產腈水解酶基因工程菌的產酶誘導條件及培養基優化

唐璐敏， 薛建萍

上海市農藥研究所生物工程中心， 上海 200032

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產腈水解酶基因工程菌的產酶誘導條件及培養基優化

唐璐敏， 薛建萍*

上海市農藥研究所生物工程中心， 上海 200032

本文通過對產酶誘導條件及發酵培養基進行優化，成功提高了產腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit的產酶水平。研究結果顯示，最佳發酵培養基為：葡萄糖0.2%、甘油0.7%(v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%，pH 7.2。最佳產酶誘導條件為：發酵4 h時加入0.5 mmol/L IPTG，然后在28℃、240 r/min下誘導腈水解酶基因表達14 h～16 h。采用優化方案，重組菌產酶水平可提升至0.9～1×105U，與野生菌株的產酶水平相比，提高幅度超過50%。同時重組菌培養僅需 24 h，培養周期縮短超過50 h。

腈水解酶； 重組菌； 誘導優化； 培養基優化

天然腈化物在自然界中廣泛存在，很多微生物具備轉化腈化物的能力。微生物所產腈水解酶能將多種有機腈催化生成相應的有機酸，這些有機酸在工業、醫藥等領域具有很高的應用價值，因此近年來關于腈水解酶的研究倍受關注[1-4]。作者單位保藏的一株產腈水解酶菌株Arthrobacternitroguajacolicus可以轉化羥基乙腈生產羥基乙酸，已在工業化羥基乙酸生產項目中應用，但與化學法生產羥基乙酸相比，產能優勢尚不明顯，因此希望通過提高菌株發酵產酶水平來進一步提升產能。研究發現，采用傳統誘變方法難以繼續提高該菌株的發酵產酶水平，因此開展A.nitroguajacolicus腈水解酶基因的克隆及表達研究，通過酶基因的克隆和異源超量表達來突破瓶頸，進一步提高產能。

作者已克隆到A.nitroguajacolicus的腈水解酶基因，構建了一株產腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit(以下簡稱為重組菌)[5,6]，但重組酶基因在宿主胞內的表達水平遠低于野生菌株的產酶水平，不能滿足工業化應用的需求。

通過對該重組菌的酶基因誘導表達條件及發酵培養基配方進行優化，顯著提高了重組菌的產酶水平，并縮短了培養周期，優化結果可應用于工業化生產。

在本文研究基礎上，另一株基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNitd[基于基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit改造并已申請專利(申請號201510995654.7)]的產酶水平有更大幅度的提高，用于轉化羥基乙腈生產乙醇酸具有顯著的競爭優勢[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

產腈水解酶野生菌株Arthrobacternitroguajacolicus由上海市農藥研究所保藏；基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit由上海市農藥研究所構建并保藏。

1.1.2 培養基

野生菌種子培養基(g/L)：葡萄糖7.5、蛋白胨5、K2HPO40.5、KH2PO40.5、MgSO40.5，pH 7.0；發酵培養基(g/L)：葡萄糖15、蛋白胨10、味精0.75、K2HPO40.5、KH2PO40.5、MgSO40.5、半胱氨酸鹽酸鹽0.15，pH 7.0。

重組菌種子培養基(g/L)：葡萄糖5、蛋白胨10、NaCl 10、酵母膏5，pH 7.2。

氨芐抗性(Ampr)培養基：培養基中加入終濃度100 μg/μl的氨芐青霉素(Amp)。

1.1.3 主要試劑和儀器

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(簡寫IPTG)和氨芐青霉素鈉(Amp)購自捷瑞生物工程(上海)有限公司；蛋白胨購自南通東海龍生生物制品有限公司，可用OXOID公司胰蛋白胨(tryptone)替代；酵母膏購自廣東江門生物技術開發中心有限公司，可用OXOID公司酵母浸粉(yeast extract)替代；其他化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。島津氣相色譜儀GC-2014購自上海納锘實業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶活測定

1 mL細胞液或發酵液加入0.05 mL丙烯腈，40℃下振蕩反應5 min后加入0.08 mL濃HCl終止反應(反應液pH 1～2)，然后在15 000 r/min下離心5 min，取上清液用氣相色譜法測定丙烯酸含量。

酶活計算公式：C樣品=C標樣×A樣品/A標樣×60/t，其中C：濃度(μg/mL)；A：峰面積；t：反應時間(min)。

酶活單位( U )定義：1 mL細胞液或發酵液反應1 h產生1 μg丙烯酸為1個酶活力單位。

1.2.2 菌濃測定

取0.2 mL適當稀釋的菌液，10 000 r/min下離心2 min，沉淀部分用去離子水等體積重懸，以去離子水為對照測OD600。

1.2.3 菌體培養

1.2.3.1 野生菌培養

種子培養：28 ℃、220 r/min、24 h～48 h，以10%接種量轉接入發酵培養基；發酵培養：28 ℃、220 r/min、48 h～72 h。

1.2.3.2 重組菌培養

斜面培養：37 ℃培養16 h～18 h；種子培養：37 ℃、240 r/min，培養4 h～6 h，至OD600為0.6～0.8，以3%接種量轉接入發酵培養基；發酵培養：37 ℃、240 r/min下培養一定時間后加誘導劑IPTG，然后在28 ℃、240 r/min下進行酶基因的誘導表達。

