一氧化氮合酶基因轉染預防兔蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的實驗研究

伍偉俊， 張 瓏， 錢鎖開

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一氧化氮合酶基因轉染預防兔蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的實驗研究

伍偉俊1， 張 瓏2， 錢鎖開2

目的 通過血管內轉染內皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的方法，結合腦動脈病理學和超微結構觀察，探討eNOS基因轉染對蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的影響及其可能機制。方法 采用枕大池二次注血法建立兔蛛網膜下腔出血后遲發性腦血管痙攣模型。通過頸動脈微泵持續滴注方法進行基因轉染。45只兔隨機分為對照組、SAH組、AdeNOS組。各組分別于造模7 d后進行灌注固定取腦動脈行病理學和超微結構觀察；測量大腦中動脈直徑，同時免疫組化檢測eNOS的表達。結果 枕大池二次注血法造模后，血液廣泛聚積于蛛網膜下腔，以基底池為主；免疫組化證實AdeNOS組7 d重組eNOS基因表達，重組eNOS主要表達于內皮質。7 d腦組織HE染色顯示AdeNOS組腦動脈平均直徑較SAH組增大；電鏡下SAH組血管痙攣明顯，海馬神經元細胞腫脹，結構不完整，細胞核固縮，線粒體空泡化，AdeNOS組損傷明顯減輕。結論 采用頸動脈微泵持續滴注方法轉染eNOS基因至兔腦動脈可緩解蛛網膜下腔出血后遲發性腦血管痙攣，且這一效應可能通過增加內皮細胞重組內皮型一氧化氮合酶表達水平而實現。

蛛網膜下腔出血； 腦血管痙攣； eNOS

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是威脅人類健康的重要疾病之一，死亡及致殘率極高。 SAH的主要致死及致殘因素是出血本身、腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)，其中腦血管痙攣是蛛網膜下腔出血住院患者的最主要致死及致殘因素[1～3]。顱內動脈瘤破裂造成SAH后腦血管痙攣的發生率極高，在血管造影上證實有血管痙攣的比率可高達30%～70%，約20%～30%出現明顯神經損害的癥狀及體征，甚至危及患者的生命。自從Ecker等[4]于1951年首先報道了蛛網膜下腔出血后出現腦血管痙攣的現象以來，國內外對SAH誘發的腦血管痙攣的機制進行了大量的研究。SAH后紅細胞的溶解和血紅蛋白的釋放及氧化過程與腦血管痙攣的時間進程一致，故目前認為血紅蛋白是SAH后遲發性血管痙攣的主要啟動因素。近年來，腦血管病特別是腦動脈瘤的治療手段發展迅速，通過血管內介入方法已經成為許多發達國家的首選治療方法之一。因此，對于動脈瘤破裂導致的蛛網膜下腔出血患者，在血管內介入治療動脈瘤的同時，將防治血管痙攣的外源eNOS(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因導入腦血管，將可能達到提高治療的效果。本實驗通過建立二次SAH模型，觀察SAH后腦動脈的病理變化及內皮型一氧化氮合酶基因對它的影響，進一步探討SAH 后CVS發生的機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 新西蘭大白兔45只(購自南昌大學醫學院實驗動物中心)，雌雄不限，體質量2.5～3.3 kg。按將動物隨機分為3組：(1)對照組；(2)SAH組，制作SAH模型。(3)AdeNOS組，攜帶eNOS基因重組腺病毒(eNOS gene recombinant adenovirus，AdeNOS)由第二軍醫大學微生物教研室提供，制作SAH模型前用AdeNOS預處理。

1.2 兔SAH模型的制備 大白兔枕部剃毛，消毒后于枕部中線作一直切口，長2.5 cm，銳性分離直達寰枕筋膜，充分顯露寰枕部，用18 G套管針與軀體成角約30°穿刺枕大池；退出針芯，此時可見清亮腦脊液流出，取自體耳中央動脈的血2.5 ml(非抗凝)，緩慢注入枕大池內；退出套管針，局部壓迫后，縫合切口，取側臥頭低30°位放置30 min，使血液集積在腦基底池。SAH組和AdeNOS且均在首次注血后48h，由兔耳中央動脈取血2.5 ml，按上述方法，再次注入枕大池內。對照組動物先后2次枕大池內注入等量生理鹽水。

