青杄PwRbcS 基因克隆及對逆境響應分析

鞠丹 胡安妮 張杰 張凌云

（北京林業大學 省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083）

青杄PwRbcS 基因克隆及對逆境響應分析

鞠丹 胡安妮 張杰 張凌云

（北京林業大學 省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083）

RbcS基因編碼了植物光合作用中核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶的亞基，這種酶能催化二氧化碳的固定和碳氧化兩者之間競爭反應。本實驗中通過RACE-PCR方法成功獲得了青杄RbcS的cDNA全長，對PwRbcS的cDNA序列進行了生物信息學分析預測，同時利用實時定量PCR技術測定青杄各個組織及非生物脅迫下PwRbcS的表達水平。結果表明：PwRbcS基因cDNA全長936 bp，編碼區共552 bp，共編碼186個氨基酸。蛋白質分子量為20.712 6 kD，等電點為9.07。組織特異性表達結果發現PwRbcS該基因主要在葉片中表達，且成熟葉表達量最高。非生物脅迫實驗結果表明，ABA 和NaCl以及低溫處理處理下響應十分明顯。在NaCl處理下，表達量先上升后下降，處理6 h時達到對照的14倍，施加ABA時，在處理8 h時上升至對照的24倍，低溫脅迫下，表達量先上升后下降，6 h達到對照的12倍，而高溫脅迫及PEG（polyethylene glycol）下表達量變化不明顯。因此PwRbcS作為一個在木本植物青杄中發現的新的RbcS基因，可能在青杄逆境響應中行使一定的功能。

Picea wilsonii；RbcS；生物信息學分析；組織表達；脅迫響應

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.019

RbcS是編碼核酮糖1，5-磷酸羧化酶（Rubisco）小亞基的基因，這種酶能催化二氧化碳的固定和碳氧化間競爭反應［1］，其活性是限制這兩個競爭反應速率的關鍵因素［2］。Rubisco蛋白是由大亞基和小亞基組成，小亞基能調控大亞基的表達［3］。對于不同的物種來說，編碼小亞基（RbcS）的基因家族成員個數和類型存在一定差異，有2-22個不等［4-7］。RbcS家族中不同成員基因的表達情況受多種因素的影響，如物種，組織器官類型等［7-9］。RbcS 基因的總轉錄水平與 Rubisco蛋白的含量具有高度相關性［7，10］。Rubisco蛋白的活性主要受大亞基調控，但其多個小亞基對于蛋白活性也有一定的影響［11-13］。前人研究發現 RbcS 基因對環境的變化有一定的響應。當降低光照強度時，黃瓜葉片中 RbcS 的轉錄水平和 Rubisco總蛋白活性都呈現明顯下降趨勢［14］。外源性的施加 ABA 或者萎蔫脅迫下時，擬南芥中rbcS 的轉錄水平均表現為下降，4℃脅迫處理 4 h時rbcS的表達量會上升［15］。大豆Rbcs基因含有3個不同成員，對水楊酸、鹽脅迫和干旱處理均具有明顯的響應。但不同濃度的水楊酸和NaCl 處理對Rbcs基因的轉錄有不同程度的影響［16］。在煙草中轉入天山雪蓮sikRbcs2 基因提高了煙草對于低溫的耐受性［17］。說明RbcS基因表達調控與植物抗逆性有一定的關聯。

青杄（Picea wilsonii）屬于松科（Pinaceae）云杉屬（Picea）多年生木本針葉樹種，在干旱、陰冷等惡劣環境中具有較強的適應和生存能力。由于木本植物的生活史長且遺傳背景復雜，對于針葉樹種進行的生物學研究比較少。本研究通過RACE-PCR的方法，克隆PwRbcS基因的全長cDNA序列，分析PwRbcS的分子組成和理化性質，并且預測其蛋白質二級、三級結構等。同時利用熒光定量PCR技術檢測其在青杄不同組織中的表達情況，以及在ABA、NaCl、PEG、冷熱等處理下PwRbcS的表達情況，旨在為林木中RbcS基因的功能研究奠定基礎，為篩選優質的林木基因以及林木遺傳育種等提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

