鑒別診斷臨床急性肺炎病原體感染的血清標志物研究

劉　萌　竇云鵬　谷　麗　呂　喆　王一民　劉穎梅　安云慶* 　曹　彬2,*

(1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院感染與臨床微生物科　北京呼吸疾病研究所，北京 100020；2. 首都醫科大學呼吸病學系，北京 100069；3. 首都醫科大學免疫學系　首都醫科大學微生態研究中心，北京 100069； 4. 中日友好醫院呼吸與危重癥醫學科二部，北京 100029)

?

· 基礎研究 ·

鑒別診斷臨床急性肺炎病原體感染的血清標志物研究

劉萌1,2竇云鵬3谷麗1呂喆3王一民4劉穎梅4安云慶3*曹彬2,4*

(1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院感染與臨床微生物科北京呼吸疾病研究所，北京 100020；2. 首都醫科大學呼吸病學系，北京 100069；3. 首都醫科大學免疫學系首都醫科大學微生態研究中心，北京 100069； 4. 中日友好醫院呼吸與危重癥醫學科二部，北京 100029)

目的 檢測急性肺炎患者血清相關生物標志物含量，為建立一種快速鑒別診斷臨床急性支原體肺炎、病毒性肺炎、細菌性肺炎的免疫膠體金檢測法提供實驗依據。 方法以臨床病原學診斷明確的急性支原體肺炎，病毒性肺炎，細菌性肺炎患者和正常人血清為檢測樣品，采用血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)/殺菌滲透增強蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)酶聯免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測試劑盒檢測上述血清中相關生物標志物含量。 結果(1)正常人群血清78份，急性支原體肺炎患者血清46份，病毒性肺炎和細菌性肺炎患者血清42份，其中病毒感者患者血清35份，細菌感染患者血清7份；(2)正常人群血清PDGF最大值<6 000 pg/mL； 血清BPI最大值<80 ng/mL；(3)以血清PDGF值6 000 pg/mL作為鑒別診斷急性支原體感染的基線值，支原體感染患者陽性檢出率為93.47%(43/46)；病毒和細菌感染患者出現支原體感染的假陽性率為7.14%(3/42)；(4)以血清BPI值80 ng/mL作為鑒別診斷急性細菌感染的基線值，細菌感染患者陽性檢出率為85.71%(6/7)；病毒感染患者出現細菌感染的假陽性率為3.22% (1/31)。結論以血清PDGF 6 000 pg/mL和BPI 80 ng/mL作為鑒別診斷不同病原體感染的基線值，對臨床急性支原體肺炎、病毒性肺炎、細菌性肺炎鑒別診斷具有一定意義。

肺炎; 鑒別診斷; 血小板衍生生長因子; 殺菌滲透增強蛋白

在臨床急性呼吸道感染患者中，支原體感染所占比例最大，病毒次之，細菌最低[1]。在上述病原體中，細菌對青霉素和頭孢菌素類抗生素敏感；支原體對紅霉素和螺旋霉素類抗生素敏感；而病毒感染用上述抗生素治療無效。現有實驗室診斷技術存在不能及時準確鑒別診斷上述相關病原體的缺陷。 臨床醫生通常多采用經驗性抗生素治療，這不僅容易造成抗生素使用不當導致細菌耐藥，還可因未能及時合理使用抗生素而使某些患者，特別是嬰幼兒患者病情迅速惡化產生嚴重后果[2]。

目前臨床常用的血清炎性指標主要包括C-反應蛋白(C reactive protein，CRP)和降鈣素原(procalcitonin，PCT)。最初發現急性細菌感染患者血清CRP濃度顯著升高，后來發現在某些病毒感染患者血清中CRP濃度也顯著升高。故患者血清CRP濃度升高對急性細菌或病毒感染僅有一定的輔助診斷意義[3]。 PCT血清濃度升高對臨床重癥細菌感染的診斷和指導抗生素的合理使用具有重要意義[4-5]，而對臨床輕癥細菌感染與病毒或支原體感染沒有鑒別診斷價值。因此，在急性呼吸道感染患者血清中找到對不同病原體感染具有鑒別診斷意義的生物標志物，建立一種快速、簡便、準確有效的檢測方法，對指導及時合理使用抗生素有效控制患者病情和減少耐藥菌產生有重要意義。

為此，本課題組以臨床病原學診斷明確的急性支原體、病毒性肺炎、細菌性肺炎患者和正常健康人血清為檢測樣品，采用血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)/殺菌滲透增強蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)酶聯免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測試劑盒對上述血清樣品中相關生物標志物進行檢測。

