牽牛子不同提取物對小鼠急性毒性的比較研究

劉翠華　何金洋

（廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東 廣州 510405）

牽牛子不同提取物對小鼠急性毒性的比較研究

劉翠華何金洋

（廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所，廣東 廣州 510405）

目的：探討中藥牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物對小鼠急性毒性。方法：制備牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物，采用急性毒性替代法-上下法進行毒性比較。結果：牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物均不同程度表現出了急性毒性癥狀，按生藥量計算的半數致死量（LD50）分別是455g/kg，32g/kg，9g/kg。結論：牽牛子不同提取物對小鼠的急性毒性強度為正丁醇部位＞牽牛子氯仿部位＞石油醚部位。

牽牛子；不同提取物；小鼠；急性毒性

牽牛子（學名：Pharbitisnil （Linn.） Choisy）為旋花科植物裂葉牽牛（Pharbitisnil L. Choisy） 或圓葉牽牛的干燥成熟種子，又名黑丑、白丑、二丑等。性寒，味苦；有毒，具有瀉水、消痰滌飲、殺蟲攻積等功效［1］。迄今為止，有關學者對牽牛的化學成分和藥理作用等方面進行深入研究，發現牽牛子主要含有牽牛苷、生物堿類、糖類及蛋白質、甾醇類化合物、色素及脂肪油等［2-4］；陳麗娜等［5］還發現了蒽醌、酚酸和二萜類有效成分。

牽牛子具有瀉下及利尿，抑菌、興奮子宮、抗腫瘤、抗高血脂等藥理作用［6-11］。王燕等［12］報道牽牛子提取物對朱砂葉螨具有生物活性。李佳桓等［13］發現牽牛子酒提取物有對抗腫瘤抗轉移作用。

現代對中藥的毒性分級主要以半數致死量（LD50）為依據，分為大毒、有毒、小毒和無毒［14］。WHO頒布的化學物質的急性毒性分級標準為劇毒、高度、中毒、低毒和微毒［15］。牽牛子生用偏用于逐水消腫、殺蟲。炮制后可降低毒性、緩和藥性、免傷正氣。

然而有關牽牛子提取物急性毒性和毒性癥狀研究報道卻很少。前期筆者已篩選出牽牛子抗病毒中藥提取物有效部位，本研究以昆明小鼠為實驗對象，采用急性毒性替代法-上下法，測得牽牛子提取物的LD50值及95%可信區間，同時觀察牽牛子不同提取物灌胃后的急性毒性反應，對牽牛子不同提取物進行毒性強度比較，進而為開展牽牛子亞急性、慢性毒性研究奠定基礎，這是后期抗病毒中藥復方研究必由之路。

1　實驗材料

1.1實驗藥材

中藥材牽牛子購自廣州杏林春藥房（20140625）。

1.2實驗試劑

乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均（廣州化學試劑廠）；3%苦味酸溶液（臺山市眾城化工有限公司）；羧甲基纖維素鈉溶液（天津市大茂化學試劑廠）；0.9%生理鹽水（天津市大茂化學試劑廠）。

1.3實驗儀器

KQ-501E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH6-型恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠）；R206旋轉蒸發儀、R100旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）；DLSB-30低溫冷卻液循環泵（鄭州長盛儀器有限公司）；TC-15套式恒溫器（海寧市新華醫療器械廠）。

2　實驗動物

SPF級昆明小白鼠，雌性30只，雄性15只，體重18～22g，共35只，全部購于廣東省廣州中醫藥大學實驗動物中心，于廣州中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室飼養。實驗動物采用標準化籠子喂養，隨機分組，每籠根據實驗需求飼養3～5只以適應環境。本實驗通過廣州中醫大學動物實驗倫理委員會的審核［實驗許可證號：SYXK（粵）2013-0001粵監證字00116824，嚴格按照動物實驗有關規定進行。

