64Cu-ATSM乏氧分子影像探針及其荷人乳腺癌小動物PET/ CT顯像的初步研究

孫 筠，李自立，許曉平，何思敏，薛楊波，程競儀，章英劍

1. 上海市質子重離子醫院核醫學科，上海 201321；

2. 復旦大學附屬腫瘤醫院核醫學科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

64Cu-ATSM乏氧分子影像探針及其荷人乳腺癌小動物PET/ CT顯像的初步研究

孫 筠1，2，李自立1，2，許曉平1，2，何思敏1，2，薛楊波1，2，程競儀1，2，章英劍1，2

1. 上海市質子重離子醫院核醫學科，上海 201321；

2. 復旦大學附屬腫瘤醫院核醫學科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032

目的：64Cu有半衰期較長、化學反應溫和的優勢，本研究合成新型乏氧分子影像學探針64Cu-ATSM，并與18F-氟硝基咪唑（18F-fluoromisonidazole，18F-FMISO）進行初步比較。方法：使用SIEMENS Eclipse HP 11 MeV小型醫用回旋加速器系統，Comecer ALCEO EDL、PRF、TADDEO放射性模塊和定制鉑金靶盤進行64Ni電鍍、64Cu純化和64Cu-ATSM合成。用伽馬能譜儀和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進行放射核純度、放化純度和穩定性檢測。在荷人乳腺癌MDB-MA-231模型中進行小動物PET/CT顯像并與自制的18F-FMISO進行比較。結果：實現了64Cu-ATSM的自動化生產，產率60%，放射性核純度＞99%，放化純度＞95%，標記物穩定性＞6 h。與18F-FMISO一樣能反映腫瘤乏氧情況，且注射1 h后T/M值即能達5.28。結論：成功用11 MeV SIEMENS回旋加速器和Comecer ALCEO模塊合成了64Cu-ATSM，荷人乳腺癌小動物PET/CT乏氧顯像靶/本比高。

64Cu-ATSM；18F-氟硝基咪唑；乏氧顯像；乳腺癌

64Cu （T1/2=12.7 h，β+= 653 keV ［17.8%］），β+衰變產生湮滅輻射后生成的一對511 keV光子可用于正電子發射斷層成像（positron emission tomography， PET）［1］，其正電子射程4.7 mm，影像分辨率和放射防護需求類似18F。64Cu外層軌道上電子的排布（3p63d9）決定了其易與含N、S、O等原子的配體形成較為穩定的配合物［2］。與18F分子影像學探針標記反應相比，64Cu與螯合物的反應一般在水相中完成，不需高溫加熱，且反應迅速。64Cu半衰期達12.7 h，可支持更遠的運輸距離。因此，64Cu標記的分子影像學探針目前受到越來越多的關注［3-5］。

腫瘤乏氧是放療抵抗的重要原因，已成為正確實施個體化放療的生物靶點之一［6］。乏氧是實體腫瘤生長過快和血管結構異常的共同結果，是腫瘤進展、局部控制失敗及細胞存活和轉移因子激活的重要因素。分析腫瘤細胞乏氧對腫瘤的活性診斷、療效分析及預后評價具有重要意義［7］。本研究報道使用SIEMENS小型醫用回旋加速器系統、Comecer ALCEO放射性模塊和定制鉑金靶盤進行64Cu-diacetyl-bis（N4-methylthiosemicarbazone）（ATSM）合成及其在荷人乳腺癌小動物PET/CT乏氧顯像中與18F-氟硝基咪唑（18F-fluoromisonidazole，18FFMISO）對照的初步結果。

