益腎方對IgA腎病細胞因子表達的實驗研究

王三合　 康曉玲　樊　平　陳　群

西北工業大學醫院(西安710072)

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益腎方對IgA腎病細胞因子表達的實驗研究

王三合 康曉玲樊平陳群

西北工業大學醫院(西安710072)

目的：觀察益腎方對IgA腎病模型大鼠細胞因子表達的影響。方法：將40只SD大鼠隨機分為正常對照組10只，造模組30只兩組，采用口服牛血清白蛋白聯合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B法造模。將IgA腎病模型大鼠分成3組：益腎方組、造模組、強的松治療組各10只。分別灌胃給藥，4周后取血，酶聯免疫法(ELISA)測定IL-6、Leptin和PDGF水平。結果：與模型組比較，各藥物治療組均有IL-6、Leptin和PDGF表達降低作用；與正常對照組比較，各組IL-6、Leptin和PDGF表達均增強(P<0.05)；與模型組比較，益腎方能顯著降低IL-6、Leptin和PDGF的表達。 結論：益腎方可能是通過降低IL-6、Leptin和PDGF的表達治療IgA腎病。

IgA腎病(IgA nephrophathy, IgAN)是我國最常見的原發性腎小球疾病，發病率占原發性腎小球疾病的58.2%，是全世界發病率最高的原發性腎小球疾病，也是慢性腎臟病的主要病理類型[1]。近年研究發現，眾多細胞因子與IgA腎病的發生、發展及轉歸關系密切，而白細胞介素-6(IL-6)是細胞因子網絡中的重要因子之一[2]。目前，有關細胞因子與IgA腎病的關系已成為研究的熱點。本實驗通過觀察益腎方對IgA腎病模型大鼠IL-6、Leptin和PDGF指標的變化，從細胞因子水平探討益腎方治療IgA腎病的可能機制，為益腎方的臨床應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1實驗動物21日齡幼年Sprague-Dawley (SD) 大鼠40只，體重100±50g，由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供。

1.2動物模型的建立正常對照組大鼠自由進食與飲水，而模型組大鼠隔日灌服BSA200mg/kg體重(BSA用0.1%BSA酸化水溶解)，第6周開始按20mg/kg,1次/d尾靜脈注射1%BSA(每1gBSA溶于1250ml注射用水中，配成含BSA0.4mg/0.5ml的溶液)連續3d，第8周時按0.5mg/kg尾靜脈注射SEB，每周1次(1 mg SEB溶于50ml注射用水，配成每0.5ml注射用水含0.01mg SEB的溶液)，連續注射3周，觀察至12周末。

1.3分組及藥物干預模型大鼠分三組，每組10只，正常對照組10只。將模型大鼠30只隨機分成3組：益腎方組(湯劑容量為每次每公斤體重10ml)、模型組(灌以相同劑量的清水)、強的松治療組(0.1mg/100g)；1次/d，連續4周。

1.4取材實驗的第12周末和第16周末用代謝籠收集大鼠24h尿液進行尿總蛋白測定。采用腹主動脈取血分離血清，-20℃保存。

1.5檢測指標及方法采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA法)試劑盒測定血清樣本中IL-6、Leptin、PDGF-BB水平，嚴格參照試劑盒說明書進行操作。計算血清IL-6、Leptin和PDGF水平。

2結果2.1正常對照組大鼠在實驗過程中，一般情況正常，模型組大鼠在造模時，注射SEB后均有不同程度的食欲減少，精神萎靡等表現。造模第12周末收集大鼠尿液進行檢測，見表1。

表1　各組大鼠第12周末尿紅細胞計數、24h

注：與正常對照組比較*P<0.05

2.2各組大鼠治療4周后血清細胞因子檢測結果結果顯示，與正常對照組比較，各組尿液中紅細胞個數和24h尿蛋白定量均較正常對照組顯著增加，各治療組之間血尿與蛋白尿水平無顯著性差異(P>0.05)，顯示造模成功。

表2　各組大鼠治療4周后血清細胞

注：*表示與正常對照組比較具有統計學差異，#表示與模型組比較具有統計學差異

2.3各組大鼠第16周末尿紅細胞計數、24h尿蛋白定量結果治療4周后對IL-6、Leptin、PDGF-BB的檢測結果,見表2。尿紅細胞計數、24h尿蛋白定量結果，見表3。

表3　各組大鼠第16周末尿紅細胞計數、24h

注：*表示與正常對照組比較具有統計學差異，#表示與模型組比較具有統計學差異與模型組比較，強的松組、益腎方組大鼠尿紅細胞、24h尿蛋白均有降低(P<0.05)，強的松組、益腎方組尿紅細胞、24h尿蛋白測定結果無統計學差異

3討論目前IgAN動物模型建立方法有以下幾種：自發病變型、免疫誘導型和繼發病變型。自發病變型采用ddy小鼠和高IgA小鼠，而這種小鼠價格昂貴，且該小鼠腎臟與人類腎臟組織結構差別較大；免疫誘導型多采用尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素+灌胃牛血清白蛋白(BSA)誘發IgAN[3]，但葡萄球菌腸毒素是外毒素易引起機體損害,還有采用皮下注射注射CCL4和蓖麻油，灌胃牛血清白蛋白及尾靜脈注射0.05mg脂多糖(LPS)，誘發IgA腎病模型，該模型模型雖有較強IgA的沉積，但肝功能損害嚴重，常伴有肝細胞壞死變性和假小葉生成[4]。

繼發病變型則采用體外將MOPC-315雜交瘤的二硝基苯酚抗體與牛血清白蛋白(二硝基苯酚化)配成免疫復合物，通過鼠靜脈注入BAIb/c鼠體內，而致免疫復合物沉積在腎小球系膜區，但此法模型動物血尿不明顯[4]。

