚度變薄。西藥組和中藥組的內膜厚度與模型組比較均增加，中藥組增加的幅度更顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，但與空白對照組比較，無統計學意義(P>0.05)。同樣，中藥組與西藥組比較，雖然顯示出明顯增厚的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1　各組大鼠子宮內膜厚度比較

注：與模型組比較，*P<0.05

2.2各組大鼠子宮內膜組織病理學變化與空白對照組比較，模型組子宮內膜層變薄，腺體數量減少，排列疏松，腺上皮細胞完整，呈單層立方上皮，間質致密、細胞變少、變小，大部分區域血管分布稀疏。西藥組和中藥組子宮內膜厚度及腺體數量較模型組均明顯增加，間質血管分布密度集中。而中藥組內膜腺體及間質血管發育較西藥組成熟度更高。 見圖1。

3討論胚胎成功的著床有賴于一定厚度的子宮內膜提供營養，這是良好妊娠結局的保證。相對于較厚的子宮內膜而言，排卵后子宮內膜厚度<7～8mm時其臨床妊娠率、繼續妊娠率均明顯降低，這一點被大量的臨床研究證實[1-5]。到底在種植窗口期子宮內膜厚度需要達到多少，才可以引起胚泡成功植入，目前對這一具體數值的界定尚不統一，多數學者認為子宮內膜厚度至少>7mm，是獲得妊娠的前提[6]，當內膜厚度<6mm則很難獲得妊娠[7]。 Richer[8]等曾對子宮內膜厚度與妊娠結局之間的關系進行研究：1294個IVF周期中，在排除患者的年齡和種植胚胎數及質量因素后，發現妊娠組HCG 日子宮內膜厚度較非妊娠組厚：內膜 6～8mm者妊娠率為53%，而內膜>16mm者妊娠率升高至77%，活產率或繼續妊娠率從44%增高到67%。近年來國內研究者也嘗試應用各種方法增加子宮內膜厚度以達到提高妊娠率的目的獲得成功[9-11]。由此證明子宮內膜的厚度是影響輔助生殖技術結局的關鍵因素之一。

目前有關薄型子宮內膜的確切發生機制尚不清楚，也無統一的診斷標準，因此近年來并未形成規范化的臨床治療方案。但國外研究者Mina[12-13]等人對薄型子宮內膜血流及內膜生長相關因子進行研究發現了內膜薄的共性特征：內膜血流阻力增加，血供減少導致腺上皮細胞發育受損以及血管內皮生長因子(VEGF)表達下降，后者分泌減少造成子宮內膜血管生長不良，進而又會影響內膜的血流。此過程循環往復，最終導致內膜生長受限表現為薄型子宮內膜。內膜阻力增加作為始動因素的原因不明，但通過給予改善血流的藥物后，內膜血流阻力下降，VEGF表達上調，子宮內膜增厚，進一步證實了子宮內膜缺血、血供減少是薄型子宮內膜的原因之一。

本研究基于上述薄型子宮內膜病理生理學機制，通過阻斷卵巢動脈有效減少子宮動脈的血液供應，使子宮內膜處于低流量灌注狀態建立薄型子宮內膜動物模型。實驗證明，與空白對照組比較,子宮內膜厚度明顯萎縮變薄，腺體數量減少，腺上皮細胞完整，呈單層立方上皮，間質致密、細胞變少、變小，血管分布稀疏。說明阻斷卵巢血供后子宮內膜發生缺血性改變，內膜厚度變薄、腺體及血管發育不良。在分別給予模型動物小劑量阿司匹林及補腎中藥復方后，兩組模型動物內膜腺體數量、間質血管密度、內膜厚度均增加。在促進子宮內膜厚度增加方面，雖然與小劑量阿司匹林相比較，無顯著性差異，但中藥組變化的趨勢更明顯。小劑量阿司匹林能使子宮血流增加，子宮內膜腺體面積、腺腔周長間質面積和腺/間比值增大，使內膜增厚，改善薄型子宮內膜容受性及容受性相關因子表達[14]，對增加胚胎種植率有一定的幫助，具有臨床應用價值。本研究結果表明，補腎中藥復方在逆轉薄型子宮內膜形態及功能中發揮著與小劑量阿司匹林相同且較優的效應。我們認為這與該復方具有的補腎填精，益氣養血的功效密不可分。方中紫河車為血肉有情之品，生精益血，溫補腎陽，溫和而滋養力強；枸杞子、熟地、菟絲子補益肝腎，生精助陽；黃芪為補中升陽之要藥，張錫純謂之：其補益之功能生肌肉；當歸養血活血，增加內膜生長的速度。全方補中有散，動靜結合，溫潤并行，諸藥合用，充分顯現了改善缺血后子宮內膜血流、增加內膜厚度的作用。

由于受到研究水平的限制，人們對薄型子宮內膜發生機制認識還很有限，文獻報道的各種治療手段也都處于嘗試性探索階段。這為具有悠久歷史及豐富經驗的中醫學提供了廣闊的研究空間。中醫藥非線性調節的特點對該疾病的治療已初步顯現出整體療效，但因其成分復雜，對其療效機制的研究、作用路徑及靶點的研究還有待于我們深入探討。

[1]孔娜,劉景瑜,陳華,等.子宮內膜厚度和形態對體外受精/單精子注射-胚胎移植結果的預測[J].臨床和實驗醫學雜志, 2013,(9):696-698.

