H2S參與植物氣孔運動調節與逆境響應過程研究進展

車永梅 侯麗霞 孫艷君 劉新

（青島農業大學生命科學學院 山東省高校植物生物技術重點實驗室，青島 266109）

H2S參與植物氣孔運動調節與逆境響應過程研究進展

車永梅 侯麗霞 孫艷君 劉新

（青島農業大學生命科學學院 山東省高校植物生物技術重點實驗室，青島 266109）

H2S是近年來確認的植物氣態信號分子，內源H2S介導了乙烯和ABA等激素誘導氣孔關閉的過程，參與植物對鹽、干旱及重金屬脅迫等多種非生物逆境的應答過程。H2S與Ca2+、H2O2和NO等信號分子相互作用調節氣孔運動；外源H2S通過調節抗氧化酶活性及其基因表達，促進脯氨酸等滲透調節物質積累，提高植物的抗逆性。就近年來有關植物體內H2S的來源，其在氣孔運動調控和脅迫應答中的作用及機制進行闡述。

H2S；氣孔運動；逆境響應；信號轉導

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.004

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）在標準狀態下是一種易燃的酸性有毒氣體，近年來大量的研究結果證實，H2S是生物體內重要的信號分子。H2S的信號作用首先在動物中得到證實［1］，隨后證明植物體內也可以產生H2S，H2S在調控植物生長發育及逆境適應等多種重要生命過程中發揮重要作用［2-4］。

本文就植物體內H2S的形成、其在植物氣孔運動調節及逆境響應方面的研究進展進行概述。

1　植物體內H2S的來源

H2S廣泛分布于植物體內，合成H2S的途徑包括酶促途徑和非酶促途徑。目前認為植物體內至少有5種酶參與了H2S的合成，它們分別是L-半胱氨酸脫巰基酶（L-cysteine desulphydrase，L-CDes）、D-半胱氨酸脫巰基酶（D-cysteine desulphydrase，D-CDes）、亞硫酸鹽還原酶（sulfite reductase，SiR）、氰丙氨酸合酶（cyanide synthase，CAS）和半胱氨酸合酶（cysteine synthase，CS）［5］。2010年，Alvarez等［6］發現O-乙酰基-L-絲氨酸（硫醇）裂解酶（oacetylserine（thiol）lyase，OASTL）催化Cys分解生成H2S的活性高于催化Cys合成，認為該酶是一種新發現的L-CDes，并把它命名為DES1（L-Cys desulfhydrases，AT5G28030）。至今為止只有擬南芥、煙草和油菜等少數植物的L/D-CDes被分析研究。最近本實驗室構建AtD-/L-CDes∷GUS轉基因擬南芥研究發現，AtD-CDes在葉片中表達量較高，特別是在葉脈、葉肉細胞和氣孔保衛細胞中具有較高表達量，在保衛細胞中主要存在于葉綠體中，AtD-CDe亦存在于根部微管組織中；而AtL-CDes存在于子葉尖端、保衛細胞細胞質和中柱原始細胞中［7］。

H2S合成的非酶促反應途徑包括將吸收的結合態硫酸鹽轉化成游離態硫酸鹽，最終將多余的硫以H2S氣體的形式釋放出來；或者L-半胱氨酸在非酶作用下直接還原生成H2S［8］。

2　H2S參與氣孔運動的調節

氣孔是高等植物與外界進行氣體和水分交換的主要通道，對各種內外刺激反應非常靈敏，氣孔保衛細胞可以感受光照、水分、溫度、二氧化碳濃度和激素等不同內外因子，從而調節氣孔開閉。脫落酸（abscisic acid，ABA）、乙烯（ethylene，ETH）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）等植物激素均對氣孔運動起調節作用，Ca2+、一氧化氮（nitric oxide，NO）和過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）等是氣孔信號轉導途徑的重要信號組分［9，10］。最早發現外施H2S供體能夠調控氣孔運動，但作用有所差異。2010年，Lisjak等［11］使用兩種H2S供體（NaHS和GYY4137）處理擬南芥和甜椒，發現兩種H2S供體處理均可阻止黑暗誘導的氣孔關閉，并阻斷ABA引起的氣孔保衛細胞中NO的積累，但García-Mata和Lamattina［3］、劉菁等［12］越來越多的研究表明，H2S能夠誘導擬南芥和蠶豆等植物葉片氣孔關閉。

