壯骨止痛方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠下丘腦瘦素及其受體的影響

易仲媛 甘國(guó)興△ 李勁平 郭小玲 饒劍花△

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壯骨止痛方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠下丘腦瘦素及其受體的影響

易仲媛1甘國(guó)興1△李勁平2郭小玲1饒劍花1△

目的 觀察壯骨止痛方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠下丘腦瘦素及其受體的影響，探討其抗骨質(zhì)疏松機(jī)制。方法 72只200 g左右的SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)抽出假手術(shù)組12只，造模組60只，造模組采用雙側(cè)去卵巢法造模，假手術(shù)組只切除卵巢周圍相應(yīng)質(zhì)量的脂肪。造模成功后，造模組大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、壯骨止痛方高劑量組(13.2 g/kg)、中劑量組(6.6 g/kg)、低劑量組(3.3 g/kg)和戊酸雌二醇組，每組12只。術(shù)后第5天開始藥物干預(yù)，模型組和假手術(shù)組給予相應(yīng)體積的純凈水，持續(xù)13周。給藥結(jié)束后，檢測(cè)大鼠骨密度和下丘腦Leptin含量及OB-Rb蛋白表達(dá)。結(jié)果 模型組大鼠下丘腦Leptin及OB-Rb含量顯著降低，骨密度顯著減少，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。壯骨止痛方各劑量組大鼠OB-Rb蛋白表達(dá)顯著增加，骨密度顯著增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 促進(jìn)OB-Rb蛋白表達(dá)，可能是壯骨止痛方抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制之一。

骨質(zhì)疏松；壯骨止痛方；瘦素；瘦素受體

壯骨止痛方由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、枸杞子、牛膝等7味藥物組成，還有補(bǔ)益肝腎、壯骨止痛功效[1，2]，還具有顯著的抗骨質(zhì)疏松作用。前期對(duì)壯骨止痛方抗骨質(zhì)疏松的藥效物質(zhì)和作用機(jī)制的研究取得了一定的進(jìn)展，明確了柚皮苷、補(bǔ)骨脂酚、齊墩果酸、淫羊藿苷等是其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其可以通過調(diào)節(jié)鈣磷等無(wú)機(jī)元素，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-靶腺軸發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，但是其具體的作用環(huán)節(jié)尚未完全闡明，今后應(yīng)進(jìn)一步深入研究其具體作用環(huán)節(jié)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)壯骨止痛方能夠降低去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清瘦素，但是其對(duì)模型大鼠下丘腦瘦素及其受體表達(dá)的影響尚未明確。本研究通過探討壯骨止痛方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠下丘腦Leptin及OB-Rb的影響，從下丘腦瘦素信號(hào)傳導(dǎo)通路探討其抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡SD雌性大鼠72只，體質(zhì)量(220±15)g，SPF級(jí)。購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)No.43004700005517，中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心許可證號(hào)：SYXK(湘)2013-0001。標(biāo)準(zhǔn)普通飼料。

1.1.2 儀器 雙能X線骨密度儀(Unigamma，意大利)、酶標(biāo)儀(BioTek， USA)、電子天平(奧豪斯儀器有限公司，CP214)、MIAS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，Motic B5顯微攝像系統(tǒng)等。

1.1.3 藥物與試劑 壯骨止痛方由中南大學(xué)藥學(xué)院李勁平教授制備；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，J20130009)；Leptin ELISA檢測(cè)試劑盒及OB-Rb 蛋白免疫組化檢測(cè)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模與給藥 采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的雌性大鼠去卵巢3 個(gè)月造成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型[2]。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組12只，造模組60只，用10%水合氯醛麻醉，在無(wú)菌條件下摘除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅在卵巢周圍切除相應(yīng)質(zhì)量的脂肪。造模成功后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、壯骨止痛方高劑量組、中劑量組、低劑量組、戊酸雌二醇組，加上假手術(shù)組共6組，每組12只。飼養(yǎng)于室溫23℃～25℃，相對(duì)濕度50%～70%的清潔環(huán)境中，自由攝食和攝水。從術(shù)后第5 d開始，各組開始灌胃給藥干預(yù)，持續(xù)13周。模型組和假手術(shù)組給予等體積的純凈水。

1.2.2 下丘腦瘦素檢測(cè) 灌胃給藥干預(yù)結(jié)束后，采用10%水合氯醛麻醉大鼠，在冰蝶中迅速取出下丘腦，摘取1.0 g勻漿，取上清液按試劑盒操作說明采用ELISA檢測(cè)大鼠下丘腦Leptin含量。