1.3 血管內滴注AdeNOS 制作方法：0 d，兔第一次枕大池注血前，頸部正中切開，暴露右側頸總動脈、頸內、外動脈系統。頸外動脈遠端結扎，動脈夾夾于頸總動脈近心端。頸外動脈結扎近端剪一小切口，取留置針從切口逆行插入，頭端置于頸外動脈起始部，固定微導管，微導管另一端通過注射針頭、二通連于微泵上的注射器。采用分段臨時阻斷滴注法[5]，微泵速度為0.6 ml/h，重組腺病毒滴度為8×1010pfu/ml。在滴注攜帶目的基因腺病毒的開始時用臨時阻斷夾阻斷頸總動脈血流20 min，然后放開血流20 min，后再阻斷頸總動脈血流20 min，微泵持續滴注重組腺病毒共1 h，共0.6 ml。滴注完畢后，退出留置針，頸外動脈殘端用絲線結扎。縫合頸部切口。頸部操作完成后行第一次枕大池自體血注入。

1.4 動物的觀察 按照Endo[6]神經功能評分標準，記錄手術前后各組動物飲食(以標準顆粒飼料、自來水喂養) 、精神狀態、活動情況及神經功能變化等指標。將SAH 后兔進食量減少的程度分為4 級：1 級為全量(100%)；2 級為>50%但<100%；3 級為<50%；4 級為0。神經功能根據動物精神狀態及運動情況分為4級：1 級，活動正常(無神經功能障礙)；2 級：輕度或可疑神經功能障礙(如精神差、嗜睡、活動減少等)；3 級：中度神經功能障礙(肢體無力、跛行、單癱等)；4 級：重度神經功能障礙(劃圈運動、行走困難、四肢癱瘓等)。

1.5 灌注固定及電鏡標本制作 所有白兔造模7 d后，以3%戊巴比妥鈉麻醉，暴露心臟，灌注固定。先以生理鹽水1000 ml 快速滴注，繼以4%多聚甲醛1000 ml灌注，前500 ml 快速滴完，后500 ml 緩慢滴注，灌注時間約為2 h。迅速開顱取右側大腦中動脈及周圍少許腦細胞，并于電鏡固定液中后固定8 h。將固定的組織經0.1 mol/l磷酸緩沖液漂洗，除去殘留固定劑；乙醇梯度脫水；將組織置入純丙酮液中浸透過夜，Epan812脫色，制成半薄切片，光鏡固定視野后經枸櫞酸鉛乙酸鈾染色。日立H600電鏡觀察并攝片。

1.6 光鏡標本制作 斷頭取腦后立即置于10%甲醛溶液內固定過夜，各組分別取右側大腦中動脈，置于4%多聚甲醛內固定4 h后，經梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。修成厚4 μm塊，行HE染色以及免疫組化檢測eNOS。常規酒精脫水，石蠟包埋，染色過程包括5個內容：脫蠟，染色，脫水，透明和封固。

1.7 免疫組化判斷標準及方法 從染色陽性細胞數判定染色強度，陽性細胞數的計量方法為：每個標本隨機選取1張切片，每張切片觀察5個高倍鏡視野，計數100個細胞中陽性細胞數的數目，陽性細胞數為0者記為(-)；<5%為(+)；5～<25%為()；25～<50%為()；≥50%為()。同一張照片由2位病理科醫師獨立觀察后一起做出判斷。結果判斷：eNOS陽性染色定位于胞漿，因此表達陽性的細胞主要在胞漿著色，呈弧形或散在棕黃色。

2 結 果

2.1 動物的一般情況 SAH后所有兔均有不同程度的神經功能異常，其表現為反應淡漠，食納差、運動減少、毛發雜亂，頸項強直，肢體癱瘓等。大部分兔注血后出現四肢抽搐，角弓反張，約15～30 s后緩解。動物行為異常以注血管當日明顯，次日略有緩解，二次注血后癥狀更為加重，以3～7 d為著。AdeNOS組1 d內行為異常較SAH組明顯，如拒食，嗜睡等，可能與頸部手術有關，3 d后均有所緩解。

2.2 兔腦血管病理變化

2.2.1 光學顯微鏡下所見 對照組未見明顯組織學改變，大腦中動脈管壁較薄，血管內膜完整，內皮細胞無壞死、脫落，形成連續的單細胞層，胞核無固縮、濃染；內彈力層平整、無皺縮和斷裂；血管平滑肌細胞呈扁平狀，細胞器完整(見圖1、圖2)。SAH組大腦中動脈管腔變窄，同時管壁增厚；血管內膜出現皺褶，內皮細胞向管腔突起，胞質中見有空泡形成，部分細胞胞核濃染固縮；內彈力層皺起，平滑肌細胞肥大、扭曲變形(見圖3、圖4)。AdeNOS組大腦中動脈管壁未見增厚，血管內膜完整，內皮細胞無壞死、脫落，內彈力層平整、無皺縮和斷裂；血管平滑肌細胞呈扁平狀，細胞器尚完整(見圖5、圖6)。用Image Pro Plus 6.0全自動圖象分析系統測定大腦中動脈內徑長。對照組、SAH組及AdeNOS組血管直徑分別為(0.52±0.034) mm、(0.34±0.021) mm、(0.49±0.045) mm。SAH組與對照組、AdeNOS組血管直徑之間比較，有顯著性差異(P<0.05)；但AdeNOS組與對照組比較，二者無顯著性差異(P>0.05)。