2.1H2S誘導氣孔關閉的信號轉導機制

H2S通過一系列復雜的信號轉導過程（圖1）最終誘導氣孔關閉，H2S能夠通過Ca2+、G蛋白或細胞外ATP（extracellular ATP，eATP）促進H2O2形成，從而參與對氣孔運動的調控［13-15］。Ca2+螯合劑乙二醇-雙-（2-氨基乙醚）四乙酸（glycol-bis-（2-aminoethylether）-N，N，N'，N'-tetraacetic acid，EGTA）和質膜Ca2+通道阻斷劑硝苯地平（nifedipine，Nif）能不同程度抑制H2S誘導的氣孔關閉，而內質網鈣泵阻斷劑毒胡蘿卜素（thapsigargin，Thaps）對H2S的作用無顯著影響，表明H2S通過促進胞外Ca2+內流誘導氣孔關閉［13］。在H2S誘導擬南芥氣孔關閉過程中G蛋白α亞基（GPA）和β亞基（AGB）基因表達量上調，但H2S對G蛋白α亞基和β亞基缺失突變體Atgpa1-3、Atgpa1-4、Atagb1-1和Atagb1-2葉片氣孔運動無顯著影響；G蛋白激活劑霍亂毒素（cholera toxin，CTX）增強H2S誘導擬南芥氣孔關閉的作用，而其抑制劑百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）能夠阻斷H2S的誘導作用，表明G蛋白參與H2S誘導的擬南芥氣孔關閉過程［5］。H2S能夠誘導ABC轉運體AtMRP4和AtMRP5基因表達，引起eATP積累，促進擬南芥氣孔關閉；AtMRP4和AtMRP5缺失取消H2S對eATP積累和氣孔關閉的誘導效應，證明AtMRP4和AtMRP5來源的eATP介導了H2S誘導的氣孔關閉過程［14］。H2S處理后擬南芥葉片NADPH氧化酶基因AtRBOHD和AtRBOHF以及細胞壁過氧化物酶基因AtPRX34表達增強，引起葉片和保衛細胞中H2O2積累，鈣螯合劑EGTA和G蛋白抑制劑PTX對此起抑制作用；外源CaCl2處理可以上調AtRBOHD、AtRBOHF和AtPRX34的表達；G蛋白激活劑霍亂毒素（CTX）促進擬南芥葉片及氣孔保衛細胞中H2O2積累；H2S不能促進ABC轉運體缺失突變體Atmrp4和Atmrp5中H2O2積累，表明Ca2+、G蛋白和eATP可能位于H2O2上游參與H2S誘導的擬南芥氣孔關閉過程［13-15］。Papanatsiou等［16］最近發現外源H2S可以通過抑制內向整流K+通道的K+內流促進氣孔關閉。

