不同佐劑制備的雞坦布蘇病毒滅活疫苗免疫效果比較

劉宇卓，李嘉萍，李 銀，黃欣梅，趙冬敏，韓凱凱，楊 婧，劉青濤，畢可然

(江蘇省農業科學院 獸醫研究所/農業部 動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室/國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京210014)

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不同佐劑制備的雞坦布蘇病毒滅活疫苗免疫效果比較

劉宇卓，李嘉萍，李 銀，黃欣梅，趙冬敏，韓凱凱，楊 婧，劉青濤，畢可然

(江蘇省農業科學院 獸醫研究所/農業部 動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室/國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京210014)

以不同材料為佐劑制備坦布蘇病毒滅活疫苗，用ELISA方法檢測免疫雞不同時間抗體產生的情況，以選擇最佳制苗佐劑。取40只1月齡SPF雞，隨機分成8組，以不同的佐劑組合制備疫苗，免疫7個組(包括白油組、白油+IL-2組、鋁膠組、鋁膠+IL-2組、蜂膠組、蜂膠+IL-2組、IL-2組)，另設不免疫對照1個組，分別于免疫前及免疫后1周、2周、3周和4周采血，用已建立的ELISA方法檢測血清中的ELISA抗體，比較不同佐劑滅活疫苗的免疫效果。結果表明：以白油+IL-2作為佐劑組的滅活疫苗效果最好，產生的抗體水平優于其他各組，免疫后3周ELISA抗體可達到1∶800以上，是較理想的制備坦布蘇病毒滅活疫苗的佐劑。

佐劑；坦布蘇病毒；滅活疫苗；免疫效果

2010年4月，我國多地相繼暴發了一種由黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)的坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)感染種鴨、種鵝、蛋鴨、蛋鵝的事件，其是以產蛋驟然大幅下降，甚至停產為主要臨床特征，并伴有食欲急劇減退、高熱、運動障礙，排綠色糞便的急性傳染病[1-4]。肉鴨、肉鵝均可感染，之后陸續有研究報道，雞也可感染此病毒而發病，臨床癥狀及表現與鴨、鵝相似[5-8]。目前學者在 TMUV 研究領域取得了重要進展，國內外研究者針對病毒分離、鑒定及生物學特性做了大量研究工作[9-12]。已有研究證明鴨坦布蘇病毒能夠有效誘導抗體和細胞免疫反應，也有針對鴨的疫苗在研發中，但針對雞的TMUV滅活疫苗研發及其佐劑方面的研究較少。

疫苗佐劑是能夠非特異性地改變或增強機體對抗原特異性免疫應答、發揮輔助作用的一類物質。本研究通過比較白油、鋁膠、蜂膠、白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)作為佐劑單獨使用及聯合使用后，對TMUV滅活疫苗免疫雞后產生抗體的影響，以期能篩選出免疫效果佳、用于雞的坦布蘇病毒滅活疫苗的佐劑。

1　材料與方法

1.1病毒株

坦布蘇JS804株，由江蘇省農業科學院獸醫所禽病實驗室分離、鑒定、保存。

1.2實驗動物

本研究室飼養1月齡SPF雞。

1.3主要試劑

白油、鋁膠均由本研究室保存；IL-2由南京農業大學動物醫學院寄生蟲實驗組提供；蜂膠購自老山藥業股份有限公司；酶標二抗為HRP標記的兔抗雞IgY，購自美國EARTH公司；BSA、TMBS均購自BIOSHARP公司。雞坦布蘇病毒ELISA抗體檢測試劑盒，由本研究室制備并保存。

1.4主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器(SY-450)購自徐州圣業醫療器械有限責任公司；精密電子天平(AA200)購自美國丹佛儀器公司(Denver Instrument)；二級生物安全柜購自西班牙Telsta BioIIA公司；優普超純水制造系統購自南京優普實驗儀器有限公司；高速冷凍離心機購自德國艾本德公司(Eppendorf)；低溫冰箱購自海爾公司；電熱恒溫培養箱(DNP-9162A)購自上海光都儀器設備有限公司；酶標儀(ELx800)購自美國伯騰儀器有限公司(Biotek)。

1.5抗原制備

取TMUV細胞毒，向200 mL TMUV細胞毒中加入0.6 mL的甲醛，充分混勻，37 ℃滅活24 h。

1.6不同佐劑滅活疫苗的制備

1.6.1白油佐劑取47 mL白油與3 mL司本-80混合，高溫滅菌，即為油相；取滅活后的TMUV 25 mL，加入1.5 mL吐溫-80混勻，即為水相；將油相用乳化儀低速攪拌，加入水相，高速攪拌1 min，即制成1號苗。

1.6.2白油+IL-2佐劑取滅活后的TMUV 5 mL，加入1 mL濃度為4 mg/mL的IL-2、 0.3 mL吐溫-80，混勻，即為水相；將油相用乳化儀低速攪拌，加入水相，攪拌1 min，即制成2號苗。

