響應面法優化商洛核桃青皮多糖提取工藝

何念武，丁淑平，李堆淑，趙艷艷

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

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響應面法優化商洛核桃青皮多糖提取工藝

何念武，丁淑平，李堆淑，趙艷艷

(商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

為探究商洛核桃青皮多糖熱水浸提的最佳工藝條件，以多糖提取率為響應值，在單因素實驗基礎上，以液料比、提取時間、提取溫度為考察因素，采用響應面法(RSM)建立數學模型，篩選最佳提取工藝。研究結果表明，商洛核桃青皮多糖最佳提取條件為：液料比30∶1，浸提時間2.5 h，提取溫度90 ℃，在此條件下多糖提取率可達到7.01%。各因素對提取率影響的大小順序為：提取溫度>提取時間>液料比。此工藝合理可行，可用于商洛核桃青皮多糖的提取。

商洛核桃青皮；多糖；響應面法；工藝優化

核桃青皮，又名青龍衣，為胡桃科植物胡桃楸(JuglansmandshuricaM.)和胡桃(JuglansregialL.)的未成熟果實的綠色外果皮，主產于東北、山東、河北等地[1]，自古以來一直作為民間常用中藥材，辛、苦、澀、平，有清熱解毒、祛風療癬、止痛止痢等廣泛的藥用價值[2]。研究表明，青龍衣有效成分對于人類的健康保護以及抗微生物活性方面有著重要的作用[3-4]。多糖作為核桃青皮主要化學成分之一，對其進行深入研究具有重要意義。此外，有研究表明多糖都具有免疫調節、降血糖、降血脂、抗腫瘤等諸多功效[5-6]，這對深度開發商洛核桃青皮多糖是一個很好的啟發。然而，近年來國內外學者對核桃青皮的探索主要集中在胡桃醌、多酚類等化學成分的分離制備以及藥理活性研究等方面[7-10]。

核桃青皮為核桃外部一層厚厚的綠色果皮，核桃果實采摘后脫掉的青皮堆放在田間地頭或傾倒在河里，不僅會造成資源的浪費，還會給生態環境帶來嚴重的污染[2,4]。如果對核桃青皮中的有效物質加以提取、分離、綜合利用，既可以保護環境，還可以增加果農收入[2,4]。為此，本文采用響應面法對商洛核桃青皮多糖的提取工藝進行優化，旨在為下一步商洛核桃青皮多糖活性機制研究及進一步開發利用商洛核桃青皮資源奠定基礎和提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料

商洛核桃青皮，2014年8～9月采自商洛洛南縣寺坡中山，經商洛學院張小斌教授鑒定為胡桃科植物胡桃楸(JuglansmandshuricaM.)的未成熟果實的外果皮。洗凈，曬干至恒重備用。

1.2商洛核桃青皮多糖的提取與精制

將干燥的核桃青皮粉碎過100目篩，精密稱取20 g，按一定液料比在熱水中浸提數小時。提取結束后4000 r/min離心10 min，沉淀再加水重復浸提兩次，而后離心，合并上清液。pH調為6.0后，加入2%活性炭脫色30 min。在60 ℃條件下減壓濃縮至200 mL左右。加入4倍體積的無水乙醇，充分攪拌后置于4 ℃冰箱沉淀12 h，然后4000 r/min離心10 min，重復操作3次，每次均采用離心分離上清液與沉淀。回收上清液中的乙醇，沉淀加水配成一定體積的多糖水溶液，Sevage法除蛋白處理4次。將去蛋白的多糖提取液透析48 h，每8 h換一次水。濃縮透析袋內的多糖液至黏稠，以乙酸乙酯、氯仿反復交叉洗之，最后以氯仿洗之。置鼓風干燥箱中干燥(40 ℃)，得精制商洛核桃青皮多糖。以下述公式計算多糖提取率：

多糖提取率(%)=多糖干品質量/商洛核桃青皮粉末質量×100%。

1.3多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。精確吸取葡萄糖標準液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至50 mL。以上不同質量濃度溶液各取1.0 mL，分別加入質量分數為5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻。然后迅速加入濃硫酸3.0 mL，立即搖勻。置于95 ℃水中恒溫加熱30 min，取出冷卻至室溫，于490 nm處測吸光度(A)值。以葡萄糖濃度為橫坐標，以對應吸光值為縱坐標，繪制標準曲線(圖1)，得回歸方程為：y=0.0505x+0.0056，R2=0.9988(n=8)。從圖中可以看出，在10～80 μg/mL質量濃度范圍內葡萄糖濃度與吸光度呈良好的線性關系。