本實驗中以青杄（Picea wilsonii Mast）莖、針葉（幼葉和成熟葉）、花粉、種子、果實以及12周大的青杄幼苗作為實驗材料，其中花粉、種子、果實采于中國科學院北京植物所植物園。成熟葉（多年生青杄的多年生針葉）、幼葉（多年生青杄的一年生針葉）、莖（多年生青杄的多年生莖）采于北京林業大學校園內。青杄種子春化后，置于濕潤的濾紙上，在種子萌發后，將其移栽到濕潤的草炭土與珍珠巖（體積比為1∶1）混合基質，培養幼苗的溫室相對濕度為60%-70%，日照時間為16 h。生長至12周、長勢一致的青杄幼苗用于脅迫及激素響應實驗。

1.2方法

1.2.1青杄PwRbcS全長cDNA的獲得及PwRbcS基因的克隆

1.2.1.1全長cDNA的獲得 通過RACE-PCR的方法，根據前期構建好的青杄均一化cDNA文庫［18］，從 pDONR222載體和分析獲得的PwRbcS的EST序列設計RACE引物，分別使用引物5'RACE-F和5'RACE-R擴增5'方向獲得5'PCR產物，使用3'RACE-F和3'RACE-R擴增 3'方向的序列獲得3'PCR產物（表1）。通過膠回收構建到pEASY-T1載體上，轉入大腸桿菌測序后獲得PwRbcS 的末端序列，與EST序列拼接后獲得PwRbcS全長cDNA序列。

表1　RACE-PCR與RT-qPCR所用的引物

1.2.1.2PwRbcS基因的克隆 取正常生長的12周大青杄幼苗5株，按照艾德萊生物公司植物RNA提取試劑盒的操作方法獲得青杄的總RNA，利用天根生化科技的cDNA 第1條鏈合成試劑盒反轉錄獲得其cDNA模板備用。

將RACE-PCR獲得的cDNA序列全長，利用DNAMAN6.0軟件導入，分析獲得PwRbcS的編碼區序列，分別從其編碼區的兩端設計克隆引物RbcS-F，RbcS-R。利用引物RbcS-F和RbcS-R（表1），青杄的cDNA模板，通過PCR克隆得到PwRbcS的CDS序列，PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環；72℃延伸10 min。將PCR產物通過膠回收，構建于pEASY-T1載體上保存。

1.2.2生物信息學分析 將PwRbcS的cDNA全長導入到DNAMAN軟件，通過軟件上的翻譯功能推導出PwRbcS的ORF，并進一步將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列；通過NCBI上的BLAST功能找出同源序列，運用ClustalX軟件將同源的氨基酸序列進行多序列比對，并利用MEGA5.0軟件中的鄰連法（Neighbourjoining）構建系統發育樹，bootstap檢測次數為1 000次；利用NCBI的保守域數據庫對目的基因的結構域進行預測；蛋白的理論等電點與分子量利用ExPASy中的Compute pI/Mw工具來計算；用Prot-Scale和TMHMM工具進行疏水性分析和預測該蛋白是否存在跨膜結構；利用GOR4和 SWISS-MODEL在線分析工具二、三級蛋白結構。

1.2.3組織特異性表達及脅迫響應實驗

1.2.3.1組織特異性表達 實驗中分別提取莖、幼葉、成熟葉、花粉，果實、種子的總RNA，反轉錄合成cDNA 第1條鏈，將反轉錄后的cDNA模板濃度調整一致后在Step One Plus Real Time RT-PCR 儀器上進行RT-qPCR實驗，以檢測PwRbcS基因在不同組織的相對表達量。其中提取RNA的試劑盒采用的是艾德萊生物公司的植物RNA提取試劑盒，反轉錄試劑盒（cDNA 第1條鏈合成試劑盒）和熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green SuperReal Premix）均購于天根公司。用于RT-qPCR的引物分別為RbcSRT-F和RbcS-RT-R（表1），實驗中以青杄的EF1-α-F和EF1-α-R作為內參基因［19］，實驗程序采用兩步法：95℃ 15 min；95℃ 3 s，60℃ 30 s，循環次數為40次。實驗設置3次重復。