1.6.3鋁膠佐劑取7.5 g鋁膠，加入50 mL PBS，充分溶解，用乳化儀低速攪拌，溶解后的鋁膠與滅活后的TMUV以2∶1的體積比混合，攪拌1 min，即制成3號苗。

1.6.4鋁膠+IL-2佐劑取10 mL溶解后的鋁膠溶液，用乳化儀低速攪拌，加入滅活后的TMUV 5 mL和1 mL IL-2,攪拌1 min，即制成4號苗。

1.6.5蜂膠佐劑取3 g蜂膠，加入50 mL 95%酒精，37 ℃、溶解24 h，取5 mL溶解后的蜂膠溶液，用乳化儀低速攪拌，加入滅活后的TMUV 5 mL，攪拌1 min，即制成5號苗。

1.6.6蜂膠+IL-2佐劑取5 mL溶解后的蜂膠溶液，用乳化儀低速攪拌，加入滅活后的TMUV 5 mL和1 mL IL-2，攪拌1 min，即制成6號苗。

1.6.7IL-2佐劑滅活后的TMUV和IL-2充分混勻, 用乳化儀攪拌1 min，即制成7號苗。

1.7疫苗的免疫接種

取1月齡SPF雞40羽，隨機分成8組，每組5只，第1～7組按表1腿部肌肉注射不同佐劑的滅活疫苗，第8組不接種作為空白對照。

表1　動物分組及免疫情況

1.8免疫效果的檢測

1.8.1采血檢測分別于免疫前及免疫后1、2、3、4周在雞翅下靜脈采血，37 ℃放置1 h，于4 ℃過夜后，經3000 r/min離心5 min，分離血清，取上清液，置-20 ℃保存。

1.8.2血清抗體的檢測利用本研究室制備的ELISA試劑盒進行檢測。

1.8.3判定方法如果 P/N [(樣品孔OD450nm-空白孔OD450nm)/(陰性孔OD450nm-空白孔OD450nm)]≥2.1 ，則判為陽性，否則判定為陰性。

2　結果與分析

2.1免疫前抗體測定

抗體檢測結果均為陰性。

2.2白油及白油+IL-2佐劑組免疫后不同時間的抗體

接種白油佐劑滅活疫苗，結果見表2。免疫后第1周只有20%(1/5)檢測到抗體，第2周100%抗體效價可達1∶100以上，到第4周，抗體效價在1∶400以上，且最高抗體效價為1∶800。

表2　白油佐劑組各雞的抗體效價

同時免疫了白油+IL-2佐劑組滅活疫苗的抗體結果見表3。相對于單獨免疫白油佐劑組疫苗的抗體，總體水平抗體產生早，且抗體水平均較高，當免疫至第4周時，平均抗體達到720。

表3　白油+IL-2佐劑組各雞的抗體效價

2.3鋁膠及鋁膠+IL-2佐劑組免疫后不同時間的抗體

由測得抗體可知，兩組免疫效果均不佳，免疫后第3周抗體均值達到1∶120，且個別個體檢測不到抗體，至第4周平均抗體才達到250，說明抗體上升緩慢。而同時接種了鋁膠+IL-2的佐劑組，抗體水平明顯高于單獨接種鋁膠組，至免疫后第4周，平均抗體達到320。詳細結果見表4、表5。

表4　鋁膠佐劑組各雞的抗體效價

表5　鋁膠+IL-2佐劑組各雞的抗體效價

2.4蜂膠及蜂膠+IL-2佐劑組免疫后不同時間的抗體

接種蜂膠滅活疫苗組，免疫后第1周，即有40%的抗體效價達到1:100，第2周和第3周抗體水平略有上升，至第4周時，抗體有升有降，平均抗體與第3周相同。接種蜂膠+IL-2滅活疫苗組，相應的抗體水平也均較單獨免疫蜂膠佐劑的高，結果見表6、表7。

2.5IL-2佐劑免疫組免疫后不同時間的抗體

接種IL-2滅活疫苗組，免疫后第1周抗體水平就有明顯升高，第2、第3周，抗體水平持續升高，第4周時，抗體水平呈現下降趨勢。結果見表8。

表6　蜂膠佐劑組各雞的抗體效價

表7　蜂膠+IL-2佐劑組各雞的抗體效價

表8　IL-2佐劑組各雞的抗體效價

2.6免疫后不同佐劑組抗體平均水平比較

不同組別免疫后抗體平均水平見圖1。從圖1中可以看出，白油佐劑組抗體明顯高于鋁膠組及蜂膠組。在每個小組里，加入IL-2的比同期未加組抗體滴度高。

圖1　不同組別的抗體效價

3　討論

佐劑是動物疫苗中的重要組成部分，是一種非特異性免疫增強劑，能夠提高抗原對機體的免疫原性，增強疫苗免疫效果，被廣泛應用于疫苗研究與生產。選擇合適的佐劑，對于提高疫苗免疫效果和減少不良反應有著重要的意義。而細胞因子調節固有免疫和適應性免疫應答，可作為佐劑增強疫苗免疫的效應[13-17]。