2.2.2 透射電鏡下超微結構 對照組見血管內皮細胞及平滑肌細胞結構基本正常，胞核完整，平滑肌纖維排列整齊，核周細胞器豐富、完整(見圖7、圖8)。SAH組表現為血管內皮細胞變方圓，腫脹、變性、部分壞死，胞漿電子密度下降，有的細胞內含有空泡，細胞間緊密連接欠完整，部分內膜脫落。平滑肌細胞不規則，腫脹明顯，部分細胞器喪失，細胞結構不完整(見圖9～圖11)。AdeNOS組痙攣程度明顯輕于SAH組，但與對照組比較仍可發現血管內皮細胞連接輕散，無內皮細胞脫落，線粒體輕度腫脹，結構基本正常，僅見少量空泡。彈力膜無明顯扭曲變形，平滑肌細胞內肌絲排列稍紊亂，細胞核內常染色質少(見圖12)。

2.3 兔大腦中動脈eNOS表達變化 免疫組化染色顯示，AdeNOS組右側大腦中動脈可見血管橫切面均有棕色染色，血管內膜棕色顯著，證實重組eNOS表達于腦動脈，主要表達于內皮質，平滑肌層和外膜少量表達。SAH大腦中動脈少量棕色染色(見圖13～圖15)。eNOS在3組大腦中動脈中總體的表達(見表1)。采用χ2檢驗，SAH組與AdeNOS組血管比較，有顯著性差異(P<0.05)，SAH組與比較無顯著性差異(P>0.05)，AdeNOS組與對照組血管比較無顯著性差異(P>0.05)。

表1 eNOS在大腦中動脈的表達

3 討 論

SAH所致的CVS是一個非常復雜的生化病理變化的綜合結果。隨著顯微神經外科及神經介入治療的迅速發展，手術本身造成的死亡及傷殘率都有明顯的降低，而腦血管痙攣的預防及治療就成為制約SAH治療效果的重要環節。經過幾十年的研究，腦血管痙攣的病因及發病機制還未十分確切，然而，大量研究表明高分子溶血產物氧合血紅蛋白是引起腦血管痙攣最初始的關鍵因素[7]：(1)氧合血紅蛋白，在蛛網膜下腔出血后紅細胞分解產生，與NO結合，阻止其進入血管平滑肌細胞；(2)血管內皮細胞受損而NO合酶活性下降，NO產量減少；(3)紅細胞釋放的氧合血紅蛋白及其代謝產生的自由基使NO滅活，并可刺激ET產生；(4)出血刺激及其他縮血管物質的釋放以及血NO減少，可促使內皮細胞ETmRNA表達。 此外，SAH后腦血管內皮所經歷的明顯的病理改變可能導致內皮表面的生化改變，破壞維持腦血管系統舒張和收縮的的自身平衡機制[8]。NO已被證明為EDRF，它的持續釋放為維持腦血管調節所必須。NO 從內皮細胞釋放后進入鄰近的平滑肌細胞，激活可溶性鳥苷酸環化酶(GC)，GC 產生環鳥苷酸(cGMP)，激活細胞內鈣泵使游離鈣進入細胞，并使平滑肌舒張。催化NO生

圖1 對照組大腦中動脈×200

圖2 對照組大腦中動脈×400

圖3 SAH組大腦中動脈×200

圖4 SAH組大腦中動脈×400

圖5 AdeNOS組大腦中動脈×200

圖6 AdeNOS組大腦中動脈×400

圖7 對照組大腦中動內膜及內皮細胞TEP×6000

圖8 對照組大腦中動平滑肌TEP×8000

圖9 SAH組大腦中動脈內皮細胞脫落TEP×6000

圖10 SAH組大腦中動脈內膜皺褶TEP×3500

圖11 SAH組大腦中動脈內膜及管腔狹窄TEP×6000

圖12 AdeNOS組大腦中動脈TEP×8000

圖13 對照組大腦中動脈eNOS免疫組化×400

圖14 SAH組大腦中動脈eNOS免疫組化×400

圖15 AdeNOS組大腦中動脈eNOS免疫組化×400

物合成的酶稱為一氧化氮合酶(NOS)。NOS以L-精氨酸(L-Agr)和分子氧為底物，生成NO和瓜氨酸，是NO合成過程中的重要限速因素。SAH后痙攣期血管壁中eNOS減少，證明了NO在SAH后腦血管痙攣發揮了重要作用[9]。