1.2.3.2逆境脅迫及激素響應實驗 逆境處理和激素響應實驗中采用12周大正常生長的青杄幼苗，實驗方法具體參照［20-23］，處理濃度和時間略有改動。實驗中使用的處理溶液包括100 μmol/L ABA溶液、200 mmol/L NaCl溶液，20% PEG 4000溶液，溫度逆境脅迫中主要采用了4℃、42℃處理，對照為水處理的植株。實驗方法是將12周苗齡的青杄幼苗根浸入處理溶液，實驗處理時間為0、2、4、6、8和12h，處理后的青杄幼苗置于液氮中速凍，于 -80℃保存，用于響應實驗分析。實驗設置3次重復。

1.2.3.3數據處理方法 組織特異性表達，逆境脅迫以及激素響應實驗數據作圖均采用Microsoft Excel 2007，數據處理使用SPSS19.0軟件，差異顯著性分析使用方法為單因素方差分析，多重比較方法為LSD（Least-significant difference）法。

2　結果

2.1青杄PwRbcS全長cDNA的獲得

以青杄的cDNA為模板，利用青杄EST序列分析庫中PwRbcS的EST序列和pDONR222 載體兩端設計特異引物分別進行5'端和3'端的RACE-PCR。PCR擴增產物通過膠回收，連接pEASY-T1載體，轉入大腸桿菌送去測序，將測序結果序列與EST序列進行比對和拼接，得到青杄PwRbcS全長cDNA。結果（圖1）表明PwRbcS基因cDNA全長936 bp，編碼區共552 bp，共編碼186個氨基酸。在11 bp處出現起始密碼子ATG，在560 bp處出現終止密碼子TAA，911 bp處為Poly（A）26尾巴。

2.2生物信息學分析

2.2.1功能結構域分析 在NCBI網站上輸入PwRbcS的氨基酸序列，進行蛋白功能結構域預測，結果（圖2-A）顯示，青杄PwRbcS蛋白具有Rubis-CO small family典型的結構域，推測其屬于RbcS家族的一類蛋白。

2.2.2理化性質分析及蛋白結構預測 PwRbcS全長936 bp，11 bp發現起始密碼子ATG，在560 bp處發現終止子TAA，總共編碼186個氨基酸。由ProParam工具預測理論分子質量（Molecular weight）為20.712 6 kD，理論等電點pI為9.07。蛋白質分子式為C926H1423N251O270S10，帶有正電氨基酸殘基（Arg+Lys）22個，負電氨基酸殘基（Asp+Glu）16個，預測其半衰期大約為30 h，不穩定指數為33.79，低于閾值數40，預測該蛋白穩定。磷酸化位點預測位于PwRbcS的第12、17、24、44、124位有5個絲氨酸（Ser）磷酸化位點，有3個蘇氨酸磷酸化位點，6個酪氨酸磷酸化位點。ProtScale分析蛋白質的疏水性指數為-5.49，表明該蛋白為親水性蛋白（圖2-B）。蛋白無序化分析顯示，有一處無序化序列，在28-76氨基酸處，預測該蛋白的動態結構較強，蛋白在行使功能時構象易發生變化（圖2-C）。TMHMM預測結果不存在跨膜區域。

采用GOR4軟件預測PwRbcS的二級結構，結果顯示該蛋白中α-螺旋，占總體的17.49%，無規則卷曲占55.19%，延伸鏈中占27.32%，無β-折疊結構（圖2-D）。SWISS-MODEL工具預測得到該蛋白的三級結構（圖2-E）。