1　資料和方法

1.1儀器和試劑

1.1.1儀器設備

采用SIEMENS Eclipse HP 11 MeV小型回旋加速器及其固體靶系統和為該加速器設計定制的鉑金靶盤；Comecer ALCEO 固體靶系統：EDL電化學/溶解/轉移/沉積模塊、PRF電化學純化模塊、TADDEO放射性藥物合成模塊；AMETEK GEMC5060P4伽馬能譜儀；AGILENT HPLC 1260，配有四元梯度泵、可變波長檢測器、流式γ放射性檢測器（Gabi Star，德國RAYTEST公司）、Poroshell 120 EC-C18分析柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）、真空脫氣機和ChemStation色譜控制和分析軟件；Millipore超純水制備系統；SIEMENS Inveon小動物PET/CT。上述儀器設備均為本科室擁有。

1.1.2試劑

64Ni （99.9%）購于深圳愛索特國際同位素有限公司；H2-ATSM購于ABX公司；氯化銨（≥99.999 5%）購于FLUKA公司；AG 1-X8樹脂，氯型，300～1 200 μm，購于BIO-RAD公司；28%氫氧化銨（≥99.999 5%）購于SIGMA-ALDRICH公司；無水乙醇［高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）級］購于ALADDIN公司；60%硝酸（超純）購于MERK公司；37%鹽酸（trace medal，99.999%）購于OURCHEM公司；濃硝酸（≥90%）購于SIGMA-ALDRICH公司。

1.2腫瘤模型制備

BALB/c雌性裸鼠，4～6周齡，體重20～25 g，購于復旦大學上海醫學院實驗動物部，于此飼養至實驗開始。雌激素受體（estrogen receptor，ER）陰性人乳腺癌MDB-MA-231細胞在DMEM培養基中，于37oC、5% CO2細胞培養箱中常規培養，在細胞對數生長期傳代培養。用磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞，0.25%胰酶消化，離心（1 000 r/min，5 min），DMEM培養基吹打混勻，流式細胞儀計數調整細胞密度，準備接種。在每只BALB/c雌性裸鼠右腋下皮下注射5×106個細胞，飼養于獨立通風籠（individual ventilated cage，IVC）中3周，每2 d用游標卡尺測量腫瘤長徑，待腫瘤長徑長至0.8～1.0 cm時用于顯像。

1.3實驗方法

1.3.164Cu的制備和純化

64Ni用60%硝酸加熱溶解后，氫氧化銨調pH值，使用Comecer ALCEO EDL電化學/溶解/轉移/沉積模塊，通過電沉積方法將64Ni層鍍于鉑金靶盤中央表面。

基于64Ni （p，n）64Cu反應，以富集64Ni為靶材，通過SIEMENS Eclipse HP回旋加速器，以能量11 MeV、束流強度30 μA的質子轟擊64Ni 30 min。轟擊結束后，冷卻1 h，將靶盤固定于Comecer ALCEO EDL電化學/溶解/轉移/沉積模塊，經Comecer ADDEO PRF電化學純化模塊，分別用6、4 、0.5 mol/L鹽酸溶解靶層，再用AG 1-X8樹脂進行64Cu分離純化，制備64CuCl2。

1.3.264Cu-ATSM的合成

64Cu-ATSM的合成路線見圖1。將分離純化后得到的64CuCl2溶液轉移至合成模塊的反應器中，真空條件下120 ℃蒸發至干。向反應器中加入1.5 mL 1 mol/L CH3COONa，同時向反應器中加入200 μL二甲基亞砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解的20 μg前體H2-ATSM，鼓泡2 min。將反應完全的溶液轉移至乙醇/水處理過的C-18柱，用10 mL無菌注射用水清洗C-18柱，去除沒完全反應的H2-ATSM，然后用0.7 mL藥用無水乙醇沖洗C-18柱，并過0.22 μm無菌濾膜，再用生理鹽水稀釋得到注射用64Cu-ATSM。

圖1　64Cu-ATSM合成路線

1.3.364Cu-ATSM質量分析

用伽馬能譜儀分析核純度，用分析型Radio-HPLC檢測放化純度和穩定性。HPLC流動相是0.05 mol/L CH3CN/NaH2PO4（1∶1，V/V），pH=3，流速為1 mL/min，分析柱為Poroshell 120 EC-C18柱，采用276 nm UV檢測器和放射性檢測器。HPLC連續上樣，檢測64Cu-ATSM 6 h內的放化純度，檢驗其穩定性。同時，目測其外觀顏色和澄清度，利用精密pH試紙測pH值。

