加味柴芍六君方對大鼠胃癌前病變的影響及機制研究

蔣敏玲　江　偉　楊　鍵　范劍薇

桂林醫學院附屬醫院中醫科(桂林541515)

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加味柴芍六君方對大鼠胃癌前病變的影響及機制研究

蔣敏玲江偉楊鍵范劍薇

桂林醫學院附屬醫院中醫科(桂林541515)

目的：探討加味柴芍六君方對胃癌前病變大鼠胃竇黏膜組織的生長及Sky、突變型p53與Survivin蛋白表達的影響。方法：將120只大鼠平均分為6組，采用綜合造模法獲得胃癌前病變大鼠模型，用藥物干預16周后，觀察胃竇黏膜組織的生長情況，并用免疫組化法觀察胃竇黏膜組織細胞中Sky、突變型p53與Survivin蛋白的表達情況。 結果:藥物干預組胃竇黏膜組織腺體萎縮、腸上皮化生及不典型增生的發生率明顯較模型對照組低(P< 0.05)；藥物干預組胃竇黏膜細胞中Sky的水平顯著高于模型對照組(P< 0.05)；藥物干預組胃竇黏膜細胞中突變型p53與Survivin蛋白水平明顯低于模型對照組(P< 0.05)。 結論:加味柴芍六君方可以從病征和病因兩方面抑制或逆轉大鼠胃癌前病變的發生發展，具有標本兼治的效果。

胃癌占消化道腫瘤首位，我國屬高發區，每年新發現約40萬胃癌患者，占世界總發病人數的42%[1]，嚴重威脅著人民的健康。胃癌的發生是一個多因素、多步驟的漸進性過程，往往要經歷多年的胃癌前病變(PLGC)階段[2]。由于胃癌病因的多樣性和復雜性，針對病因的一級預防很難阻止胃癌的發生，而針對PLGC的二級預防則被認為是減少胃癌發生的根本措施。但PLGC的病因、發病機制復雜，涉及到多種發病因素和多條信號通路的紊亂，通過使用化學藥物往往無法同時針對多種發病因素和信號通路起作用，達到預防胃癌的作用。而中藥往往能針對胃癌前病變的多種病理變化起作用[3]，不僅能改善癥狀，而且對PLGC會部分逆轉，顯示出獨特的優勢。本研究室參考《醫宗金鑒》自擬加味柴芍六君方，在臨床胃癌前病變中療效較佳。本研究擬采用綜合造模法，應用免疫組化法，考察該藥方對PLGC模型大鼠胃竇黏膜組織的生長及Sky、突變型p53與Survivin蛋白表達的影響，揭示其抑制或逆轉PLGC發生發展的作用機制，為其臨床治療提供理論依據。

1 材料與儀器1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠120只(體重200±20 g)，桂林醫學院動物實驗中心提供。實驗動物許可證：SCXK(桂)2010-0001。

1.2 藥物 加味柴芍六君方(黨參、白術、茯苓、甘草、陳皮、法夏、柴胡、白芍、丹參、莪術、蒲公英、白花蛇舌草、半枝蓮)，藥物由桂林醫學院附屬醫院中藥房提供，為單味藥分裝顆粒劑；N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，批號：87070201，購于美國sigma aldrich公司；脫氧膽酸鈉，批號：D6750，購于美國sigma aldrich公司；鹽酸雷尼替丁膠囊，批號：20140401，廣東逸舒制藥有限公司；胃復春片，批號：A20140524，杭州胡慶余堂藥業有限公司。

1.3試劑 免疫組化Syk多克隆抗體試劑盒，批號：SAB1302523；抗Survivin多克隆抗體試劑盒，批號：SAB4105536；p53免疫組化S-P試劑盒：SAB3404726。均購于美國sigma aldrich公司。

1.4儀器 冷凍切片機，徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司；隔水式電熱恒溫培養箱，上海島析實業有限公司；電熱保溫箱，上海上器集團試驗有限公司；醫用冰箱，歐雪制冷設備有限公司；不銹鋼壓力鍋，美的電器有限公司；1000瓦電爐，江蘇恒力爐業有限公司；光學顯微鏡，美國bruker公司；圖像分析軟件，美國bruker公司。

2方法2.1藥物制備將MNNG用去離子水溶解，配制成濃度為1 g/L的儲備液，于4℃下的冰箱中避光保存，臨用時用雙蒸水配成100 μg/ml的濃度；鹽酸雷尼替丁膠囊(0.15g/粒)加工成0.03%的雷尼替丁顆粒飼料以供造模；脫氧膽酸鈉用雙蒸水新鮮配制成200 mmol/L母液避光冷藏保存，用時稀釋成20mmol/L(0.85%)；用80℃的熱水溶解中藥顆粒劑，配制成濃度為2.26g/ml的混懸液，于冰箱中保存，作為高濃度中藥備用；將胃復春片研成細粉，用蒸餾水溶解，配制成濃度為52.5 mg/ml的混懸液，于冰箱中保存備用。

