慢性乙肝患者血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1的表達與病情的相關性

孫立華，朱斌，王昕紅

（新鄉醫學院第一附屬醫院感染疾病科，河南 新鄉 453100）

慢性乙肝患者血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1的表達與病情的相關性

孫立華，朱斌，王昕紅

（新鄉醫學院第一附屬醫院感染疾病科，河南 新鄉 453100）

目的研究慢性乙型肝炎患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面程序性死亡分子-1（PD-1）/程序性死亡分子-1配體（PD-L1）的表達及其與病情的相關性。方法選擇慢性乙型肝炎患者90例和健康體檢者82例進行研究。分別納入慢性乙肝組和健康對照組，檢測外周血細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1、PD-L1的表達量以及血清生化指標。結果慢性乙肝組患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量顯著高于健康對照組，乙型肝炎病毒載量越高、外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量越高；慢性乙肝組患者血清中ALT、AST、IL-6、IL-8的含量均顯著高于健康對照組且與外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量呈正相關。結論慢性乙型肝炎患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量顯著升高且與肝損傷程度、炎癥反應程度相關。

慢性乙型肝炎；細胞毒性T淋巴細胞；程序性死亡分子-1；炎癥反應

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的消化系統傳染性疾病，細胞免疫應答是機體清除HBV病毒的重要機制，機體的免疫功能決定了慢性乙型肝炎的臨床預后和轉歸。T淋巴細胞是介導細胞免疫最主要的細胞群，慢性乙型肝炎患者存在不同程度的T淋巴細胞質量低下、數量不足，機體無法通過自身的細胞免疫功能來清除HBV病毒[1]。T淋巴細胞免疫應答功能的強弱受到了多種共刺激信號分子的調節，其中程序性死亡分子-1（programmed death-1，PD-1）是決定T細胞數目和功能最關鍵的負性共刺激信號分子，PD-1與其配體程序性死亡分子-1配體（programmed death ligand-1，PD-L1）結合能夠誘導T細胞凋亡[2]。在下列研究中，筆者分析慢性乙型肝炎患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1的表達及其與病情的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2012年8月-2015年1月于新鄉醫學院第一附屬醫院接受治療的慢性乙型肝炎患者90例納入研究的慢性乙肝組。其中，男性51例，女性39例，年齡34～67歲，平均（47.12±8.05）歲，均符合世界衛生組織對于慢性乙型肝炎的診斷標準且未接受過抗病毒治療，入組患者在了解研究過程后簽署知情同意書。取同期在本院進行健康體檢、不伴有肝功能異常的正常人群82例作為健康對照組。其中，男性43例，女性39例，年齡30～71歲，平均（45.84±8.31）歲。本次研究經醫院倫理委員會審核并批準，入組研究對象的基線資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），可以進行進一步比較。

1.2血清生化指標的檢測

取新鮮外周血10 ml，離心得到血清后，采用全自動生化分析儀測定谷氨酸-丙酮酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）含量，采用酶聯免疫吸附試劑盒測定白細胞介素6（interleukin6，IL-6）、白細胞介素8（interleukin8，IL-8）的含量。

1.3外周血細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PDL1表達

取新鮮外周血10ml，采用密度梯度法分離單個核細胞，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）調節細胞密度為1×107/ml。在每個反應管中加入上述細胞懸液100μl，而后避光孵育APC標記的CD3、PerCP標記的CD8、FITC標記的PD-1、FITC標記的PD-L1抗體20 min，PBS洗滌2次后棄上清液，加入1%多聚甲醛300μl固定，在流式細胞儀上以CD3+T細胞為門，計數CD3+CD8+，測定PD-1、PD-L1陽性細胞占CD3+CD8+細胞的比例。

1.4統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量數據用均數±標準差（x±s）表示，用t檢驗。多組間計量資料的比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，兩指標間的相關性用Pearson檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PDL1的表達

慢性乙肝組患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量顯著高于健康對照組，兩組間的差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1　兩組受試者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1的表達（%±s）

表1　兩組受試者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1的表達（%±s）

組別PD-1PD-L1慢性乙肝組（n=90）39.42±5.9547.26±6.61健康對照組（n=82）14.52±3.2227.62±3.64 t值17.4939.126 P值0.0010.005

2.2不同HBV載量患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1的表達

不同HBV載量患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量有差異；HBV載量越高，外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量越高。見表2。

表2　不同HBV載量患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1的表達（%±s）

表2　不同HBV載量患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1的表達（%±s）

HBV-DNA/（拷貝/ml）PD-1PD-L1 <3lg（n=21）24.22±4.5235.58±5.22 3～6lg（n=38）35.58±5.7145.29±6.38 >6lg（n=31）48.51±7.7458.25±8.14 F值8.3957.614 P值0.0060.009

2.3血清中生化指標

慢性乙肝組患者血清中ALT、AST、IL-6、IL-8的含量均顯著高于健康對照組，兩組間的差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3　兩組受試者的血清生化指標比較（±s）

表3　兩組受試者的血清生化指標比較（±s）

HBV-DNA/（拷貝/ml）ALT/（u/L）AST/（u/L）IL-6/（pg/L）IL-8/（pg/L）慢性乙肝組（n=90）93.69±12.5176.61±10.33204.51±34.86273.69±41.36健康對照組（n=82）18.92±2.6212.48±1.8524.68±5.1448.52±7.42 t值35.59542.91171.39858.592 P值0.0020.0010.0040.003

2.4PD-1/PD-L1表達量與血清生化指標的相關性

外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量與血清ALT、AST、IL-6和IL-8的含量呈正相關。見表4。