1.3.464Cu-ATSM乏氧成像

取3只荷人乳腺癌MDB-MA-231裸鼠，分別自尾靜脈注射64Cu-ATSM （約550 μCi），于注射后1、2、3 h在異氟烷（異氟烷/氧氣，1.5%/98.5%，V/V）麻醉狀態下進行，同時行小動物PET/CT掃描，3D模式采集10 min靜態圖像。有序子集最大期望值算法（ordered subsets expectation maximization，OSEM） 3D/MAP法重建，并行衰減校正，獲得荷瘤裸鼠體內64Cu-ATSM分布融合圖像。在腫瘤部位和對側肌肉勾畫感興趣區（region of interest，ROI），工作軟件自動產生對應的最大標準攝取值（maximum standardized uptake value，SUVmax），然后計算腫瘤/肌肉（tumor/muscle，T/M）吸收比值。

在注射64Cu-ATSM 后第4天，3只荷瘤裸鼠注射18F-FMISO （制備方法見文獻［8］）進行小動物PET/ CT掃描成像異比較。

2　結 果

本研究實現了SIEMENS Eclipse HP 11 MeV小型回旋加速器固體靶系統和Comecer ALCEO EDL、PRF和TADDEO放射性模塊的銜接，并為此設計定制了鉑金靶盤，實現了使用11 MeV質子轟擊生產64Cu，在64Cu制備過程中實現了電鍍、溶解、純化和放射性藥物合成的自動化。

其中，通過電沉積方法成功將60 μg64Ni鍍于鉑金靶盤中央表面，置于回旋加速器靶托，以30 μA、11 MeV質子轟擊30 min后，溶解靶盤上含64Cu的64Ni固體層，純化得到小動物研究用的3.06 mCi64CuCl2。

64Cu的放射性核純度（圖2）僅見1 346 keV的β+特征峰及其湮滅輻射后產生的511 keV γ峰，與文獻報道一致［9］，可確認產物為64Cu，且無明顯放射性雜質（圖3）。

根據圖1的合成路線，合成出1.83 mCi64Cu-ATSM，產率為60%。Radio-HPLC分析結果提示放化純度＞95% （圖3），且在6 h內保持穩定。其注射液為澄清液體，pH=6。

人乳腺癌MDB-MA-231移植瘤成像結果（圖4）顯示，64Cu-ATSM、18F-FMISO均可顯示癌灶乏氧情況，肉眼判斷效果相似（圖4）。半定量計算結果顯示，注射后1、3 h，T/M值分別為5.28、1.88和4.48、3.69，提示64Cu-ATSM可成像時間較早，隨時間延長，18F-FMISO與其差距縮小。

3　討 論

目前已發現的64Cu制備方法有3種：① 通過熱中子捕獲反應63Cu （n，γ）64Cu獲得，但比活度低；② 通過快中子反應64Zn （n， p）64Cu獲得，比活度高，但需進入反應堆快中子通量阱，而這在大多數反應堆設備中難以實現；③ 通過本研究所述64Ni （p， n）64Cu核反應。目前大多數研究在15MeV及以上的醫用回旋加速器中生產64Cu［10-11］。本研究證明，在低至11 MeV的常規醫用回旋加速器中也可生產出高純度的64Cu。

圖2　純化后的CuCl2伽馬能譜　

圖3　64Cu-ATSM HPLC圖譜

圖4　64Cu-ATSM與18F-FMISO microPET/CT乏氧顯像比較

本研究使用11 MeV質子轟擊30 min，束流強度30 μA，產出3.06 mCi64CuCl2，產量為0.204 mCi/μA·h，遠低于12 MeV、50 μA轟擊的產量0.6～3 mCi/μA·h［12］，提示質子轟擊時間、能量和束流強度是影響產量的重要因素。質子通過非線性方式釋放能量，增加64Ni厚度，更充分地吸收質子能量可進一步提高產量。國內文獻［10］報道，用37～70 μA束流強度、15 MeV質子打靶生產大劑量64Cu時需轟擊 2.5～10h。綜合考慮以上因素，下一步將調整電鍍質量、提高束流強度、延長轟擊時間以生產臨床所需64CuCl2產量。