2.2H2S參與逆境相關因子調控氣孔關閉的機制

H2S作為內源信號分子參與干旱、鹽害、ABA、乙烯和JA誘導氣孔關閉的過程。我們課題組發現AtL/D-CDes啟動子含有乙烯響應元件ERE，非生物脅迫響應元件MBS、LTR和ABRE。構建AtD-CDes缺失片段啟動子轉基因擬南芥的組織特異性分析結果進一步證明，響應乙烯和干旱的關鍵作用區段分別是-408 bp至-697 bp，-1 bp至-90 bp。研究發現，干旱［17］、鹽脅迫［18］、ABA［3，12］、乙烯［7，19］和JA［20］能提高L/D-CDes活性和（或）基因表達量、促進H2S合成、誘導氣孔關閉；H2S清除劑次牛磺酸（hypotaurine，HT）及合成抑制劑氨氧基乙酸（aminooxy acetic acid，AOA）等均可不同程度抑制這些因子所引起的氣孔關閉；逆境對H2S合成突變體Atl-cdes和Atd-cdes氣孔關閉的作用效果顯著下降［21］，表明L/D-CDes途徑來源的H2S介導干旱、鹽脅迫、ABA、ETH和JA誘導的氣孔關閉［7，17，19，20］。本實驗室以擬南芥野生型和SOS突變體（Atsos1、Atsos2和Atsos3）為材料研究證實，H2S位于SOS上游介導了鹽脅迫誘導氣孔關閉過程［18］。利用ABC轉運體缺失突變體（Atmrp4，Atmrp5和Atmrp4/Atmrp5）證明ABC轉運體位于H2S上游參與鹽脅迫誘導氣孔關閉過程［22］。Jin等［23］發現H2S合成缺失突變體中Ca2+通道、外向整流K+通道基因表達下調，而內向整流K+通道基因表達上調，氣孔開度增大，對干旱敏感性增強，外源H2S可以恢復ABA合成缺失突變體aba3和abi1氣孔對干旱的敏感性，aba3 和 abi1突變體中LCD表達量和H2S含量降低。表明干旱脅迫下ABA通過與H2S互作調控離子運輸系統活性誘導氣孔關閉。

圖1　H2S調控氣孔運動的信號轉導機制

在響應逆境及相關因子促進氣孔關閉過程中，H2S與其他信號分子之間存在聯系。例如，NO和H2S之間存在相互作用參與ABA和ETH誘導氣孔關閉過程：ABA誘導的NO合成依賴于DES1，并且H2S能促進NO產生［21］，在ABA誘導氣孔關閉過程中NO位于H2S的下游。NO合成抑制劑和清除劑抑制ETH誘導的L/D-CDes活性和H2S含量的上升，H2S位于NO下游參與ETH誘導氣孔關閉的過程［24］。干旱脅迫對H2O2合成缺失突變體AtrbohD、AtrbohF和AtrbohD/F的葉片中H2S含量和L-/D-CDes活性及基因表達量沒有顯著影響，H2O2清除劑和合成抑制劑均能抑制干旱、ETH和JA誘導的擬南芥葉片H2S含量和L-/D-CDes活性的增加及氣孔開度的減小，在干旱、ETH和JA誘導氣孔關閉的過程中H2S位于H2O2下游［17，19，20］。

3　H2S參與植物的非生物逆境響應過程

3.1H2S與植物的耐鹽性

外源H2S至少可以通過4種方式提高植物的耐鹽能力（圖2）。

第一，提高植物體清除活性氧的能力。外施H2S可以提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（aseorbateperoxidase，APX）等抗氧化酶，以及抗壞血酸-谷胱甘肽循環相關酶谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）和谷胱苷肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）等酶活性和（或）基因表達量，維持細胞抗氧化能力和氧化還原平衡，降低活性氧積累，提高水稻、草莓和狗牙根等植物的耐鹽性［25-30］。外施H2S供體NaHS可以促進谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR），脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）和單脫氫抗壞血酸還原酶（monodehydroascorbatereductase，MDHAR）等參與谷胱甘肽和抗壞血酸代謝相關基因表達，維持細胞還原態谷胱甘肽和抗壞血酸水平，抑制鹽脅迫誘導的活性氧積累和膜脂過氧化作用［31］。

第二，維持鹽脅迫條件下的離子平衡。外施H2S能夠調節水稻對鈣、鎂、鐵等營養離子吸收和K+/Na+平衡［25］，上調草莓SOS途徑基因（SOS2-like，SOS3-like和SOS4）表達［26］；提高大麥根部內向整流K+-通道基因HvAKT1、高親和K+轉運蛋白基因HvHAK4、質膜H+-ATPase基因HvHA1和Na+/H+反向轉運體基因 HvSOS1以及液泡膜Na+/H+反向轉運體基因HvVNHX2和H+-ATPase β亞基基因HvVHA-β表達，促進K+吸收Na+向胞外和液泡分泌，維持細胞Na+/K+平衡，提高其耐鹽性［29，30］。