白細胞介素是一種糖蛋白，在機體的免疫應答及免疫調節過程中有著重要作用。研究證明：雞IL-2能顯著提高疫苗的免疫應答，IL-2作滅活疫苗的免疫增強劑，能使滅活苗的高水平抗體效價維持時間較長，且0.06～0.10 mg的雞IL-2蛋白作為佐劑較合適[16]。本實驗結果顯示滅活疫苗中具有IL-2佐劑成分的實驗組抗體水平均高于相同條件實驗組。

白油佐劑乳化后在注射部位的貯庫效應能延長抗原在體內的存留時間，緩慢釋放抗原，不斷刺激機體，提高抗原的免疫原性刺激，且在注射部位引起細胞浸潤，促使抗原呈遞細胞、巨噬細胞、淋巴細胞增殖從而提高免疫應答水平。其次乳劑能夠包裹抗原，保護其不被體液中的酶迅速分解，延長抗原刺激機體的時間；此外油乳佐劑還能刺激各種細胞因子的分泌，促進抗體產生。從本實驗結果來看，白油佐劑效果最好，配合IL-2使用，免疫效果更佳。

鋁膠佐劑使抗原滯留，緩慢釋放，并可引起局部炎癥反應，從而吸引活性淋巴細胞，增強免疫應答，還可激活補體系統，起抗原儲存庫和傳遞作用。鋁膠佐劑滅活苗以凝膠狀態注入動物體內后，不溶性顆粒能吸附、分散抗原物質，增加抗原表面積，在組織中形成一個富含巨噬細胞的肉芽腫，延緩吸收。鋁膠佐劑存在的主要問題是激活Th2型免疫細胞，只誘導體液免疫應答，且在注射部位緩慢釋放抗原的效應較低，但應激較小。本實驗結果表明，作為坦布蘇病毒滅活疫苗佐劑免疫雞，鋁膠佐劑的免疫效果并不理想，配合IL-2使用雖然能提高免疫后抗體的滴度，但效果也不佳。

蜂膠是工蜂從樹芽、樹皮或其他植物幼芽上采集來樹脂，并混入它的上顎腺分泌物和蜂蠟等加工而成，是一種粘性、膠狀、含有樹脂的物質。其中含樹脂類化合物、多酚類化合物、多糖類化合物，細菌脂多糖對體液免疫和細胞免疫都有輔助作用，可引起動物特異性應答，還可調節巨噬細胞表面Ia分子的表達，從而改變抗原的遞呈。用蜂膠佐劑疫苗免疫動物，機體能更快速、更高效、更持久產生抗體，能全面啟動機體的免疫防衛系統，刺激機體細胞免疫、體液免疫、紅細胞免疫系統和巨噬細胞補體系統產生免疫應答。本實驗中蜂膠佐劑疫苗的免疫效果未見特別突出，可能由于蜂膠較難溶解，導致滅活疫苗中蜂膠的含量不夠，影響了免疫效果。

從實驗結果可知，白油+IL-2作為佐劑制成TMUV滅活疫苗免疫SPF雞效果最好，不但抗體產生快、抗體滴度高，且高滴度抗體持續時間也長，明顯優于其他各組，為制備本疫苗的首選佐劑。

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(責任編輯：許晶晶)

Comparison of Immune Effect of Chicken Tembusu Virus Inactivated Vaccine with Different Adjuvants

LIU Yu-zhuo, LI Jia-ping, LI Yin, HUANG Xin-mei, ZHAO Dong-min,HAN Kai-kai, YANG Jing, LIU Qing-tao, BI Ke-ran

(Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology, Ministry of Agriculture / National Research Center for Engineering and Technology of Veterinary Bio-products, Nanjing 210014, China)

Tembusu virus inactivated vaccines were mixed with different adjuvants (oil, oil+IL-2, alumina gel, alumina gel+IL-2, propolis, propolis+IL-2, and IL-2). Forty 1-month-old SPF chickens were randomly divided into 8 groups, seven groups were immunized with different Tembusu virus inactivated vaccines respectively, and one group was not immunized for blank control. The serum samples of immunized chickens were collected before immunization, as well as 1 week, 2 weeks, 3 weeks and 4 weeks after immunization respectively. The antibody levels of various serum samples were detected by using ELISA method, in order to compare the immune effects of Tembusu virus inactivated vaccine with different adjuvants. The results showed that the Tembusu virus inactivated vaccine mixed with oil+IL-2 had the best immune effect, and the ELISA antibody titer could reach 1∶800 3 weeks after immunization. Therefore, oil and IL-2 were the ideal adjuvants for the preparation of Tembusu virus inactivated vaccine.

Adjuvant; Tembusu virus; Inactivated vaccine; Immune effect

2016-05-24

劉宇卓(1967─)，女，黑龍江泰康人，研究員，碩士，主要從事家禽疫病診斷、禽用生物制品研發。

S852

A

1001-8581(2016)10-0060-04