圖1　PwRbcS基因的cDNA全長及其編碼的氨基酸序列

2.2.3多序列比對及系統進化樹 根據PwRbcS的cDNA序列推導其氨基酸序列，在NCBI上利用在線數據庫Blast其同源序列，得出PwRbcS同源性蛋白包括：美洲落葉松（LlRbcS，X54464）、日本黑松（PtRbcS，X13408）、海岸松（PpRbcS，AJ309096）、北美紅杉（SsRbcS，AY048671）、高粱（SbRbcS，AB564718）、玉米（ZmRbcS，NP_001105294）、燕麥（AvRbcS，AF104249；AcRbcS，AF192776；Am-RbcS，AF192779）、馬蹄蓮（ZaRbcS，AF034479）、黃瓜（CsRbcS，M16056）、擬南芥（AtRBCS1A、At1g67090、AtRBCS1B、At5g38430；AtRBCS2B，At5g38420）、黃菊（AvRbcS，AF104249）等。通過CLUSTAL X和Esprit 3.0軟件將PwRbcS的氨基酸序列與以上同源性較的蛋白氨基酸序列進行對比，結果（圖3）表明，RbcS蛋白在進化上相對保守，與其同源性較高的物種有美洲落葉松（Larix laricina）、海岸松（Pinus pinaster）這些親緣關系較近的松科物種，相似度分別是93%和90%，而與擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的RBCS蛋白的同源性相較低，相似度在60%左右。

2.3青杄PwRbcS表達分析

2.3.1組織特異性表達實驗 實時熒光定量PCR技術分析PwRbcS基因在不同組織器官中的表達量，結果（圖4）顯示PwRbcS主要在葉片中表達，并且在不同葉齡的針葉中的表達量變化很大。在幼葉中的表達量約為莖的15倍，而在成熟葉中表達量更高，約為莖中的25倍。

2.3.2對NaCl和PEG處理響應 在200 mmol/L NaCl溶液處理下，PwRbcS的表達量表現為先上升后下降的變化趨勢，在6 h達到表達量的高峰，表達量大約是對照的14倍。在8 h和12 h時表現為持續下降，在12 h基因的表達量大約為對照的5倍。用20% PEG4000（V/V）處理2 h后，表達量已經上升到對照的1.8倍，處理4 h時表達量上升至第一個高峰，表達量約為對照的2.2倍，隨后基因的表達量在6 h、8 h出現持續的下降，在8 h時PwRbcS的表達量已經下降到對照的0.7倍左右，在處理12 h時，表達量出現回升至2.3倍左右（圖5）。

圖2　PwRbcS蛋白理化分析及二級三級結構預測

2.3.3溫度脅迫處理 低溫脅迫處理青杄幼苗，PwRbcS的表達量出現先上升后下降的趨勢，在處理6 h 時，表達量達到最大值，約為對照組的12倍。之后表達量持續下降，在處理12 h后表達量為對照的4倍左右（圖6）。高溫脅迫（42℃）處理下，在處理4 h后，表達量逐漸上升至對照1.7倍左右，之后表達量下降至對照水平，處理12 h后表達量回升至對照的1.6倍左右。

圖3　PwRbcS蛋白多序列比對（A）及系統進化樹分析（B）

圖4　PwRbcS在青杄各組織中的表達情況

圖5　NaCl（A）及PEG（B）處理下PwRbcS表達量變化

2.3.4激素脅迫及水對照響應 100 μmol/L的ABA處理青杄幼苗時該基因的表達量變化十分明顯（圖7）。在處理0、2、4、6 h 表達量幾乎沒有變化，最高表達量（6 h）也只達到對照的2倍左右。但在處理8 h時，PwRbcS的表達量急劇上升至對照的24倍左右，并且在處理12 h 時表達量急劇下降至對照水平。水對照處理下，該基因表達量差異不顯著，顯示本實驗結果的可靠性和準確性。

圖6　溫度脅迫下PwRbcS基因的表達量變化

3　討論

基于準確、簡便的RACE-PCR的方法［24］，本研究獲得了PwRbcS的cDNA全長。結果表明，該基因全長936 bp，編碼區共552 bp，共編碼186個氨基酸。青杄PwRbcS蛋白具有RubisCO small family典型的結構域，推測其屬于RbcS家族的一類蛋白。多序列比對和系統進化樹分析得出，該基因在進化上相對保守，與北美落葉松，黑松等親緣關系較近的松科類植物，相似度都在85% 以上。前人研究表明Rubisco蛋白與光合、呼吸作用關系緊密［1］，并且參與了植物抗逆、衰老等多種生理過程［15-17，25］。PwRbcS是青杄中Rubisco蛋白的一個小亞基，通過組織特異表達實驗發現，該基因主要是在青杄的針葉中表達，并且與幼葉相比，成熟葉片中的表達量明顯更高，這與前人在水稻、擬南芥中的研究結果［7-9］相似。盡管青杄作為多年生木本植物，而擬南芥、水稻是一年生的草本植物，在植物類型上差異較大但組織特異性表達結果具有相似性可能與其催化光合作用二氧化碳的固定和呼吸作用碳氧化兩者之間競爭反應的功能上的相似性緊密相關。