第三，能夠促進脯氨酸和可溶性糖等滲透調節物質積累，以提高其抗鹽性［27，28］。

第四，通過其他信號分子提高耐鹽性。例如，H2S通過NO提高苜蓿和大麥耐鹽性，H2S可以促進大麥根部NO積累，而NO清除劑cPTIO消除H2S對苜蓿和大麥鹽脅迫的緩解作用［29，30］；H2S能誘導6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）和質膜NADPH氧化酶活性升高，促進H2O2合成，而H2O2清除劑二甲叉三脲（dimethylthiourea，DMTU）和合成抑制劑二苯基碘（diphenyliodonium，DPI）取消H2S作用，表明H2O2介導H2S誘導的耐鹽性［32］。

圖2　植物體內H2S的合成和在非生物脅迫中的作用示意圖

3.2H2S與植物的耐旱性

外施H2S能夠誘導氣孔關閉、促進脯氨酸和可溶性糖等滲透調節物質積累，以提高其抗旱性［27，33］；能夠顯著提高植物體SOD、CAT和APX等抗氧化酶以及（或）GR、MDHAR、DHAR、L-半乳糖內酯脫氫酶（L-Galactono-1，4-lactone dehydrog-enas，GalLDH）等抗壞血酸代謝和谷胱甘肽代謝相關酶活性，降低脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性，減少H2O2和O2-· 積累，緩解干旱對甘薯、大豆和小麥幼苗等造成的氧化損傷［27，33，34］；可以誘導擬南芥干旱誘導基因CBF1、CBF3、CBF4、DREB2A、DREB2B、RAB18、RD29A和RD29的表達，提高其干旱條件下的存活率［35，36］；亦可降低干旱脅迫下柑橘葉片蛋白的羰基化和S-亞硝基化水平，通過影響蛋白質的翻譯后修飾，進而提高植物的抗旱性［37］。

內源H2S亦參與植物的干旱應答過程。干旱脅迫下ABA通過與H2S互作調控離子運輸系統活性誘導氣孔關閉［23］；PEG8000模擬干旱處理野生型擬南芥能夠促進H2S合成相關酶基因LCD、DCD1、NFS1、NFS2 和 DES1表達，促進H2S產生，并引發干旱響應miRNA，如miR167、miR39、miR396和miR398的轉錄改變，進一步影響其靶基因表達。外源H2S處理能模擬PEG8000引發的miRNA轉錄改革并誘導其靶基因表達變化，LCD突變削弱PEG8000對miRNA轉錄的影響，表明干旱脅迫下植物通過合成H2S調節干旱相關miRNA轉錄提高其抗旱性［38］。

3.3H2S與植物對溫度逆境的響應

極端溫度影響植物生長發育，H2S在植物抵御低溫和高溫中的作用引起人們的關注。發現外源H2S提高小麥幼苗葉片水溶性非蛋白巰基（主要是谷胱甘肽）水平，提高其耐寒性［39］；低溫上調擬南芥LCD和DCD1表達量，提高LCD和DCD活性及H2S含量，LCD和DCD1過表達提高擬南芥對低溫的抵抗能力，而LCD和DCD1缺失和H2S清除劑則導致脅迫條件下擬南芥存活率降低，內源H2S參與擬南芥低溫應答過程。H2S可能通過提高抗氧化酶活性和抗氧化物質含量，調控CBF1、CBF3和CBF4等抗逆相關基因表達參與植物對低溫等逆境的響應過程［36］。