2.2模型制備 參考文獻[4]，采用改進后的綜合造模法造PLGC模型。具體如下：造模組大鼠進食含0.03%雷尼替丁的顆粒飼料。自第二周起每日自由飲用100 μg/ml的MNNG(飲水瓶用油漆涂黑避光)，上午用55℃15%鹽水按10 ml/kg灌胃，下午用20 mmol/L(0.85%)脫氧膽酸鈉溶液按10 ml/kg灌胃并采取禁食一天、進食兩天的方法使大鼠處于饑飽相間的狀態，禁食當天下午按10 ml/kg以40%酒精灌胃，灌胃前后1h禁水。每周用鉗子夾住大鼠的尾部一次，使之保持激怒、爭斗狀態，持續30min。同時正常組大鼠以生理鹽水按10 ml/ (Kg·d)灌胃，與其他組灌胃時間同步。采用上述方法連續造模24周。

2.3分組及實驗干預將大鼠隨機分為6組，分別為：空白對照組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、胃復春對照組與模型對照組，平均每組20只。除空白對照組正常進食進水外，其他5組以上述模型制備方法進行造模。造模成功后，對各組大鼠給予相應的實驗干預。按模型大鼠與正常成年人的體表面積之比確定給藥劑量，中藥低劑量組每天用2 ml稀釋4倍后的高濃度中藥混懸液灌胃，實際劑量為3.77 g/(Kg·d)；中藥中劑量組每天用2 ml稀釋2倍后的高濃度中藥混懸液灌胃，實際劑量為7.53 g/(Kg·d)；中藥高劑量組每天用2 ml高濃度中藥混懸液灌胃，實際劑量為15.06 g/(Kg·d)；胃復春對照組用2 ml胃復春混懸液灌胃，實際劑量為0.35 g/( Kg·d)；模型對照組和空白對照組每天用2 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃。連續實驗干預16周后，所有大鼠禁食不禁水1d，斷頭處死。

2.4指標檢查及方法2.4.1胃竇黏膜病理組織學觀察:迅速解剖處死后的各組大鼠，取胃，沿胃大彎切開，用生理鹽水清洗干凈，取約0.5cm×0.5 cm大小的胃竇組織，用10%甲醛溶液固定。用石蠟包埋并連續切片，采用HE染色法進行染色，在光學顯微鏡下觀察是否有腸上皮化生、腺體萎縮及不典型增生的情況。

2.4.2Syk蛋白、突變型p53蛋白的檢測 :采用免疫組化S-P法檢測：病理切片按照試劑盒說明進行染色后，觀察Syk與突變型p53蛋白的表達情況，并使用顯微圖像分析系統進行圖像分析。結果判定標準：于光學顯微鏡下觀察，存在胞膜、胞漿或胞核為棕黃色顆粒者即為陽性。

2.4.3 Survivin蛋白的檢測:采用免疫組化S-P染色方法檢測：用抗Survivin多克隆抗體試劑盒按照說明書進行S-P免疫組織化學染色后，在光學顯微鏡下進行檢測： 根據陽性細胞的比例與染色的強度分別記0-3分，具體為：陽性細胞<10%記0分，10%-45%記1分，46%-70%記2分，>70%記3分；染色強度以多數細胞的染色反應為準，不著色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。將兩項指標的記分相加，分為4級：0-1分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)。

2.5統計學方法實驗數據均采用SPSS21.0軟件處理，計數資料用百分比的形式表示，進行χ2檢驗；計量資料用形式表示，進行雙側t檢驗。P< 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1各組大鼠胃竇黏膜組織生長情況比較經過24周造模與16周實驗干預后，模型對照組20例胃竇黏膜組織全部出現腺體萎縮、腸上皮化生及不典型增生的情況，而空白對照組20例胃竇黏膜組織全部生長正常，表明造膜成功。而中藥組隨著劑量的遞增，腺體萎縮、腸上皮化生及不典型增生的發生率明顯降低(各組間χ2檢驗，均有P< 0.05)，且呈現一定的劑量相關性。中藥高劑量組胃竇黏膜組織異常生長的發生率與胃復春對照組相當，數據無統計學差異(P> 0.05)，見表1 。

表1　各組大鼠胃黏膜組織生長異常

3.2各組大鼠胃竇黏膜組織中Syk蛋白表達情況比較實驗干預16周后，模型對照組Syk蛋白陽率僅為30.0%，顯著低于空白對照組的100.0%；中藥組隨著劑量升高，Syk蛋白陽率明顯升高(各組間χ2檢驗，均有P< 0.05)，呈現劑量相關性；中藥高劑量組Syk蛋白陽率略高于胃復春對照組，數據無統計學差異(P> 0.05)，見表2。