圖7　ABA（A）以及H2O（B）處理下PwRbcS的表達量變化

葉片作為植物光合呼吸作用的重要器官，在植物正常生長以及響應逆境脅迫中發揮重要作用。RbcS基因主要在葉片中表達，前人對于該基因是否參與植物抗逆過程的研究主要集中在擬南芥、黃瓜和大豆等模式植物，且研究發現該基因對于光照強度、溫度及干旱等脅迫均有一定響應［15-17］。我們的研究結果與這些模式植物相似，在青杄中該基因對于這些非生物脅迫均有較明顯的響應。在NaCl處理下，處理6 h表達量上升到對照的14倍，ABA處理后，PwRbcS基因的表達量在處理的前期，即0-6 h內幾乎沒有太大變化，而在處理8 h時出現急劇的上升現象。低溫脅迫下，表達量表現為先上升后下降的變化趨勢，最高時是對照組的12倍左右。結果預示該基因參與了多種非生物脅迫響應過程，并且對于不同的非生物脅迫，基因響應的時間和模式存在差異。前人研究在煙草中轉入天山雪蓮的sikRbcs2基因明顯提高了對低溫脅迫的耐受性［17］，基于研究對象青杄中的PwRbcS基因對于多種非生物脅迫均有一定的響應，我們推測該基因可能參與到了植物多種抗逆響應過程，但是該基因能否提高植物的抗逆能力，以及其參與抗逆反應的信號途徑和調控機制還需要進一步將PwRbcS基因轉入模式植物擬南芥及煙草等進一步驗證，以期為該基因在植物中的進一步利用奠定基礎。

4　結論

從青杄cDNA文庫中成功克隆出核酮糖1，5-二磷酸羧化加氧酶的小亞基編碼基因PwRbcS。組織特異性表達結果發現PwRbcS基因主要在葉片中表達，且成熟葉表達量最高。非生物脅迫實驗結果表明，該基因參與了多種非生物逆境脅迫反應包括ABA、NaCl及低溫處理。對于高溫脅迫及PEG處理表達量變化則不十分明顯。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning and Stress Response Analysis of PwRbcS in Picea wilsonii

JU Dan HU An-ni ZHANG Jie ZHANG Ling-yun
（Key Laboratory of Forestry Silviculture and Conservation of the Ministry of Education，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

RbcS gene encodes a subunit of nuclear plant photosynthesis 1，5 two ribulose bisphosphate carboxylase / oxygenase. In this study，PwRbcS cDNA was obtained using RACE -PCR method. Bioinformatics analysis and real-time PCR technique were used to determine the relative expression of PwRbcS. The results showed that the full-length of PwRbcS cDNA was 936 bp，including the ORF of 552 bp encoding 186 amino acids. The theoretical molecular weight of PwRbcS is 20.712 6 kD and the pI value was 9.07. RT-qPCR showed that PwRbcS is mainly expressed in the needles，especially in mature needles. The expression of PwRbcS changed obviously under the treatment of NaCl，ABA and low temperature，respectively. After NaCl treatment，the expression level of PwRbcS changed significantly，reaching to 14 times than the control at 6 h. The expression level of PwRbcS reached to 24 times than the control after 8 h-ABA-treatment. And under low temperature stress，the expression increased gradually to 12 times than the control and followed by a drop，while under high temperature and PEG stress expression level did not change significantly. Therefore，PwRbcS may play an important role during abiotic stresses in planta.

Picea wilsonii；RbcS；bioinformatics；tissue expression；stress response

2016-07-04

國家自然科學基金項目（31270663），國家轉基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX08009003-002-004）

鞠丹，女，碩士研究生，研究方向：植物抗逆基因克隆和功能研究；E-mail：1542283723@qq.com

張凌云，女，博士，博士生導師，研究方向：植物生殖與逆境生理；E-mail：lyzhang@bjfu.edu.cn