H2S處理提高高溫脅迫下玉米幼苗胚芽鞘海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP）和吡咯啉-5-羧酸-合成酶（Δ'-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS）活性，降低脯氨酸脫氫酶（proline dehydrogenase，ProDH）活性，促進海藻糖和脯氨酸積累，提高其耐熱性［40］；外源H2S提高高溫脅迫下煙草懸浮細胞的存活率和高溫后恢復生長的能力，該作用被外源Ca2+加強，而被Ca2+螯合劑EGTA、質膜Ca2+通道阻斷劑La3+、鈣調素（calmodulin，CaM）拮抗物氯丙嗪（chlorpromazine，CPZ）和三氟吡啦嗪（trifluoperazine）削弱，而不受胞內Ca2+通道阻斷劑釕紅（ruthenium red，RR）影響，表明H2S提高植物的耐熱性需要胞外Ca2+的內流及CaM的參與［41］。高溫促進煙草幼苗煙堿合成，同時促進煙草幼苗H2S和JA（jasmonic acid，JA）合成，H2S合成抑制劑取消高溫的作用，高溫不能誘導L-CDes RNAi干擾株系煙堿和JA合成，表明H2S位于JA上游介導高溫誘導的煙堿合成［42］。Li等［5，43］研究發現，H2S參與SA誘導的玉米幼苗耐熱性，SA預處理誘導玉米幼苗L-CDes活性提高，促進H2S積累，提高高溫脅迫下玉米幼苗的存活率，而H2S合成抑制劑炔丙基甘氨酸（DL-propargylglycine，PAG）和清除劑羥胺（hydroxylamine，HT）削弱SA的作用，但SA合成抑制劑多效唑（paclobutrazol，PAC）和氨基茚磷酸（2-aminoindan-2-phosphonic acid，AIP）對H2S誘導的耐熱性無顯著作用，表明H2S位于SA下游介導玉米幼苗的耐熱性。

3.4 H2S與重金屬脅迫

由于工業“三廢”（廢水、廢渣和廢氣）、機動車尾氣的排放、污水灌溉和農藥、除草劑、化肥等的使用造成土壤、水質和大氣的重金屬污染，近年來，土壤重金屬污染對植物生長發育的影響受到廣泛關注。研究發現，H2S可以提SOD、POD、APX、CAT和GR等抗氧化酶活性，緩解鎘、鋁、鉻、鉛和砷引發的氧化損傷［36，44-52］能提高植物對氮、磷、鉀等大量元素和錳、鐵、銅等微量元素的吸收，維持葉肉細胞和根尖細胞的正常結構和功能，降低有害離子的吸收，緩解鎘、鋁、鉛和砷對大麥、油菜和大豆幼苗的毒害作用［36，47-51］；能阻止鎘脅迫下H2O2激活的質膜Ca2+-通道介導的鎘內流，促進鎘經液泡膜Cd+/H+反向傳遞體向液泡分泌，降低胡楊的鎘脅迫［52］。

內源H2S參與植物對鎘、鋁和鉻等重金屬脅迫的響應。鎘脅迫上調白菜幼苗和大麥根部H2S合成相關酶基因L/D-CDes和DES1表達，促進內源H2S含量升高［53］；外源H2S預處理提高谷胱甘肽代謝相關酶以及抗氧化酶基因表達，維持還原性谷胱甘肽含量并降低活性氧積累，降低鎘的傷害作用［54］。Shi等［55］和Li等［56］發現鎘脅迫誘導狗牙根NO和H2S的產生，外施NO和H2S提高鎘脅迫下狗牙根和苜蓿根部SOD和POD等抗氧化酶活性，提高GSH含量，降低氧化損傷，緩解對生長的抑制；Shi等［55］利用狗牙根研究發現H2S合成抑制劑和清除劑削弱NO的作用，而NO清除劑對H2S的作用無顯著影響，表明NO位于H2S上游參與鎘脅迫響應。而Li等［56］利用苜蓿研究表明，NO清除劑削弱H2S的作用，H2S處理促進苜蓿NO的產生，表明NO位于H2S下游介導鎘脅迫應答。

Ca2+可能位于H2S的上游參與鉻脅迫應答。Fang等［57］證明鉻脅迫誘導谷子幼苗H2S和Ca2+信號的產生，Ca2+通過H2S依賴方式促進金屬螯合劑合成相關基因MT3A和PCS表達，提高鉻脅迫下谷子幼苗葉片SOD、POD等抗氧化酶活性。腺苷酸環化酶抑制劑四氧嘧啶（alloxan）和DDA不同程度降低NaHS對鋁脅迫的緩解作用，表明H2S可能通過cAMP參與大麥鋁脅迫響應過程［54］。

