復(fù)方甘草酸苷注射液對B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素生成的影響

顏克香 祝綠川 鄭志忠

·論著·

復(fù)方甘草酸苷注射液對B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素生成的影響

顏克香 祝綠川 鄭志忠

目的： 研究復(fù)方甘草酸苷注射液對B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素的影響及其機(jī)制。方法： 通過CCK8、流式細(xì)胞術(shù)、NaOH裂解法、多巴氧化法和Western-blotting技術(shù)檢測復(fù)方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細(xì)胞生長，黑素合成與轉(zhuǎn)運(yùn)及酪氨酸酶活性和蛋白含量的影響。結(jié)果： （1）復(fù)方甘草酸苷注射液濃度低于30 μL/mL，對B16鼠黑素瘤細(xì)胞生長無明顯影響；濃度大于50 μL/mL，細(xì)胞生長速率減慢；濃度達(dá)到500 μL/mL，細(xì)胞生長明顯受抑制。（2）濃度在10 μL/mL到200 μL/mL，黑素的合成和酪氨酸酶的活性均增加。黑素的合成在復(fù)方甘草酸苷注射液濃度為50 μL/mL時增加最明顯；且酪氨酸酶活性呈濃度依賴性增加，在濃度為100 μL/mL和150 μL/mL時達(dá)到最高。結(jié)論： 復(fù)方甘草酸苷注射液有促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞黑素的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)及增加酪氨酸酶活性的作用。

復(fù)方甘草酸苷； B16鼠黑素瘤細(xì)胞； 酪氨酸酶

臨床上我們發(fā)現(xiàn)用復(fù)方甘草酸苷聯(lián)合其它治療白癜風(fēng)的藥物可明顯加快白斑皮損處色素的恢復(fù)，控制活動期皮損的發(fā)展，國內(nèi)學(xué)者也有報道復(fù)方甘草酸苷可增加外用藥物如復(fù)方卡力孜然酊、鹵米松等的療效［1，2］，與其它藥物聯(lián)合運(yùn)用的治療效果要優(yōu)于潑尼松［3］。但復(fù)方甘草酸苷治療白癜風(fēng)的理論機(jī)制還未見相關(guān)報道，因此，我們體外研究不同濃度復(fù)方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細(xì)胞的生長、黑素合成與轉(zhuǎn)運(yùn)及酪氨酸酶活性的影響，探討復(fù)方甘草酸苷治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制，為臨床治療白癜風(fēng)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料 主要試劑:B16鼠黑素瘤細(xì)胞由中科院提供，Hacat細(xì)胞由本室凍存，RPMI 1640培養(yǎng)基（美國，Gibco公司），新生小牛血清（Hyclone），左旋多巴（L-dopa），胰蛋白酶為Sigma產(chǎn)品，CCK-8（同仁化學(xué)研究所），復(fù)方甘草酸苷注射液（日本米諾公司提供），F(xiàn)ix&Perm破膜試劑盒（invitrogen公司），PE-cytokeratin（abcam公司），兔抗人的酪氨酸酶抗體（abcam公司），CFDA-SE（碧云天）。

1.2實驗方法

1.2.1B16鼠黑素瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 用含10%新生牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至近融合狀態(tài)，經(jīng)含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液和臺盼藍(lán)染色計活細(xì)胞數(shù)，然后進(jìn)行實驗，每一次實驗均取自同一傳代細(xì)胞，每次實驗重復(fù)三次。

1.2.2B16鼠黑素瘤細(xì)胞增殖率的測定 取對數(shù)生長期B16鼠黑素瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，以 5×103/孔接種至96孔培養(yǎng)板，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，孵育6～12 h待細(xì)胞貼壁后，實驗組加入不同濃度的復(fù)方甘草酸苷注射液（1 μL/ mL，5 μL/mL，10 μL/mL，30 μL/mL，50 μL/mL，100 μL/mL，200 μL/mL，500 μL/mL），每種濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)只含培養(yǎng)液而無細(xì)胞的空白組和有細(xì)胞不加藥物的對照組，分別于加藥后24 h，48 h，72 h，96 h，120 h加入CCK-8 10 μL，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后用酶標(biāo)儀檢測450 nm的吸光度值，參考波長是650 nm，用下列公式計算各組細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=（實驗組 A450-空白組 A450）/（對照組A450-空白組A450）×100。

1.2.3酪氨酸酶活性和黑素含量測定 取對數(shù)生長期B16鼠黑素瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后以1×105/孔接種至6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的復(fù)方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，經(jīng)胰酶消化后計數(shù)，用NaOH裂解法測定黑素含量［4］，多巴氧化法測定酪氨酸酶的活性［5］，并加以修改。