1　材料與方法

1.1研究對象和檢測樣品

選擇2010年9月至2012年6月北京肺炎監測網病原學診斷明確的門診或住院成人急性肺炎患者88例；其中急性細菌性肺炎患者血清7份，急性病毒性肺炎患者血清35份，急性支原體肺炎患者血清46份作為檢測樣品。選擇首都醫科大學2015年入學新生(18～19歲)體檢剩余血清78份作為正常對照樣品。

1.2檢測方法

首先采用Bio-Plex懸液芯片技術對部分患者血清樣品進行檢測，尋找具有鑒別診斷意義的候選生物標志物，然后采用ELISA試劑盒對包括急性肺炎患者和正常對照組人群在內的所有血清樣品進行檢測。PDGF試劑盒(購自eBioscience公司)，參照操作說明對血清樣品中PDGF的濃度進行檢測；BPI試劑盒(購自Hycult Biotech 公司)參照操作說明對血清樣品中BPI含量進行檢測。

2　結果

2.1正常健康人群組

正常健康人群組血清樣品78份，檢測結果：(1)PDGF值：186～5 521 pg/mL，最大值<6 000 pg/mL；(2)BPI值：1～49 ng/mL，最大值<80 ng/mL。

2.2急性細菌性肺炎組

急性細菌性肺炎患者血清樣品7份，檢測結果：(1)PDGF值：489～7 930 pg/mL，其中6份血清樣品PDGF值<6 000 pg/mL，1份血清樣品PDGF值為7 930 pg/mL。(2)BPI值：40～349 ng/mL，其中6份血清樣品BPI值>80 ng/mL， 1份血清樣品BPI值為40 ng/mL，詳見表1。

表1　急性細菌性肺炎患者血清中PDGF和BPI檢測結果

PDGF：platelet-derived growth factor; BPI：bactericidal/permeability-increasing protein.

2.3急性病毒性肺炎組

急性病毒性肺炎組血清樣品35份，檢測結果：(1)PDGF值：530～11 865 pg/mL，其中33份血清樣品PDGF值<6 000 pg/mL，2份血清樣品PDGF值>6 000 pg/mL。(2) BPI值(31份)：12～88 ng/mL， 其中30份血清樣品BPI值<80 ng/mL，1份血清樣品BPI值>80 ng/mL，詳見表2。

2.4急性支原體肺炎組

急性支原體肺炎組血清樣品46份，檢測結果：(1)PDGF值：2 786～39 438 pg/mL，其中43份血清樣品PDGF值>6 000 pg/mL，3份血清樣品PDGF值<6 000 pg/mL。(2) BPI值(42份)：22～264 ng/mL，其中25份血清樣品BPI值>80 ng/mL，17份血清樣品BPI值<80 ng/mL，詳見表3。

表2　急性病毒性肺炎患者血清中PDGF和BPI檢測結果

PDGF：platelet-derived growth factor; BPI：bactericidal/permeability-increasing protein.

表3　急性支原體肺炎患者血清中PDGF和BPI檢測結果

PDGF：platelet-derived growth factor; BPI：bactericidal/permeability-increasing protein.

3　討論

血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是參與機體組織損傷修復的重要因子[6]。研究[7-8]發現，PDGF升高與肺、肝、骨髓纖維化和動脈粥樣硬化等疾病的發生密切相關。 肺炎支原體反復感染的大鼠肺組織中PDGF濃度顯著升高，并由此導致肺間質纖維化形成的研究[9-10]報道，提示支原體感染與體內PDGF水平升高存在一定的相關性。殺菌滲透增強蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)是一種具有中和內毒素和廣譜殺菌作用的陽離子蛋白[11-12]，主要存在于中性粒細胞和黏膜上皮細胞中；細菌感染后患者血清BPI濃度顯著升高[13]。

PDGF和BPI作為一種參與機體組織損傷修復、誘導促進組織纖維化形成的細胞因子和一種抗菌蛋白或抗感染生物制劑受到醫學界的重視。但迄今尚未發現將PDGF和BPI作為一種急性感染生物志志物，用以鑒別診斷不同病原微生物感染的研究。