本研究采用尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素+灌胃牛血清白蛋白(BSA)誘發IgAN，考慮到葡萄球菌腸毒素易引起機體損害，改為0.5mg/kg尾靜脈每周注射一次以減少損傷，從研究結果看造模成功。有研究結果顯示一般在造模12周左右可建立穩定、可靠的IgA腎病模型。因此，本研究在造模12周時代謝籠留尿檢測模型動物血尿和尿蛋白情況以確定動物模型是否成功，在模型成功后進行藥物干預4周以觀察藥物治療效果。

IgAN目前治療以糖皮質激素及細胞毒藥物為主，但有時這些藥物的副作用讓患者較難接受。中醫藥治療IgAN有一定療效。

本方為肝腎陰虛之方，證屬腎中真水不足，水虧無以養木，而致陰虛陽亢且虛火內生，治療宜采用滋補肝腎，方中熟地具有甘柔補血，滋腎填精之功，當歸補血活血為君藥，山茱萸、枸杞子、女貞子滋養肝腎固腎氣為臣藥，黃芪可補氣升陽，山藥健脾益胃可助運化，茯苓滲利脾濕，而丹皮涼肝瀉火，生地、赤芍、白茅根具有清熱涼血之用，小薊涼血止血、金櫻子固精、旱蓮草滋陰、仙鶴草收斂共為佐使。全方補瀉結合，開合相濟，共奏滋陰補腎固精、清熱涼血活血之功效。

腎穿刺活檢是診斷IgA腎病的金標準，近年來超聲引導下腎活檢使腎活檢的安全性得到提升，本研究采用的腎穿刺均是在超聲引導下進行的，但是腎穿刺活檢是有創性檢查，有發生出血等風險，且腎穿刺活檢結果有時不足以準確評估腎小球病變嚴重程度。因此，尋找能夠用于IgA腎病診斷、病情評估或判斷預后的無創性生物標志物已成為研究熱點[5]。

細胞因子IL-6是由T細胞、B細胞、單核巨噬細胞等分泌的糖蛋白，具有多種生物學活性，研究發現IL-6可增加系膜細胞蛋白激酶的活性，加重腎損害[6]。本研究結果顯示：IgA腎病模型大鼠血清IL-6水平明顯高于正常對照組，兩者比較有顯著性差異(P<0.05)；服用益腎方治療后，IL-6水平顯著下降，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。提示IL-6表達升高是IgA腎病的生物標記物之一，益腎方可降低IL-6的表達促進組織修復。

總之，本研究結果提示，IL-6、Leptin和PDGF水平與臨床腎間質病理損傷之間具有一定的相關性。血清IL-6、Leptin和PDGF水平可作為無創性生物標記物，若能有大數據樣本檢測結果支持，血清IL-6、Leptin和PDGF水平有可能成為IgA腎病診斷、病情評估或判斷預后的無創性生物標志物。

[1]Zhou FD，Zhao MH，Zou WZ，et al．The changing spectrum of primary glomerular diseases within 15 years: a survey of 3331 patients in a single Chinese centre[J]. Nephrol Dial Transplant,2009,24(3):870-876．

[2]王楠楠，卜茹，蔡廣研，等.IgA腎病相關尿液無創性生物標志物的研究進展[J].中華腎病研究電子雜志，2015，4(2)：37-41.

[3]賀敏敏，董晨，李俊霞.I gA腎病小鼠模型的建立與鑒定[J].徐州醫學院學報，2010，30(3)：151-154.

[4]陸慧瑜，張巧玲,蔣小云，等.IgA腎病大鼠模型的建立[J].中國誤診學雜志，2011，11(6)：1264-1267.

[5]孫燕，穆喆，高妍婷，等.腎活檢1363例病理譜分析[J].陜西醫學雜志，2014，43(10)：1413-1415.

[6]何澤云，廖春來，何雅琴，等.六味地黃湯對IgA腎病大鼠IL-6及TNF-α表達的影響[J].上海中醫藥大學學報，2015，29(3)：61-65.

(收稿2016-04-03；修回2016-06-16)

The experimental study on the effects of cytokine expression of Yishen-Fang in IgAN rats

Hospital of northwestern polytechnical university

(Xi’an 710072)WangSanheKang XiaolingFan Ping et al

Objective：To observe the effects of cytokine expression of Yishen-Fang treatment in IgAN rats. Methods： 40 SD rats were randomly divided into two groups, 10 for normal control group, 30 for model group. 30 IgAN rats were randomly divided into 3 groups: Yishen-Fang treatment group, model group, prednisone treatment group. There are 10 rats in each group. After Gavage for four weeks, the blood was collected. The IL-6, Leptin and PDGF values were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results：Compared with the model group, the expression of IL-6, Leptin and PDGF values decrease were shown in all drug treatment groups. Compared with the normal control group, the values of IL-6, Leptin and PDGF in each group were significantly increased(P<0.05). The expression of IL-6, Leptin and PDGF in the Yishen-Fang treatment group was significantly reduced when compared with the model group. Conclusion:Yishen-Fang may treat the IgAN rats by reducing the expression of IL-6, Leptin and PDGF.

Kidney Diseases (TCM)/Chinese traditional medicine therapyYishen-FangAnimal ExperimentationRats

*陜西省中醫管理局項目(13-LC085)

西安交通大學醫學部地方病研究所(西安710000)

腎病/中醫藥療法益腎方 動物 ，實驗大鼠

R692

A doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.10.079

陜西省衛生計生委研究項目(2014ZD072)

△西安市新城區中醫醫院(西安710003)

▲陜西省中醫醫院(西安710003)