3　實驗方法

3.1供試樣品的制備

中藥材粉碎，以75%乙醇回流提取3次，每次2小時，合并乙醇提取液，真空抽濾，減壓回收乙醇提取物，并揮發盡殘余乙醇，得乙醇提取物浸膏。乙醇提取物用適當比例按有機溶劑極性大小：石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，先后依次進行萃取，萃取至無色，分別減壓回收萃取溶液，得所需中藥材有效部位浸膏：石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位。

最終有效部位的萃取率分別是：牽牛子的石油醚部位0.83%，牽牛子氯仿部位0.99%，牽牛子正丁醇部位12%。

取適量牽牛子不同提取物用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液作為溶劑超聲30min，配制成實驗所需濃度。

3.2預實驗

牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的小鼠急性毒性參照OECD TG25 UDP限度試驗［16］進行預實驗。

取雌性昆明小鼠3只，分別給與2000mg/kg劑量的牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物。給與牽牛子氯仿、正丁醇提取物小鼠死亡，可開始主試驗，給與牽牛子石油醚提取物的昆明小鼠48h內未見死亡，順序將2000mg/kg劑量牽牛子石油醚提取物給與2只小鼠，觀察48h后3只均存活，可預測牽牛子石油醚提取物LD50≥2000mg/kg。再次取雌性昆明小鼠1只，分別給與5000mg/kg劑量的牽牛子石油醚提取物，小鼠12h內死亡，解剖可見臟器有顏色改變，失禁，大便稀軟，可預測牽牛子石油醚提取物的LD50≤5000mg/kg，即牽牛子石油醚提取物的LD50在2000mg/kg到5000mg/kg之間。

3.3主試驗（正式試驗）

牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的急性毒性參照OECD TG25 UDP［16］進行。

全部使用雌性昆明小鼠，默認劑量級數因子3.2（斜率為2.0）。牽牛子氯仿、正丁醇提取物按劑量1.75、5.5、17.5、55、 175、550、2000mg/kg貫序進行，牽牛子石油醚提取物按劑量1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000mg/kg）貫序進行，三種提取物起始劑量均從175 mg/kg開始。每次按順序給藥1只老鼠，觀察48h，若存活，則提高一級劑量，再次觀察48h；若死亡，則降低一級劑量，每次給與劑量后可將動物結局輸入AOT425StatPgm程序［16］中，軟件自動給出下次給與劑量大小，直到出現終止試驗的劑量，軟件將估算出LD50值和其95%的可信區間。試驗期間，每次給藥后，及時觀察記錄小鼠的毒性表現，包括呼吸、運動功能、毛發、對外反應，瞳孔大小，分泌物和排泄物以及小鼠的死亡等情況。

4　結果

牽牛子石油醚提取物給藥劑量5000mg/kg后觀察，反應遲鈍，毛發雜亂，嗜睡，瞇眼，唾液分泌較多，眼內濕潤，有清稀分泌物，口周毛潮濕，籠內有嘔吐物，肛門周圍毛潮濕，糞便稀且呈褐綠色，12h內死亡。該毒性表現可能提示牽牛子石油醚提取物在此劑量時對睡眠中樞，中樞神經系統、感官、神經肌肉，自主神經系統，胃腸動力、腎臟均有毒性作用。解剖未見內臟顏色，大小變化，胃內容物為油黃色，是溶劑玉米油顏色。給藥劑量1750mg/kg，給藥后2h內，毛發稍顯毛糙，瞇眼，稍困倦，肛門周圍潮濕，觸摸有反應，有驚跳反射，在存活/死亡之間轉換。175 mg/kg 、550 mg/kg劑量，除給藥第一天進食稍微減少，存活14天以上，肉眼未見明顯毒性表現。該提取物動物結局和LD50值，如表1所示。