免疫膠體金檢測法是一種快速定性診斷的技術。在此基礎上制備的免疫膠體金試紙卡檢測試劑盒不僅具有快速(1 h內)診斷的特點，還具有測試準確性高，操作簡便，結果容易判讀，適合在城鄉基層醫療單位推廣使用的優點[14-15]。建立免疫膠體金檢測方法的核心問題是能夠找到相關生物標志物，并準確獲得該生物標記物對相關疾病具有鑒別診斷意義的基線值。

根據本實驗研究結果，若以血清PDGF值6 000 pg/mL作為鑒別診斷急性支原體肺炎、細菌性肺炎病毒性肺炎的基線值，則支原體感染患者陽性檢出率為93.47%(43/46)。鑒于在7份急性細菌性肺炎和35份急性病毒性肺炎患者血清樣品中分別有1份和2份樣品PDGF值>6 000 pg/mL，故上述患者出現支原體感染的假陽性率為7.14% (3/42)。該項研究結果表明，血清PDGF值6 000 pg/mL對急性支原體與細菌/病毒感染具有很好的區分度。

若以血清BPI值80 ng/mL作為鑒別診斷急性細菌性肺炎與急性病毒性肺炎的基線值，則細菌感染患者陽性檢出率為85.71%(6/7)。鑒于在31份急性病毒性肺炎血清樣品中有1份血清樣品BPI值>80 ng/mL，故上述患者出現細菌感染的假陽性率為3.22%(1/31)。該項研究結果表明，血清BPI值80 ng/mL對急性細菌和病毒感染具有很好的區分度。

在本實驗中，急性支原體肺炎血清樣品中有25份樣品BPI值>80 ng/mL，17份樣品BPI值<80 ng/mL；故血清BPI值80 ng/mL不能作為鑒別診斷急性細菌性肺炎與急性支原體肺炎的基線值。鑒于在本實驗結果中，血清PDGF值檢測結果，即支原體感染患者陽性檢出率為93.47%，已將急性支原體肺炎與急性細菌性肺炎病毒性肺炎有效鑒別區分。因此，部分急性支原體肺炎患者血清BPI>80 ng/mL并不影響急性細菌性肺炎與急性支原體肺炎的鑒別診斷。

根據以上研究結果，擬制備的免疫膠體金檢測試劑盒包括檢測血清PDGF含量的測試紙卡I和檢測血清BPI含量的測試紙卡II。結果判讀標準：(1)測試紙卡I檢測線處出現一條紫紅色條帶或測試紙卡I和II檢測線處各出現一條紫紅色條帶，鑒定為急性支原體肺炎；(2)測試紙卡I檢測線處無紫紅色條帶出現，測試紙卡II檢測線處出現一條紫紅色條帶，鑒定為急性細菌性肺炎；(3)測試紙卡I和II檢測線處均無紫紅色條帶出現，鑒定為急性病毒性肺炎。用測試紙卡I和II檢測正常人血清也會出現上述結果，但正常健康人群無肺炎相關臨床癥狀，也不會來醫院就診，因此不影響本試劑盒在臨床上的使用。

本項研究獲得的實驗數據為免疫膠體金快速定性檢測試劑盒的制備奠定了堅實的基礎。鑒于研究對象，即急性肺炎患者病例數(88例)和不同病原體感染，特別是細菌性肺炎患者病例數(7例)較少，有可能影響PDGF/BPI鑒別診斷基線值的確定及相關病原體的陽性檢出率和誤診率，因此需要進一步擴大病例數，以獲得更為準確的PDGF/BPI鑒別診斷基線值及相關病原體的陽性檢出率和誤診率。

[1] Qu J X, Gu L, Pu ZH, et al. Viral etiology of community-acquired pneumonia among adolescents and adults with mild or moderate severity and its relation to age and severity[J]. BMC Infect Dis, 2015,15:89.

[2]李福長, 劉梨平. 我國抗生素濫用現狀及其對策[J]. 臨床合理用藥雜志, 2014, 7(9) : 175-177.

[3]Heiskanen-Kosma T, Korppi M. Serum C-reactive protein cannot differentiate bacterial and viral aetiology of community acquired pneumonia in children in primary healthcare settings[J]. Scand J Infect Dis, 2000,32 (4) :399-402.

[4]Horie M, Ugajin M, Suzuki M, et al. Diagnostic and prognostic value of procalcitonin in community-acquired pneumonia[J]. Am J Med Sci, 2012,343 (1) :30-35.

[5]曾德穎, 陳燕情, 湯利芹, 等. 降鈣素原在兒童下呼吸道感染的應用研究[J]. 中國醫藥科學, 2016, 6(12) :43-45.