表4　PD-1/PD-L1表達量與血清生化指標的相關性

3 討論

目前的研究認為，造成慢性乙型肝炎患者體內HBV持續感染的關鍵病理環節是細胞免疫功能低下，尤其是細胞毒性T細胞所介導的細胞免疫應答低下。但是，關于細胞毒性T細胞功能低下的原因尚未明確。細胞毒性T細胞的功能不僅受到輔助性T細胞、調節性T細胞的影響，細胞毒性T細胞本身表達多種共刺激分子并且能夠影響細胞的數目和功能。在諸多共刺激信號分子中，PD-1/PD-L1是最關鍵的負性共刺激信號[3]。筆者對慢性乙肝患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1表達量的分析也證實，慢性乙肝組患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量顯著高于健康對照組。這就說明慢性乙型肝炎患者體內存在PD-1/PD-L1所介導的負性共刺激信號過度激活的現象。

PD-1是CD28/B7家族的成員之一，主要表達活化的CD4+和CD8+T細胞、B細胞，其配體PD-1L主要表達與B細胞、T細胞和巨噬細胞。PD-1與PDL1以配體-受體方式結合后能夠誘導靶細胞發生凋亡、造成細胞功能減退。細胞毒性T淋巴細胞表面的PD-1和PD-L1主要與細胞凋亡有關[4-5]。為了進一步明確外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1與HBV感染的關系，筆者分析了不同HBV載量患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1的表達，結果顯示：HBV載量越高，外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量越高。這就說明細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1/PD-L1表達量的增加與HBV感染加重、載量增加有關。

HBV持續感染會造成慢性乙型肝炎患者肝功能損傷，表現為肝細胞破裂、胞漿中多種轉氨酶釋放入血[6]。ALT和AST是臨床上評價肝功能損傷最常用的生化指標，筆者的分析證實，慢性乙肝組患者血清中ALT、AST的含量顯著高于健康對照組且與外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量呈正相關。HBV感染所激活的炎癥反應是造成肝細胞損傷的重要環節，IL-6和IL-8是介導炎癥反應關鍵的細胞因子[7-8]。筆者對血清炎癥因子含量的分析證實，慢性乙肝組患者血清中IL-6、IL-8的含量顯著高于健康對照組且與外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量呈正相關。由此說明外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量與慢性乙肝患者肝功能損傷程度、炎癥反應程度等病情密切相關。

綜上所述，慢性乙型肝炎患者外周血中細胞毒性T淋巴細胞表面PD-1和PD-L1的表達量顯著升高且與肝損傷程度、炎癥反應程度相關。

[1]YE B,LIU X,LI X,et al.T-cell exhaustion in chronic hepatitis B infection:current knowledge and clinical significance[J]. Cell Death Dis,2015,19(6):DOI:10.1038/cddis.2015.42.

[2]謝冬英,陳鳳娟,鄧洪,等.慢性乙型肝炎病毒感染者外周血單個核細胞表達程序性死亡分子-1及其配體與血清乙型肝炎病毒DNA水平的相關性[J].中華傳染病雜志,2011,29(4):216-220.

[3]王棟,顧錫炳,朱銀芳,等.乙肝肝硬化患者HBVDNA水平與細胞毒性T淋巴細胞表面程序性死亡受體-1表達及肝功能的關系[J].實用醫學雜志,2015,31(7):1072-1075.

[4]CHENG H Y,KANG P J,CHUANG Y H,et al.Circulating programmed death-1 as a marker for sustained high hepatitis B viral load and risk of hepatocellular carcinoma[J].PLoS One,2014, 9(11):DOI:10.1371/journal.pone.0095870.

[5]FENG C,CAO L J,SONG H F,et al.Expression of PD-L1 on CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells of patients with chronic HBV infection and its correlation with clinical parameters[J].Viral Immunol,2015,28(8):418-424.

[6]鄭智鑾,陳黎明,孔霜撣.慢性重型乙肝血清病毒水平與病情及預后關系研究[J].中國醫藥導報,2013,10(3):55-57.

[7]WU H L,KAO J H,CHEN T C,et al.Serum cytokine/chemokine profiles in acute exacerbation of chronic hepatitis B:clinical and mechanistic implications[J].J Gastroenterol Hepatol,2014,29(8): 1629-1636.

[8]FANG Z,LI J,YU X,et al.Polarization of monocytic myeloidderived suppressor cells by hepatitis B surface antigen is mediated via ERK/IL-6/STAT3 signaling feedback and restrains the activation of T cells in chronic hepatitis B virus infection[J].J Immunol,2015,195(10):4873-4883.

（張蕾編輯）

Correlation of expression of PD-1/PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B and disease severity

Li-hua Sun，Bin Zhu，Xin-hong Wang
（Department of Infectious Disease，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang，Henan 453100，China）

Objective To study the expression of PD-1/PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B and its correlation with disease severity.Methods A total of 90 cases of chronic hepatitis B patients and 82 cases of healthy subjects were respectively enrolled into the chronic hepatitis B group and the healthy control group.Expressions of PD-1 and PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood and serum biochemical indices were determined.Results Expressions of PD-1 and PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood of the chronic hepatitis B group were significantly higher than those in the healthy control group.Patients with higher HBV load also had a higher expression of PD-1 and PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood.And serum ALT，AST，IL-6，IL-8 contents of chronic hepatitis B groups were significantly higher than those in healthy control group and positively correlated with PD-1 and PD-L1 expression on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood.Conclusions The expression of PD-1 and PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B significantly elevates and correlates with the degree of liver injury and the degree of inflammation.

chronic hepatitis B；cytotoxic T lymphocyte；programmed death-1；inflammatory response

R 512.62

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.007

1005-8982（2016）20-0030-04

2016-04-05