牽牛子氯仿提取物給藥劑量2000mg/kg，給藥后，喘息，困倦，俯臥，嘔吐，后出現躁動，行動時顫抖，水樣便，1h內死亡。該毒性表現可能提示牽牛子氯仿提取物在此劑量時對呼吸中樞，睡眠中樞，自主神經系統，中樞神經系統、神經肌肉有毒性作用。550 mg/kg劑量，給藥后，反應慢。俯臥，困倦，籠內大便濕潤，前肢抽搐死亡，在12h內死亡，該毒性表現可能提示牽牛子氯仿提取物仍對睡眠中樞，自主神經系統，中樞神經系統、神經肌肉有毒性作用。解剖未見內臟顏色，大小變化，內臟較濕潤，胃內容物為油黃色，是溶劑玉米油顏色。175 mg/kg劑量，糞便稍濕潤，反應靈敏，進食進水正常，未見明顯毒性癥狀。該提取物動物結局和LD50值，如表1所示。

牽牛子正丁醇提取物給藥劑量2000mg/kg，給藥后，反應遲鈍，瞇眼困倦，腹式呼吸明顯，大便較濕潤，漸漸無力，動作不協調，失禁，12h內死亡。該毒性表現牽牛子正丁醇提取物在此劑量可能對睡眠中樞，呼吸中樞，感官系統、神經肌肉系統乃至胃腸道系統有毒性作用。解剖可見胃部飽脹，內臟稍濕潤偏紅，肝臟、胃底部，小腸顏色偏深紅，提示牽牛子正丁醇提取物對整個內臟系統均有毒性。550 mg/kg和175 mg/kg，給藥后幾天內，飲食量相對減少，困倦，反應稍慢，毛發稍無光澤，經過14天觀察后，反應靈敏，肉眼未見明顯的包括呼吸、運動功能、毛發、對外反應，瞳孔大小，分泌物和排泄物等表現異常。該提取物動物結局和LD50值，如表1所示。

表1　牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的急性毒性上下法（UDP）試驗結果

5　討論

現代藥理實驗證明牽牛子對人體有毒，牽牛子服用不當，出現嘔吐、腹痛、腹瀉、大便有粘液和血、甚至昏迷等。急性毒性試驗是評價藥物安全的第一環節，獲取藥物毒性資料能更好指導下一步的實驗。

本文對牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物進行急性毒性比較研究，發現灌胃牽牛子不同提取物后均有一定急性毒性癥狀，以生藥計，牽牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的按生藥量計算的半數致死量分別是455g/kg，32g/kg，9g/kg，表明3種提取物對小鼠的急性毒性強度：牽牛子氯仿部位＞牽牛子正丁醇部位＞牽牛子石油醚部位。對牽牛子不同提取物進行急性毒性強度比較，進而為開展牽牛子提取物的亞急性、慢性毒性研究奠定基礎，為藥用提取物的的開發提供安全性評價基礎，這是后期抗病毒中藥復方研究必由之路。

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Comparative study on mice's acute toxicity of different composition in Prepared Pharbitis nil

Objective： Objective to study of the acute toxicity of Petroleum etherextract， chloroform extract， N-butanol extracts of the traditional Chinese Pharbitis nil choisy. Methods： Prepared Pharbitis nil choisy Petroleum ether extract， chloroform extract， N-butanol extract. To compare the acute toxicity of different components in accordance with up and down procedure（UDP） of alternative methods for acute oral toxicity testing. Results： Petroleum ether extract， chloroform extract and N-butanol extract of Pharbitis nil choisy showed obvious symptoms of acute toxicity in different extent. According to calculation of crude drugs，median lethal dose （LD50）respectively of three kinds of extracts was 455 g/kg， 32 g/kg， 9 g/kg. Conclusion ：the acute toxicity of three kinds of extracts of Pharbitis nil choisy in mice was chloroform extract ＞N-butanol extract＞Petroleum ether extract.

Pharbitis nil choisy； different extracts； mice； acute toxicity

R282；R285.5

A

1008-1151（2016）03-0073-03

2016-02-10

國家自然科學基金面上項目（8117325，81573861）。

劉翠華（1988-），女，廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所碩士研究生，研究方向為中醫治療艾滋病。

何金洋（1975-），男，廣東廣州人，廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所研究員，研究方向為中醫治療艾滋病。