[6]Heldin C H, Westermark B. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor[J]. Physiol Rev, 1999,79 (4) :1283-1216.

[7]Andrae J, Gallini R, Betsholtz C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine[J]. Genes Dev, 2008,22 (10) :1276-1312.

[8]Heldin C H, Westermark B. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor[J]. Physiol Rev, 1999,79 (4) :1283-1316.

[9]劉健, 彭東信, 劉曉晴, 等. 肺炎支原體反復感染大鼠肺組織中PDGF-BB變化的免疫組織化學研究[J]. 中國組織化學與細胞化學雜, 2001,10 (1) :76-79.

[10]Liu J, Peng D, Zhu Z, et al. The expression of PDGF-BB chain mRNA in lung tissue from rats repeatedly infected with mycoplasma pneumonia[J]. J Tongji Med Univ, 1998,18 (4) :216-220.

[11]Balakrishnan A, Marathe S A, Joglekar M, et al. Bactericidal/permeability increasing protein: A multifaceted protein with functions beyond LPS neutralization[J]. Innate Immun, 2012,19 (4) :339-347.

[12]Domingues M M, Silva P M, Franquelim H G, et al. Antimicrobial protein rBPI21-induced surface changes on Gram-negative and Gram-positive bacteria[J]. Nanomedicine, 2014,10 (3) :543-551.

[13]Aichele D, Schnare M, Saake M, et al. Expression and antimicrobial function of bactericidal permeability-increasing protein in cystic fibrosis patients[J]. Infect Immun, 2006,74 (8) :4708-4714.

[14]蔣旭, 李青竹, 邱月紅, 等. 膠體金免疫層析技術研究進展[J]. 獸醫研究, 2015,5 : 28-29.

[15]薛天羽, 趙楊,林錦鋒,等. 免疫學方法確證人血痕的研究及應用現狀[J]. 中國煤炭工業醫學雜志，2014，17(12):2101-2105.

編輯慕萌

s， E-mail：anyunq@ccmu.edu.cn, caokin_ben@163.com

Studies of serum biomarkers to differentiate and diagnose acute pneumonia pathogens infection

Liu Meng1,2, Dou Yunpeng3, Gu Li1, Lyu Zhe3, Wang Yimin4, Liu Yingmei4, An Yunqing3*, Cao Bin2,4*

(1.DepartmentofInfectiousDiseasesandClinicalMicrobiology,BeijingChaoyangHospital,BeijingInstituteofRespiratoryMedicine,Beijing100020，China; 2.DepartmentofImmunology,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 3.DepartmentofImmunology,MicroecologyResearchCenter，CapitalMedicalUniversity,Beijing100069，China; 4.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,China-JapanFriendshipHospital,Beijing100029，China)

ObjectiveTo provide the experimental basis of a rapid immune colloidal gold test which used to differentiate and diagnose acute pneumonia patients infected with mycoplasma pneumoniae(MP)/virus/bacteria. MethodsThe level of platelet-derived growth factor (PDGF) and bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) in the serum of acute pneumonia patients with definite infection of mycoplasma pneumoniae /virus/bacteria and healthy controls were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. ResultsThere were 78 serum samples from healthy controls, 46 from acute MP patients, 42 from acute bacterial and viral pneumonia patients (7 from bacterial pneumonia and 35 from viral pneumonia patients). (2) PDGF values of healthy controls were all less than 6 000 pg/mL; BPI values were all less than 80 ng/mL. (3) If definition of the baseline value of PDGF which could diagnose acute MP infection is as 6 000 pg/mL, the positive detection rate of MP pneumonia patients was 93.47% (43/46), and the MP false positive rate of patients with viral or bacterial pneumonia was 7.14% (3/42). (4) If definition of the baseline value of BPI which could diagnose acute bacterial infection is 80ng/mL, the positive detection rate of patients with bacterial pneumonia was 85.71% (6/7), and the bacteria false positive rate of viral pneumonia patients was 3.22% (1/31). ConclusionUsing PDGF’s baseline value as 6 000 pg/mL and BPI’s 80 ng/mL to differential diagnosis has some clinical significance to differentiate acute MP/virus/bacterium infection.

pneumonia; differentiation diagnosis; platelet-derived growth factor; bactericidal/permeability-increasing protein

國家自然科學基金項目(81271840)，國家青年杰出基金項目(81425001)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81271840)， National Science for Distinguished Young Scholars(81425001).

時間：2016-10-1610∶55

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1055.004.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.016]

R 563.1

2016-09-05)