1.2.3 下丘腦OB-Rb蛋白檢測(cè) 大鼠處死后，將取出的下丘腦用4%的多聚甲醛固定48 h后石蠟包埋。標(biāo)本用Shandon切片機(jī)間斷連續(xù)切片，切片厚4μm，60℃恒溫培養(yǎng)箱中烘烤24 h，常規(guī)脫蠟去水，PBS洗后，用SABC法(按試劑盒使用說明書)行免疫組織化學(xué)染色。DAB顯色，蘇木素襯染，常規(guī)封片。以棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性，每張免疫組化的切片選5個(gè)視野，采用北航MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.4 骨組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取左側(cè)股骨，用4% 的多聚甲醛固定48 h，然后用5%的硝酸脫鈣1周，HE染色后顯微形態(tài)學(xué)計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)測(cè)量脛骨平均骨小梁密度。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織形態(tài)學(xué)的影響 大鼠骨組織HE染色后鏡下顯示，模型組大鼠骨小梁稀疏、破壞，骨髓腔擴(kuò)大，梁髓比明顯下降；戊酸雌二醇組和壯骨止痛方各劑量組大鼠骨小梁密度分布比較均勻，梁髓比基本恢復(fù)正常。見圖1。

2.2 對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠下丘腦Leptin及OB-Rb的影響 與假手術(shù)組比較，去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠下丘腦Leptin含量顯著下降，OB-Rb蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥干預(yù)后，壯骨止痛方高、中劑量組大鼠下丘腦OB-Rb蛋白表達(dá)顯著增加，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠下丘腦Leptin及OB-Rb的影響

組別劑量(g/kg)Leptin(ng/L)OB?Rb假手術(shù)組—15720±014971)069±0141)模型組—13482±01047046±013戊酸雌二醇組21×10-514901±034401)065±0171)高劑量組13212458±01361064±0141)中劑量組6613260±01710060±0111)低劑量組3313013±03940057±009

注：與模型組比較，1)P<0.05

圖1 各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)(10×40)

圖2 各組大鼠下丘腦OB-Rb蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果(SABC法)

3 討論

中藥抗骨質(zhì)疏松的作用已經(jīng)得到公認(rèn)，但是其抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制大多尚未明確，這嚴(yán)重阻礙了中藥的國(guó)際化和現(xiàn)代化。近年來，廣大中醫(yī)藥科技工作者對(duì)中藥及其復(fù)方制劑的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，取得了一定的成果。但是中藥及其復(fù)方制劑藥效成分多、作用靶點(diǎn)多，給研究帶來了困難。壯骨止痛方具有顯著的抗骨質(zhì)疏松作用，前期對(duì)壯骨止痛方抗骨質(zhì)疏松的藥效物質(zhì)和作用機(jī)制研究取得了一定的進(jìn)展[2，4～15]，明確了柚皮苷、補(bǔ)骨脂酚、齊墩果酸、淫羊藿苷等是其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其可以通過調(diào)節(jié)鈣磷等無(wú)機(jī)元素，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-靶腺軸發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，但是其具體的作用環(huán)節(jié)尚未完全闡明，今后應(yīng)進(jìn)一步深入研究其具體作用環(huán)節(jié)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)壯骨止痛方能夠降低去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清瘦素，但是其對(duì)模型大鼠下丘腦瘦素及其受體表達(dá)的影響尚未明確。

近年來研究發(fā)現(xiàn)瘦素中樞調(diào)控骨代謝主要通過瘦素下丘腦交感神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控，但是瘦素中樞調(diào)節(jié)骨代謝的機(jī)制十分復(fù)雜，研究結(jié)果也不盡相同。Fernández-Galaz等[16]研究證實(shí)瘦素可通過與表達(dá)于腦干5-羥色胺能神經(jīng)元上的Ob-Rb相結(jié)合，減少5-HT的合成并抑制5-HT與下丘腦腹內(nèi)側(cè)核上的5-HT受體Htr2c(5-hydroxytryptamine receptor 2c)之間的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控骨代謝。Sato等[17]研究發(fā)現(xiàn)NMU缺乏小鼠通過中樞下丘腦通路改變成骨細(xì)胞活性來調(diào)控骨代謝，并表現(xiàn)出骨生成及骨量的增加，由此提出了NMU調(diào)控骨代謝可能是通過瘦素下丘腦交感神經(jīng)通路發(fā)揮作用的[18]。本研究中，模型組大鼠下丘腦瘦素含量顯著下降，瘦素長(zhǎng)形受體(OB-Rb)蛋白表達(dá)顯著下降，骨密度顯著降低。給藥干預(yù)后，壯骨止痛方高、中劑量組大鼠瘦素長(zhǎng)形受體(OB-Rb)蛋白表達(dá)顯著增加，骨密度顯著增加。研究結(jié)果提示，壯骨止痛方可能是通過促進(jìn)下丘腦瘦素受體表達(dá)，增強(qiáng)瘦素中樞調(diào)節(jié)骨代謝作用，增加骨密度，這可能是其抗骨質(zhì)疏松的機(jī)制之一。

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中和醫(yī)派基本學(xué)術(shù)觀點(diǎn)