[2]文華,李曉晴.HCG注射日子宮內膜厚度與IVF-ET臨床妊娠率的相關性[J].中國優生與遺傳雜志,2013,12(2):111.

[3] Paulson R J.Hormonal induction of endometrial receptivity[J].Fertil Steril, 2011,213:530-535.

[4]張合龍,李杭生,張少娣,等.厚度偏薄的子宮內膜對體外受精-胚胎移植及凍融胚胎移植妊娠率的影響[J].中國實用婦科與產科雜志,2011,(9):698-700.

[5]Ahlam,Al-Ghamdi,Serdar Coskun,et al.The correlation between endometrial thickness and outcome of in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET) outcome.Reprod Biol Endocrinol[J]. 2008,(6):37.

[6]Weissman A, Gotlieb L,Casper RF.The detrimental effect of increased endometrial thickness on implantation and pregnancy rates and outcome in an in vitro fertilization program[J].Fertil Steril,1999,71(1):147-149.

[7]Mikolajczyk M , Skizypczak J.Endometrial receptivity-can it diagnosed and controlled? And why does it matter? [J].Gnekol Pol,2014,85(2):149-153.

[8]Richer KS，Bugge KR, Bromero JG, et al. Relationship between and endometrial thickness and embryo implantation, based on 1294 cycles of invitro fertilization with transfer of two blastocust-stge embryos[J]. Fertil steria, 2007,87(1):53-59.

[9]趙詩藝,劉英,楊曉葵,等. 薄型子宮內膜凍融胚胎移植周期中應用雌二醇/雌二醇地屈孕酮的療效觀察[J].實用婦產科雜志,2015,31(4):270.

[10]薛惠英,仲紀祥,左陽花,等.盆底仿生物電刺激干預治療薄型子宮內膜患者的冷凍胚胎移植結局[J].生殖醫學雜志,2015,24(1):12.

[11]田小龍,陳薪,許麗娟,等. 他莫昔芬用于薄型子宮內膜患者凍融胚胎移植時子宮內膜準備的研究[J].中國實用婦科與產科雜志，2015,31(8):736.

[12]Mina I，Tamura H, Takasaki A, et al. Pathophysiologic features of “thin”endometrium[J].Fertility and sterility, 2009,91(4):998-1004.

[13]Akasaki A, Tamura H, Mina I, et al. Endometrial growth and uterine blood flow: a pilot study for improving endometrial thickness in the patients with a thin endometrium[J]. Fertility and sterility,2010,93(6):1851-1858.

[14]常亞杰. 輔助生殖技術周期中薄型子宮內膜的相關機制及臨床對策[J].實用雜志,2014,30(11):822.

(收稿2016-04-20;修回2016-05-16)

Effect of kidney-reinforcing recipe on the thickness and histopathology of thin endometrium caused by Ischemic injury models in experimental rats

Affiliated Hospital of Shaanxi University Of Chinese Medicine

(Xianyang 712000 )Li Nan Chen MeiLi Feiet al

Objective：To observe kidney-reinforcing recipe on the thickness and histopathology of thin endometrium caused by Ischemic injury models in experimental rats.Methods：SD rats werer andomly divided into four groups, respectively blank control group, model group ,western medicine group and Chinese medicine group. All groups were established animal model of thin endometrium caused by Ischemic injury, but blank control group. After established model, blank control group and model group were given intragastric administration normal saline. Western medicine group was given low-dosage aspirine. Chinese medicine group was given. Gastric volume was 1ml/100g. all animals were put to death after 15days.Results:compared with blank control group, the thickness of endometrium of model group was obvious atrophy thinning. The difference was significant.The endometrial thickness were increased both western medicine group and Chinese medicine group compared with model group, the latter increased more significant.there was no difference with blank control group. Although showed obvious thickening trend in chinese medicine group, but There was no statistically significant difference compared with western medicine group. It was observed that endometrium was thinn ing, gland was fewer, loosely arranged. The stoma was less dense and vascular distribution was sparse in microscope. The number of endometrial glands both western medicine group and Chinese medicine group compared with model group were significantly increased, interstitial vascular distribution was density and Chinese traditional medicine group of endometrial glands and stroma vascular development maturity was higher than western medicine group.Conclusion Endometrial Ischemic injury caused by temporary interrupting the ovary artery blood supply will lead to endometrial thickness thinning. Kidney-reinforcing recipe can increase the thickness and form of thin endometrium and play a similar to low-dose aspirin and a better effect.

Kidney-reinforcing recipeThin endometriumEndometrial thicknessHistopathology

*陜西省科技廳自然科學基礎研究項目(2013JQ4010)

補腎中藥復方薄型子宮內膜子宮內膜厚度組織病理學

R96

A doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.078

陜西省教育廳自然科學科研計劃項目(14JK1205)