1.2.4B16鼠黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶蛋白的測定 取對數(shù)生長期B16鼠黑素瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后以1× 106接種至直徑6 cm的培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的復(fù)方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/ mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用全細(xì)胞裂解液提蛋白，并用Brodford法測定蛋白濃度，取相同蛋白濃度的樣品熱變性后上樣，經(jīng)10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后先后加入一抗（1∶1000）和相應(yīng)的二抗孵育，plusECL化學(xué)發(fā)光檢測酪氨酸酶和β-actin蛋白的表達(dá)，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像分析儀對圖像進(jìn)行分析。

1.2.5B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的測定 取2×106B16鼠黑素瘤細(xì)胞用CFDA-SE標(biāo)記（按說明書操作），將標(biāo)記后的B16鼠黑素瘤細(xì)胞和Hacat細(xì)胞以1∶2的比例接種于直徑3 cm的培養(yǎng)皿，并設(shè)立單獨培養(yǎng)的對照組，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的復(fù)方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)96 h，將細(xì)胞用胰酶完全消化下來后，用PBS洗滌2次，分別加入試劑A和試劑B（按說明書操作）對細(xì)胞進(jìn)行固定和通透后加入20 μL PE-cytokeratin，室溫孵育1 h，用含5%FBS的PBS洗滌3次后上流式檢測PE陽性的Hacat細(xì)胞中CFDA-SE標(biāo)記陽性的細(xì)胞數(shù)，即代表成功發(fā)生黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的Hacat細(xì)胞數(shù)目。

2　結(jié)果

2.1不同濃度的復(fù)方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細(xì)胞形態(tài)的影響:復(fù)方甘草酸苷濃度大于50 μl/mL時，B16鼠黑素瘤細(xì)胞開始出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的改變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞胞體變大，樹突增多，以200 μl/mL時最明顯，見圖1、2

2.2不同濃度的復(fù)方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細(xì)胞增殖率的影響:當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度在30 μl/mL以內(nèi)時，對B16鼠黑素瘤細(xì)胞生長無明顯影響；濃度大于50 μl/mL時，細(xì)胞生長速率開始減慢，到達(dá)平臺期的時間延長，當(dāng)濃度達(dá)到500 μl/mL時，細(xì)胞生長明顯受抑制，見表1。

圖1　對照組

圖2　200 μl/mL組

表1　不同濃度的復(fù)方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細(xì)胞增殖的影響

2.3不同濃度復(fù)方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響:當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度在10 μl/mL到200 μl/mL時，黑素的合成和酪氨酸酶的活性均增加。黑素的合成在濃度為50 μl/mL時增加最明顯；酪氨酸酶活性呈濃度依賴性增加，在濃度為100 μl/mL和150 μl/mL時達(dá)到最高，見圖3。

圖3　不同濃度復(fù)方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響

2.4不同濃度復(fù)方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細(xì)胞酪氨酸蛋白表達(dá)的影響:當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度在30 μl/ mL和50 μl/mL時酪氨酸蛋白表達(dá)明顯增加，濃度大于75 μl/mL時，酪氨酸蛋白表達(dá)降低，當(dāng)濃度達(dá)到500 μl/mL，酪氨酸蛋白表達(dá)明顯受抑制，見圖4。

圖4　不同濃度的復(fù)方甘草酸苷對酪氨酸蛋白表達(dá)的影響

2.5不同濃度復(fù)方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細(xì)胞向Hacat細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黑素的影響:復(fù)方甘草酸苷濃度在10 μl/mL～200 μl/mL之間時均有促進(jìn)黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，以濃度為75 μl/mL和150 μl/mL時，黑素轉(zhuǎn)運(yùn)能力最強(qiáng)，無明顯的劑量相關(guān)性，見圖5。

圖5　不同濃度復(fù)方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細(xì)胞向Hacat細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黑素的影響

3　討論

早在1987年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)甘草次酸抑制B16黑素瘤細(xì)胞生長，并導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的改變和刺激黑素的合成，甘草酸苷也可導(dǎo)致同樣的改變但需要的濃度比甘草次酸高20多倍，甘草次酸處理細(xì)胞84 h后除去，細(xì)胞的生長速率可輕度恢復(fù)，但倍增時間是對照組的2倍，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)甘草次酸對細(xì)胞生長的抑制是通過阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期造成的［6］。我們的結(jié)果表明復(fù)方甘草酸苷濃度大于50 μl/mL時，B16鼠黑素瘤細(xì)胞生長速率開始減慢，進(jìn)入平臺生長期的時間延長，這可能也與阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期有關(guān)。隨著復(fù)方甘草酸苷濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變也越明顯，主要表現(xiàn)為胞體增大，樹突增多，以濃度為200 μl/mL最明顯；當(dāng)濃度達(dá)到500 μl/mL時，細(xì)胞胞體又開始變小，樹突也減少。