圖1　葡萄糖標準曲線

1.4單因素實驗

用水提醇沉法提取商洛核桃青皮中的水溶性多糖，深入研究液料比、浸提時間、浸提溫度等因素對多糖提取率的影響。

液料比：分別稱取60 g的商洛核桃青皮粉末，按液料體積質量比5∶ 1、10∶ 1、15∶ 1、20∶ 1、25∶ 1、30∶ 1，加入蒸餾水。80 ℃水浴浸提2.5 h，4000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液。依法提取3次，合并上清液。

時間：分別稱取60 g商洛核桃青皮粉末, 液料比為30∶ 1，在80 ℃水浴中分別浸提1、2、3、4、5 h, 離心后棄沉淀收集上清液。依法提取3次，合并上清液。

溫度：分別稱取60 g商洛核桃青皮粉末，液料比為30∶ 1，分別置于50、60、70、80、90 ℃恒溫水浴鍋中，浸提2.5 h，離心后棄沉淀收集上清液。依法提取3次，合并上清液。

1.5響應曲面優化設計實驗

依據單因素實驗結果，選擇液料比、浸提時間、浸提溫度為試驗因素，根據Box-Behnken設計，進行三因素三水平的響應面分析實驗，以商洛核桃青皮多糖得率為響應值，利用Design-Expert 8.05b實驗設計軟件對實驗數據進行分析，因素水平設計見表1。

表1　響應面分析因素及水平

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果分析

2.1.1液料比對商洛核桃青皮多糖提取率的影響從圖2可以看出，液料比從5∶1增加到30∶1時，多糖提取率顯著增加；液料比增加到20∶1后，多糖提取率增幅放緩。這可能是隨著液料比的不斷擴大，核桃青皮中殘留的多糖成分越來越少的緣故。這與何念武等[11]的研究結論一致。

圖2　液料比對商洛核桃青皮多糖提取率的影響

2.1.2浸提時間對商洛核桃青皮多糖提取率的影響由圖3可知，提取時間對商洛核桃青皮多糖提取率的影響先是快速增長而后趨于平緩。多糖提取率在3 h后趨于平緩的原因可能是：隨著提取時間的不斷延長，商洛核桃青皮中的多糖成分大部分已經被浸提出來，商洛核桃青皮中固有的多糖成分越來越少。為減少能耗，節省時間，選擇提取時間為3 h。

圖3　提取時間對商洛核桃青皮多糖提取率的影響

2.1.3浸提溫度對商洛核桃青皮多糖提取率的影響由圖4可知，提取溫度在50～80 ℃之間，多糖的提取率隨著溫度的升高呈快速遞增趨勢；從80～90 ℃，提取率緩慢降低。這可能是由于溫度過高，從商洛核桃青皮中提取的多糖有所降解，使提取率下降。因此選擇浸提溫度為80 ℃。

圖4　提取溫度對商洛核桃青皮多糖提取率的影響

2.2響應面分析

2.2.1響應面實驗結果的方差分析和顯著性檢驗在單因素實驗的基礎上，以A=(Z1-25)/5，B=(Z2-3)/0.5，C=(Z3-80)/10為自變量，以多糖提取率Y為響應值，進行響應面分析實驗，實驗結果見表2。

應用統計分析軟件Design-Expert 8.05b對數據進行分析，回歸分析結果見表3，回歸方程為：Y=5.17+0.16A+0.3B+0.83C-0.00375AB-0.15AC+0.34BC+0.22A2-0.23B2+0.38C2。

當P值小于0.05時，即表示該項指標顯著。從表3中可以得出，本實驗的模型顯著(P=0.0035)，失擬項不顯著(P=0.3814)，說明該模型是合理的。由P值可知，各因素對提取率影響的大小順序為：提取溫度>提取時間>液料比，其中，B、C、BC、C2對Y的影響顯著，A對Y的影響不顯著。回歸模擬的R2為0.9665，說明模型的擬合程度很好，響應值的96.65%是由所選變量即液料比、提取時間、提取溫度引起的，故可以用來分析和預測商洛核桃青皮多糖的提取率。