本研究發現，64Cu-ATSM T/M值在注射后1 h達5.28，高于18F-FMISO，這種差異可能是由于肌肉組織中64Cu-ATSM攝取較少。分子影像學探針在靶區的快速集聚有利于提高檢查通量，本研究小動物乏氧影像初步結果提示優于文獻［11］報道的64Cu BMS181321，最佳顯像時間可望縮短至1 h，有助于縮短患者乏氧成像的等待時間。

本研究在國際上首次實現了SIEMENS Eclipse HP 11 MeV小型回旋加速器固體靶系統和Comecer ALCEO EDL、PRF、TADDEO放射性固體靶藥物模塊的銜接，定制的鉑金靶盤可很好地用于64Ni電鍍，實現了64Cu制備過程中電化學、溶解、純化和放射性藥物合成的自動化。實驗性生產的64CuCl2具有極高的放射核純度。64Cu-ATSM產率為60%，放化純度高，可顯示荷人乳腺癌MDBMA-231腫瘤的乏氧情況，肉眼判斷效果與18FFMISO相似，且1 h的T/M值顯著高于18F-FMISO，有助于縮短患者乏氧成像的等待時間。

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Preliminary research of preparation of64Cu-ATSM and its small animal scanning

SUN Yun1，2， LI Zili1，2， XUXiaoping1，2， HE Simin1，2， XUE Yangbo1，2， CHENG Jingyi1，2， ZHANG Yingjian1，2 （1. Department of Nuclear Medicine，Shanghai Proton and Heavy Ion Center， Shanghai 201321， China； 2. Department of Nuclear Medicine， Fudan University Shanghai Cancer Center； Department of Oncology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032，China）
Correspondence to: CHENG Jingyi E-mail: jingyi.cheng@sphic.org.cn

Objective: To investigate the synthesis and application of64Cu-ATSM in hypoxia imaging of xenografted MDBMA-231 breast cancer. Methods:64CuCl2was prepared by SIEMENS Eclipse HP 11 MeV cyclotron， Comecer ALCEO EDL， PRF and TADDEO pharmaceutical modules， and the modified platinum target plate. And then the prepared64CuCl2and synthesized64Cu-ATSM were monitored by energy spectroscopy and high performance liquid chromatography （HPLC） for detection of radioactive purity， radiochemical purity and stability.64Cu-ATSM was intravenously injected into MDB-MA-231 cells xenografted nude mouse and then imaged by microPET/CT. The results were compared with that of18F-fluoromisonidazole （18F-FMISO） injected 4 d after64Cu-ATSM imaging. Results: The automatic production of64Cu-ATSM with a productivity of 60% without radioactive and radiochemical impurity was achieved.64Cu-ATSM was stable at 6 h after synthesis. Both64Cu-ATSM and18F-FMISO could demonstrate the hypoxic degree of MDB-MA-231 cell xenografted tumor. And the tumor/muscle （T/M） ratio of64Cu-ATSM was 5.28， which was significantly higher than that of18F-FMISO （1.88）. Nevertheless， three hours after injection， the T/M ratios of the two probes were similar. Conclusion: The synthesized64Cu-ATSM could image the hypoxic condition of MDB-MA-231 xenografted tumor.

64Cu-ATSM；18F-fluoromisonidazole； Hypoxia； Breast cancer

R445.5

A

1008-617X（2016）03-0267-05

國家自然科學基金青年基金（No：21501029、21401025）；上海市科委項目（No：15ZR1438600、14DZ2251400）

程競儀 E-mail：jingyi.cheng@sphic.org.cn

（2016-08-22

2016-09-07）