Jung等研究證實甘草酸苷可以劑量依賴性方式促進(jìn)B16黑素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶mRNA和蛋白的表達(dá)，增加酪氨酸酶的活性及黑素的含量。酪氨酸相關(guān)蛋白2（TRP-2）mRNA水平也增加，而酪氨酸相關(guān)蛋白1（TRP-1）的變化不明顯。在甘草酸苷的有效濃度內(nèi)沒有出現(xiàn)細(xì)胞毒性，而在同樣無毒性濃度下，甘草次酸對黑素合成無明顯影響［7］。這與1987年Abe等報道的甘草次酸能刺激黑素的合成不一致，分析原因可能與兩者的濃度不一樣有關(guān):Jung等的研究是在對細(xì)胞無毒性的條件下進(jìn)行，而Abe等的研究是在使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變的條件下進(jìn)行。雖然1分子的甘草酸苷含1分子的甘草次酸和2分子的葡萄醛酸，但相同劑量的甘草次酸不能增加酪氨酸酶mRNA和蛋白水平，對黑素合成無影響，這表明甘草酸苷中的糖苷結(jié)構(gòu)在黑素合成過程中起重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)復(fù)方甘草酸苷濃度在30 μl/mL和50 μl/mL時，酪氨酸酶蛋白表達(dá)增加，黑素的合成也增加，并在50 μl/mL時達(dá)到最大；當(dāng)濃度大于75 μl/mL時，酪氨酸酶蛋白的表達(dá)開始降低，當(dāng)濃度達(dá)到500 μl/mL時，酪氨酸酶蛋白的表達(dá)明顯受抑制。酪氨酸酶活性的增加呈明顯的劑量相關(guān)性，在濃度為100 μl/mL和150 μl/mL時達(dá)到最高，然后又逐漸降低，但均高于對照組。

酪氨酸酶活性的增加與黑素合成的增加不完全一致，可能與復(fù)方甘草酸苷中甘氨酸的含量有關(guān)。甘氨酸是一種最簡單的氨基酸，在蛋白合成中很重要，參與了動物的許多生理反應(yīng)，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸濃度為1～16 mM時對B16鼠黑素瘤細(xì)胞增殖無明顯影響，可抑制由α-MSH誘導(dǎo)的B16F0黑素瘤細(xì)胞內(nèi)黑素的合成，且高劑量時可降低酪氨酸酶蛋白的表達(dá)，但對酪氨酸酶的活性無影響［8，9］。當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度為 100 μl/mL時，甘氨酸的濃度為 26.64 mmol/L，當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度為50 μl/mL時，甘氨酸的濃度在14 mmol/L以內(nèi)，對細(xì)胞的增殖無明顯影響，本研究中觀察到的復(fù)方甘草酸苷濃度在75 μl/mL以上時，酪氨酸蛋白表達(dá)降低但酪氨酸酶活性增強(qiáng)可能與甘氨酸濃度增加有關(guān)。

黑素分為真黑素和褐黑素兩種，是整個黑素形成過程中的兩種不同產(chǎn)物，真黑素為棕色或黑色，褐黑素為紅色或黃色。研究發(fā)現(xiàn)在黑素小體內(nèi)褐黑素合成過程中巰基的供體來源主要是游離的半胱氨酸，而不是谷胱甘肽［10，11］；培養(yǎng)基中L-酪氨酸和L-半胱氨酸的濃度變化在體外情況下可調(diào)節(jié)真黑素和褐黑素的比例。在酪氨酸酶的活性足以保證真黑素生成的情況下，控制褐黑素合成的因素是半胱氨酸而不是多巴醌。低濃度的L-半胱氨酸（0.2 mM）增加酪氨酸酶的活性促進(jìn)黑素的合成，而高濃度的L-半胱氨酸抑制酪氨酸酶的活性，使褐黑素的產(chǎn)生增加［12］。當(dāng)復(fù)方甘草酸苷注射濃度為100 μl/mL，鹽酸半胱氨酸的濃度為0.634 mmol/L，本研究中當(dāng)復(fù)方甘草酸苷濃度大于50 μl/mL時，黑素的含量又開始降低，可能與半胱氨酸濃度過高導(dǎo)致褐黑素產(chǎn)生增加有關(guān)。