2.2.2響應面分析液料比(A)與提取時間(B)對商洛核桃青皮多糖提取率影響的響應面曲線結果如圖5所示。從圖5中可以看出，液料比與浸提時間之間的交互作用不顯著，這與方差分析結論一致。整個響應曲線成凸形，說明商洛核桃青皮多糖提取率可達到最大值。

表2　響應面實驗設計方案及實驗結果

表3　商洛核桃青皮多糖提取率的回歸方差分析

圖5　液料比與提取時間對多糖提取率影響的響應面曲線3D圖

由圖6可知，當提取時間為2.5 h時，液料比在較大范圍內均可以得到較大的響應值Y；浸提溫度編碼在0.55～1時，核桃青皮多糖得率可達到最大值。這與方差分析結果相吻合。

圖6　液料比與提取溫度對多糖提取率影響的響應面曲線3D圖

由圖7可知，當液料比取30∶ 1時，浸提時間與浸提溫度之間的交互作用顯著；當浸提時間編碼在0.25～1，浸提溫度編碼在0.8～1時，多糖得率可達到最大值。

圖7　提取時間與提取溫度對多糖提取率影響的響應面曲線3D圖

2.2.3驗證實驗由響應面預測模型得出的最優工藝條件為：液料比為30∶ 1，提取時間為2.5 h，提取溫度為80 ℃，預測多糖的提取率為6.92%。為了驗證由響應面預測分析的最優條件，采用上述條件進行3次驗證實驗，實際測得多糖提取率平均值為7.01%，與模型預測值接近。因此，采用響應面法優化商洛核桃青皮多糖的得率有一定的實際意義，對現實生產具有一定的參考價值。

3　結論

本文在單因素實驗的基礎上，將響應面法應用于優化商洛核桃青皮多糖的提取工藝，得出最佳工藝條件：液料比為30∶1，提取時間為2.5 h，提取溫度為80 ℃。在此條件下，多糖預測得率為6.99%，而實際實驗測定值為7.01%±0.22%，此條件下實驗值與預測值非常接近，說明該預測模型比較可靠，可以為商洛核桃青皮多糖的大規模生產提供理論依據。另外，研究發現提取時間、提取溫度、提取時間與提取溫度的交互項，以及提取溫度的二次項對多糖提取率的影響顯著，說明液料比、提取時間和提取溫度對商洛核桃青皮多糖提取率的影響不是簡單的線性關系。各因素對提取率影響的大小順序為：提取溫度>提取時間>液料比。

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[5] Oliveira I, Anabela S, Isabel C F R, et al. Total phenols, antioxidant potential and antimicrobial activity of walnut (JuglansregiaL.) green husks[J]. Food Chem Toxicol, 2008, 46(7): 2326-2331.

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(責任編輯：許晶晶)

Optimization of Extraction Process of Polysaccharide from Shangluo Walnut Green Peel by Response Surface Method

HE Nian-wu, DING Shu-ping, LI Dui-shu, ZHAO Yan-yan

(College of Biopharmaceutical and Food Engineering, Shangluo University, Shangluo 726000, China)

In order to explore the optimum process conditions for the hot-water extraction of polysaccharide from Shangluo walnut green peel, the author took polysaccharide extraction rate as response value, took water-material ratio, extraction time and extraction temperature as investigated factors, used response surface method (RSM) to establish a mathematical model based on the results of single-factor experiments, and screened out the best polysaccharide extraction conditions as follows: water-material ratio 30∶1, extraction time 2.5 h, and extraction temperature 90 ℃. Under these conditions, the polysaccharide extraction rate could reach 7.01%. The influence of various factors on polysaccharide extraction rate showed the following order: extraction temperature > extraction time > water-material ratio. This process is reasonable and feasible, and it can be used for the extraction of polysaccharide from Shangluo walnut green peel.

Shangluo walnut green peel; Polysaccharide; Response surface method; Process optimization

2016-05-03

陜西省教育廳專項科研計劃項目“商洛核桃青皮提取物防治煙草病蟲害關鍵技術研究” (15JK1219)；商洛市煙草公司橫向科研項目“核桃青皮提取物防治煙草病毒病關鍵技術研究”(KJ-2014-02)。

何念武(1985─)，男，陜西商洛人，講師，碩士研究生，主要從事中藥材成分分析及活性研究。

S664.1

A

1001-8581(2016)10-0056-04