近年來研究發現鞘內注射補充外源性NO 能夠防止CVS發生[10，11]。Zimmerman[12]發現將NO控釋體置于痙攣血管周圍能有效抑制血液因素引起的血管痙攣。但是SAH后CVS可能持續14 d左右時間，現有的NO供體普遍存在半衰期短的缺欠，反復鞘內給藥增加了感染和顱內壓波動的風險，而其全身給藥由于對外周血壓的影響很大，無法達到在蛛網膜下腔內有效治療濃度。故而尋找一種安全、有效、持續的合成NO的物質相當重要。Khurana等在腺病毒介導的重組內皮細胞NO合成酶的基因轉移中，成功表達了NOS，把重組后的腺病毒載體注入蛛網膜下腔，腦脊液中NO濃度明顯升高，對照組出現明顯腦血管痙攣，而治療組則沒有，7 d在動脈外膜及軟腦膜通過Western blot和免疫組化分析顯示eNOS的表達[13]。這些發現為eNOS轉染治療血管痙攣和內皮源性功能障礙提供了堅實基礎。然而，上述研究僅僅是將重組腺病毒注入腦池，而血管內滴入轉染內膜尚在起步階段。Kuoll等[5]將滴度1×1010pfu /ml包有eNOS腺病毒注入阻斷血流的大鼠頸動脈，共轉染20 min，4 d后免疫染色證實動脈表達重組基因，頸動脈基礎cGMP水平顯著提高。Soat等[14]將攜帶eNOS的腺病毒注入阻斷血流的高膽固醇血癥兔的頸動脈，結果證實重組eNOS表達于兔頸動脈，并改善了內皮依賴性的血管舒張。Barr等將重組B-gal的腺病毒經導管有冠狀動脈導入兔心臟，5 d發現冠狀動脈有B-gal的表達[15]。張瓏等將攜帶eNOS的腺病毒微泵持續滴入大鼠頸動脈，7 d后動脈內膜可見eNOS的表達[16]。在本實驗中，血管內AdeNOS組腦血管直徑較SAH組明顯增粗，免疫組化證實血管內膜eNOS陽性表達明顯增多，提示eNOS在蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣中有相當重要的作用。eNOS的增多，進而合成和釋放的NO增多，從而在一定程度上維持了SAH后血管舒張與收縮的平衡。

蛛網膜下腔出血遲發性腦血管痙攣發病機制復雜，目前尚未完全闡明，治療手段局限，隨著神經介入技術的廣泛開展，在SAH患者超早期全腦血管造影時即可順便通過造影管給予攜帶eNOS基因的重組腺病毒，順利完成基因轉染可能是一種特異性治療。希望在不久的將來重組eNOS基因能夠在人類蛛網膜下腔出血后遲發性腦血管痙攣的預防和治療中發揮作用。

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Experimental study on Endothelial nitric oxide synthase gene transfection in prevention of cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in rabbits

WUWeijun，ZHANGLong，QIANSuokai.

(DepartmentofNeurosurgery，YichunPeople’sHospitalofJiangxiProvince，336000China)

Objective To investigate the effects of intravascular transfection of eNOS gene on cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in rabbits，and explore the related mechanism through observating pathohistology and ultrastructural structure of cerebral arteries. Methods Delayed cerebral vasospasm model after SAH was developed by injecting arterial blood twice through cisterna magna. Recombinant adenovirus was injected into carotid arterial to transfect the rabbits. Forty-five rabbits were randomly divided into three groups，control group，SAH group and AdeNOS group. SAH models were made by two injections of 2.5 ml fresh and non-heparinized arterial blood into the citerna magna of the rabbits in SAH and AdeNOS groups. All animals were killed using perfusion-fixation on day 7 and the brain arteryies tissues were removed for pathohistology and ultrastructural studies. Immunohistochemical method was used for detecting the expression of eNOS. Results In SAH modlel，blood accumulated in the subarachnoid space，especially in the basal cistern. Immunohistochemistry confirmed that recombinant eNOS gene expressed mainly in the endothelium. Under microscope，the average diameters of the cerebral arterial in AdeNOS group were larger than that in SAH group，and there was less vasospasm under electron microscope. SAH group had hippocampal tissue edema and widened perivascular space. SAH group had marked pathological changes of neuron ultrastructure including cell swelling，structural integrity，nuclear condensation，mitochondrial vacuolization. Conclusion This study suggests that continuous use of carotid artery infusion micro-pump method in rabbit cerebral artery make endothelial cells express eNOS，leading to relieve delayed CVS following SAH.

Subarachnoid hemorrhage； Ccerebral vasospasm； eNOS

1003-2754(2016)01-0013-05

2015-01-29；

2015-05-25

(1.江西省宜春市人民醫院神經外科，江西 宜春 336000；2.解放軍第九四醫院神經外科，江西 南昌 330002)

張 瓏，E-mail：zhanglong1995@163.com

R743.35

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