甘草酸苷是由一分子的18β-甘草次酸和兩分子的葡萄醛酸構(gòu)成的親水性三萜皂苷，是甘草提取物中最重要的有效成分之一，具有抗炎、抗過敏和免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用。國內(nèi)學(xué)者粟玉珍等人的研究也發(fā)現(xiàn)18β-甘草酸濃度在低于3 mmol/L時對B16鼠黑素瘤細(xì)胞無毒性并有促進(jìn)增殖的作用，但當(dāng)濃度大于4 mmol/L，B16黑素瘤細(xì)胞生長受到抑制。而18β-甘草次酸濃度在大于10 μmol/L時及對B16黑素瘤細(xì)胞有抑制作用，且隨劑量的增大抑制作用增強(qiáng)［13］。上述研究表明低濃度的甘草次酸對B16鼠黑素瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，高濃度的甘草酸苷才對B16鼠黑素瘤細(xì)胞有抑制作用。B16鼠黑素瘤細(xì)胞中酪氨酸酶的活性和黑素的含量與甘草酸苷和甘草次酸濃度呈劑量依賴性增強(qiáng)，甘草酸苷濃度在2 mmol/L時達(dá)到最高，甘草次酸濃度在40 μmol/L時達(dá)到最高，此濃度對細(xì)胞有明顯的抑制作用，但在對細(xì)胞生長無抑制作用濃度（10 μmol/L以下）時對黑素合成無影響［13］，這與Jung和Abe等的研究結(jié)果一致。雷鐵池等研究發(fā)現(xiàn)甘草等中藥的乙醇提取物對蘑菇酪氨酸酶活性有明顯的抑制作用，并進(jìn)一步證實甘草活性成分18α-甘草酸雙胺鹽在100 μmol/L時，可明顯抑制酪氨酸酶的活性和降低黑素的含量而不影響細(xì)胞的增殖［14］。這與粟玉珍等的研究結(jié)果不一致，他們研究結(jié)果的差異可能甘草酸分子結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)，一個是18β-甘草酸，一個是18α-甘草酸雙胺鹽；也可能與濃度相關(guān)，從雷鐵池等研究結(jié)果的圖表中可以看出當(dāng)18α-甘草酸雙胺鹽濃度在1000μmol/ L時也表現(xiàn)為增加酪氨酸酶的活性和促進(jìn)黑素的合成。當(dāng)復(fù)方甘草酸苷注射濃度為100 μl/mL，甘草酸苷的濃度為4.25 mmol/L。本研究中復(fù)方甘草酸苷濃度在100 μl/mL和150 μl/mL時，酪氨酸酶的活性最高，這與粟玉珍等研究結(jié)果一致。復(fù)方甘草酸苷中的甘草酸苷主要是18β-甘草酸。

因此，復(fù)方甘草酸苷可直接激活黑素細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性促進(jìn)黑素的合成，此外還可以促進(jìn)黑素細(xì)胞內(nèi)合成的黑素轉(zhuǎn)運(yùn)到角質(zhì)形成細(xì)胞，這可能是臨床上復(fù)方甘草酸苷治療白癜風(fēng)有效的原因之一。

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（收稿:2016-05-01 修回:2016-06-12）

The effect of compound glycyrrhizin injection on the melanogenesis of B16 murine melanoma cells

YAN Kexiang，ZHU Lvchuan，ZHENG Zhizhong.
Department of Dermatology，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China
Correspondence author:ZHENG Zhizhong，E-mail:zhengzhizhong@medmail.com

Objective:To investigate the effect of compound glycyrrhizin injection on melanogenesis and mechanism of B16 murine melanoma cells.Methods:The influence of compound glycyrrhizin injection on the growth of B16 murine melanoma cells and the protein level and enzyme activity of tyrosinase，melanogenesis and melanosome transport was measured by CCK8，flow cytometry，NaOH splitting methods，dopa hydrocarbonylation and western-blotting technique，respectively.Results:（1）There was no influence on the growth of B16 murine melanoma cells when the concentration of compound glycyrrhizin injection was lower than 30 μL/mL；The growth rate of B16 murine melanoma cells was retarded when the concentration was higher than 50 μL/mL；The cells were greatly inhibited when the concentration reached 500 μL/mL.（2）The melanogensis and the protein level of tyrosinase were stimulated when the concentration of compound glycyrrhizin injection was between 10 μL/mL and 200 μL/mL；The melanogenesis was greatly stimulated when the concentration was 50 μL/mL，and the tyrosinase activity was increased in a concentration-dependent manner，which was peaked when the concentration was 100 μL/mL or 150 μL/mL.Conclusion:Compound glycyrrhizin injection can stimulate the melanogenesis and melanosome transport，and increase the tyrosinase activity.

compound glycyrrhizin injection；B16 murine melanoma cell；tyrosinase

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海，200040

鄭志忠，E-mail:zhengzhizhong@medmail.com