表2　各組大鼠胃竇黏膜組織中Syk蛋白陽

3.3 各組大鼠胃竇黏膜組織中突變型p53蛋白表達情況比較 實驗干預16周后，模型對照組突變型p53蛋白陽性率為70.0%，而空白對照組不表達突變型p53蛋白；中藥組隨著劑量升高，突變型p53蛋白陽性率明顯降低(各組間χ2檢驗，均有P< 0.05)，呈現劑量相關性；中藥高劑量組突變型p53蛋白陽性率與胃復春對照組相當，數據差異無統計學意義(P> 0.05)(見表3)。

3.4各組大鼠胃竇黏膜組織中Survivin蛋白表達情況比較 干預16周后，模型對照組胃竇黏膜組織Survivin蛋白的表達為強陽性，而空白對照組為陰性；中藥組隨著劑量升高，Survivin蛋白的表達由陽性減少到弱陽性(各組間雙側t檢驗，均有P< 0.05)，呈現劑量相關性；中藥高劑量組Survivin蛋白的表達與胃復春對照組相當，均為弱陽性，數據差異無統計學意義(P>0.05)，見表4 。

表3　各組大鼠胃竇黏膜組織中突變型

表4　各組大鼠胃竇黏膜組織中Survivin

4討論在中醫范疇，PLGC并無相應的名稱，但根據其臨床表現，多以“痞滿”為主、亦可見于“嘈雜”、“胃痛”、“胃脹”等范疇。大多數學者認為，胃癌前病變發病的基礎是脾胃虛弱。其病機特點是本虛標實，虛實夾雜，本虛以脾胃氣虛為主，標實則有氣滯、濕阻、血瘀、熱毒等。治療上應以健脾益氣、理氣消脹、活血化瘀、養陰增液、清熱解毒、化痰軟堅等為主[5]，其中尤其應以健脾為主，許多胃病的治療都以健脾為先[6-7]。加味柴芍六君方(黨參、白術、茯苓、甘草、陳皮、法夏、柴胡、白芍、丹參、莪術、蒲公英、白花蛇舌草、半枝蓮等)中，以四君子湯坐鎮中州，益氣健脾，固護脾土；柴胡、白芍重在疏肝柔肝行氣；陳皮、半夏理氣化濕和胃；莪術、丹參活血通絡，使脾胃脈絡通暢、瘀滯消除；白花蛇舌草、半枝蓮、蒲公英清熱祛毒，促進黏膜病變的修復。該方標本兼治，虛實共調，正中病機，臨床顯示療效良好。

分子藥理學的研究表明，PLGC的病變過程中涉及到多種抑癌基因和癌基因的變化。其中，比較重要的有脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)，Syk為抑癌基因 ，其缺失會導致免疫細胞發育、成熟障礙，從而使腫瘤易于發生[8]。另外，突變型p53也被認為是PLGC的病變過程中的一個標志性的癌基因[9]， 它可以反映慢性萎縮性胃炎的腸上皮化生及異型增生的程度。此外，Survivin也常被用來當作用PLGC的病變過程生物標志分子[10]，屬于凋亡抑制蛋白，是迄今發現最強的凋亡抑制因子，能夠抑制腫瘤細胞的凋亡。

本研究的結果表明，在病征方面，加味柴芍六君方可以預防或逆轉大鼠胃竇黏膜腸上皮化生、腺體萎縮及不典型增生等病理過程。在實驗研究中，中藥組大鼠胃竇黏膜異常生長的發生率明顯低于模型對照組，而且呈現劑量相關性，高劑量組的效果與胃復春相當。在病因方面，加味柴芍六君方也能針多種相關基因起作用。一方面，該方可以增加大鼠胃竇黏膜中Syk蛋白的表達，上調鼠胃竇黏膜細胞中Syk蛋白的水平。在實驗中，中藥組大鼠胃竇黏膜細胞中的Syk水平明顯高于模型對照組，同樣是劑量相關的，高劑量組效果與胃復春相當。另一方面，加味柴芍六君方還可以抑制大鼠胃竇黏膜細胞中突變型p53和Survivin的表達，中藥組大鼠胃竇黏膜細胞中突變型p53和Survivin水平明顯低于模型對照組，也具有劑量相關性，高劑量時與胃復春效果相當。本研究表明，加味柴芍六君方可以從病征和病因兩方面抑制或逆轉PLGC的發生發展，具有標本兼治的效果，為其臨床使用提供了一定的理論依據。

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(收稿2016-03-15；修回2016-04-19)

*廣西自治區桂林市科學研究與技術開發計劃項目 (20140120-1-12)

胃腫瘤/中醫藥療法 @加味柴芍六君方 動物，實驗大鼠

R735.2

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.080