中醫(yī)定義：中醫(yī)，是以中醫(yī)基本理論為指導(dǎo)，以望聞問切“四診”為主要手段采集臨床信息，通過四診合參，運(yùn)用辨證論治診斷疾病及其證候，采用天然藥物組方或采用非藥物療法，實(shí)施預(yù)防、治療、保健的醫(yī)學(xué)行為主體。

中醫(yī)藥五大特色：個(gè)性化的辨證論治 求衡性的防治原則 人性化的治療方法 多樣化的給藥途徑 天然化的用藥取向

中醫(yī)藥六大優(yōu)勢(shì)：臨床療效確切，用藥相對(duì)安全，服務(wù)方式靈活，文化底蘊(yùn)深厚，創(chuàng)造潛力巨大，發(fā)展空間廣闊。

養(yǎng)生總則三個(gè)字： 和則安

養(yǎng)生要訣三個(gè)詞： 上善 中和 下暢

養(yǎng)心法則三句話：是非審之于己 毀譽(yù)聽之于人 得失安之于數(shù)

養(yǎng)生方法四點(diǎn)：童心 蟻食 猴行 龜欲

中醫(yī)藥文化核心理念：以人為本 效法自然 和諧平衡 濟(jì)世活人

中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)藥文化建設(shè)三點(diǎn):主題是突出中醫(yī)藥文化核心價(jià)值 關(guān)鍵是充實(shí)中醫(yī)藥文化內(nèi)涵 重點(diǎn)是彰顯中醫(yī)藥文化特征

臨床學(xué)術(shù)觀點(diǎn)：扶正祛邪益中和 存正抑邪助中和 護(hù)正防邪固中和

臨床基本原則：慈悲為本 仁愛為先 一視同仁 中和乃根

臨床思辨特點(diǎn)：調(diào)氣血 平升降 衡出入 達(dá)中和

臨床基本處方：調(diào)氣活血抑邪湯

中和醫(yī)派臨床三要：一要善于調(diào)氣血 二要善于平升降 三要善于衡出入

中醫(yī)“治未病”“三強(qiáng)調(diào)”特征：強(qiáng)調(diào)以人為本，防重于治，強(qiáng)調(diào)形與神俱，和諧平衡，強(qiáng)調(diào)天人合一，效法自然。

中醫(yī)藥文獻(xiàn)研究“四有”原則：有淵源 有依據(jù) 有類比 有歸納

中醫(yī)藥文獻(xiàn)研究要有“四強(qiáng)”：可信性強(qiáng) 導(dǎo)向性強(qiáng) 實(shí)用性強(qiáng) 拓展性強(qiáng)

——摘自《明醫(yī)薪傳——北京同仁堂中醫(yī)大師孫光榮教授學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)傳承》

Effect of Zhuanggu Zhitong Prescription on Leptin and OB-Rb in the Hypothalamus of Ovariectomized Rats with Osteoporosis

YI Zhongyuan1GAN Guoxing1△LI Jingping2GUO Xiaoling1LIU Yu1RAO Jianhua1

(1.Department of Pharmacy, Qingyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangdong, Qingyuan 511500, China；2.College of Pharmacy, Central South University, Hunan, Changsha 410013, China)

Objective To explore the effect of Zhuanggu Zhitong prescription on the Leptin and OB-Rb in the hypothalamus of ovariectomized rats with osteoporosis, and to investigate its mechanism in anti-osteoporosis. Method 72 rats were randomly divided into sham group (12) and model group (60). The model group rats were ovariectomized, and the sham group rats were excised equal weight fat. After the modeling, the rats were randomly divided into model group, Zhuanggu Zhitong prescription high-dose group, Zhuanggu Zhitong prescription middle-dose group, Zhuanggu Zhitong prescription low-dose group and estradiol valerate group, with 12 rats in every group. After 5 days of the operation, rats started to receive drug therapy for 13 weeks. The model group and the sham group rats were given equal volume water. After the test, the content of Leptin and OB-Rb in the hypothalamus was detected. Results The content of Leptin and OB-Rb in the hypothalamus of ovariectomized rats with osteoporosis was significantly declined (P<0.05). After drug therapy, the content of OB-Rb in the hypothalamus and BMD of ovariectomized rats with osteoporosis were significantly increased (P<0.05). Conclusion Promoting the expression of OB-Rb may be one mechanisms of Zhuanggu Zhitong prescription in anti-osteoporosis.

Osteoporosis; Zhuanggu Zhitong prescription; Leptin; OB-Rb

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30873291)；清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2015B055)

1.廣東省清遠(yuǎn)市中醫(yī)院藥學(xué)部(清遠(yuǎn) 511500)；2.湖南省中南大學(xué)藥學(xué)院(長(zhǎng)沙 410013)

△通訊作者

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.19.018

1003-8914(2016)-19-2803-04

?衛(wèi)星

2016-06-29)