4　H2S參與植物的生物逆境響應過程

H2S與油菜、葡萄和擬南芥等植物的抗病性有關［36］。Bloem等［58］發現核盤菌侵染誘導油菜H2S釋放量增多，增施硫肥能使感染葉斑菌的油菜葉片逐漸恢復正常，并且這種變化與植物體內H2S含量相關［59］。本實驗室證明H2S參與葡萄抗霜霉病過程，葡萄霜霉病菌侵染能夠顯著增強葡萄抗性品種‘左優紅’L/D-CDes基因表達量和H2S含量增加；外源H2S提高抗病相關蛋白多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和β-1，3葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，Glu）活性，H2S清除劑HT對此起抑制作用；并且H2O2清除劑抗壞血酸可顯著抑制霜霉病菌誘導的H2S含量的升高，而H2S清除劑HT對霜霉病菌誘導的H2O2含量變化影響不顯著，推測H2S作用于H2O2的下游參與葡萄抵御霜霉病過程［60］。病原菌Pst DC3000侵染誘導擬南芥葉片LCD和 DCD1表達量和H2S含量升高，LCD和DCD1過表達提高擬南芥植物的抗病性，而LCD和DCD1缺失則導致擬南芥抗病性降低；H2S可能通過miR393-依賴的生長素信號途徑和調節SA誘導的抗病基因表達影響植物的抗病性［36］。

5　問題與展望

目前有關H2S在植物中作用的研究較多集中在H2S緩解逆境造成的氧化損傷，調節離子吸收和滲透平衡等生理作用方面，H2S介導的信號轉導過程和分子機制的研究相對欠缺。因此，今后可考慮從以下幾個方面深入研究：（1）逆境脅迫可以促進H2S的合成，但H2S合成的調控機制尚未見報道。需要探究能夠調節H2S合成酶的轉錄因子和其他調控因子。（2）作為信號分子，植物體內是否存在H2S的特異受體，對此問題可以通過生物學和物理化學等方法篩選與H2S特異結合的蛋白質，研究其作用機制；（3）在植物生長發育調控中H2S與H2O2、NO與Ca2+等信號分子之間存在相互作用，還需要尋找信號傳遞鏈的其他信號組分，完善H2S介導的信號傳遞鏈。（4）植物中存在WRKY和MYB等許多參與低溫、鹽和干旱誘導的轉錄因子［61，62］，Ziogas等［37］篩選到干旱脅迫下受H2S特異誘導的基因，挖掘H2S特異誘導基因及其互作的轉錄因子，研究其作用機制，進一步研究H2S參與逆境應答的分子機制將有助于深入理解H2S的生物學功能。

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（責任編輯 李楠）

Hydrogen Sulfide Functions in Regulation of Stomatal Movement and Stress Response in Plant

CHE Yong-mei HOU Li-xia SUN Yan-jun LIU Xin
（Key Laboratory of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province，College of Life Sciences，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109）

Hydrogen sulfide（H2S），a recently characterized gaseous signal molecule，mediates stomatal closure induced by abscisic acid（ABA），ethylene（ETH）etc.，and participates in plant responses to adverse environmental stresses such as salt，drought and heavy metal stresses. H2S interacts with Ca2+，H2O2and nitric oxide（NO）signal molecules in regulation of stomatal movement. Exogenous H2S improves the resistance to diverse stresses by increasing antioxidant enzyme activity，up-regulating gene expression，and promoting accumulation of compatible substances such as proline and soluble sugars in plants. In this paper，the latest research progresses in the functions and molecular mechanisms of H2S in the regulation of stomatal movement and response to diverse stresses are summarized and discussed.

H2S；stomatal movement；stress response；signal transduction

2016-07-27

國家自然科學基金項目（31572107，31170237）

車永梅，女，副教授，研究方向：植物逆境生理；E-mail：yongmeiche@163.com

劉新，女，教授，碩士生導師，研究方向：植物逆境信號轉導；E-mail：liuxin6080@126.com