1.2.4 重組酶基因的誘導表達條件優化

1.2.4.1 重組菌發酵培養生長曲線

重組菌發酵培養階段每隔0.5 h～1 h取樣測定OD600，繪制生長曲線。根據生長曲線確定誘導劑IPTG的加入時間點。

1.2.4.2 誘導因素優化

分別對IPTG濃度、IPTG加入時的菌株培養時間(以下簡稱培養時間)，IPTG加入后誘導表達時間這三個因素進行全正交優化試驗。放瓶菌液在10 000 r/min下離心5 min收集細胞，去離子水重懸細胞，再次離心收集細胞，再用1mL去離子水懸浮細胞(此細胞液與放瓶菌液相比濃縮了15倍)，測定細胞液酶活。

各因素所取水平為IPTG終濃度 (mmol/L)：0.10、0.25、0.50、0.75和1.00；培養時間(h)：2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5(選取范圍根據菌體生長曲線測定結果確定)；誘導表達時間(h)：7、15和20。

1.2.5 發酵培養基優化

通過3輪正交試驗獲得最佳發酵培養基配方。具體內容見結果與討論部分。

2 結果和討論

2.1 酶基因誘導表達條件優化

2.1.1 重組菌的生長曲線

重組菌的生長曲線如圖1所示。從圖中可以看出，2.5 h～5.5 h為菌體生長對數期，此后進入穩定期。2.5 h～6.5 h涵蓋了菌體對數生長期和穩定期。

圖1 E. coli BL21(DE3)-pETNYNit的生長曲線

2.1.2 誘導表達條件優化

按1.2.4.2的方法試驗，酶活測定結果如表1所示。從表中可看出，在重組菌對數生長期的中后期至穩定期的初期加入0.5～1 mmol/L IPTG并誘導表達15 h的效果較好，其中培養5.5 h、加0.5 mmol/L IPTG誘導表達15 h，重組菌產酶水平最高，可達34 939 U，而野生菌株產酶水平在5～6×104U，相比仍有一定差距。

表1 重組腈水解酶的誘導表達條件優化

2.2 發酵培養基優化

2.2.1 正交試驗一

據文獻報道，以半復合培養基培養重組大腸桿菌可提高菌體細胞密度，培養基中所含無機鹽如(NH4)2SO4、NH4Cl等有利于可溶性蛋白的合成[8]。

以重組菌種子培養基為基礎培養基，對其中的碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨、酵母膏)及無機鹽(NaCl)配比進行優化，另外再加入組分(NH4)2SO4和10*M9 salt(10*M9 salt 為含NH4Cl 1%、Na2HPO4·12H2O 8%、KH2PO43%、MgSO4·7H2O 0.25%的鹽溶液)，進行3水平正交試驗，培養基pH 7.2。試驗設計見表2，采用L18(37)正交試驗表共18個實驗組。

表2 正交試驗一的因素和水平設計

注：10*M9 salt水平為v/v%，其他組分水平為w/v%。

先按1.2.3.2的方法培養種子液并轉發酵，做重組菌在18組發酵培養基中的生長曲線 ，綜合18組生長曲線走勢，發酵培養3.5 h的重組菌處于對數生長中前期，4 h則處于對數生長于中后期。根據生長曲線，選定在轉發酵培養3.5 h和4 h加IPTG(終濃度0.5 mmol/L)，28 ℃、240 r/min誘導培養過夜(14 h ～16 h)。放瓶方法同2.1.2所述方法，轉發酵培養3.5 h加IPTG的正交試驗1-1結果及分析見表3、表4；轉發酵培養4 h加IPTG的正交試驗1-2結果及分析見表5、表6。

表3 正交試驗1-1的結果

注：以上表格中的酶活數據未除以濃縮倍數，為濃縮15倍的酶活。

從正交試驗1-1的方差分析結果表4看，葡萄糖(因素A)F值最高，為9.490，其他因素的F值都較低，當F0.05(2,2) = 19.00時各因素都無顯著性影響，當F0.25(2,2) = 3.00時葡萄糖具有顯著性影響。根據表3中的極差分析得到最佳發酵培養基(命名為Ⅰ-1)為：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.5%、酵母膏1.0%、NaCl 0.5%、(NH4)2SO40.5%、10*M9salt 10% (v/v)，pH 7.2。

表4 正交試驗1-1的方差分析結果

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.01，F0.25(2,2)=3.00，表中顯著性以F0.05(2,2)為臨界值。

從正交試驗1-2的方差分析結果表5看，葡萄糖(因素A)F值最高，為44.343，而其他因素的F值都較低，當F0.05(2,2)=19.00時葡萄糖具有顯著性影響。根據表6極差分析得到最佳發酵培養基(命名為Ⅰ-2)為：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%、NaCl 0.5%、(NH4)2SO40.5%、10*M9salt 10% (v/v)，pH 7.2。

表5 正交試驗1-2的方差分析結果

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.01，F0.25(2,2)=3.00，表中顯著性以F0.05(2,2)為臨界值。

表6 正交試驗1-2的結果

注：以上表格中的酶活數據未除以濃縮倍數，為濃縮15倍的酶活。

Ⅰ-1、Ⅰ-2培養基在蛋白胨含量上有區別，前者為1.5%，后者為1.0%，再次以Ⅰ-1、Ⅰ-2培養基為發酵培養基進行一次實驗，每組培養基都分別于轉發酵培養3.5 h和4 h加IPTG(終濃度0.5 mmol/L)，進一步驗證正交試驗結果，同時做對照組(發酵培養基配方與種子培養基配方相同)，結果見表7。

表7 3種發酵培養基的比較

注：表格中的酶活數據未除以濃縮倍數，為濃縮15倍的酶活。

根據表7的結果，正交試驗一得到的發酵培養基Ⅰ-1為最優培養基，其組分為：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.5%、酵母膏1.0%、NaCl 0.5%、(NH4)2SO40.5%、10*M9 salt 10% (v/v)，pH 7.2。使用此培養基時，重組菌培養條件為：37 ℃、240 r/min種子培養至OD600為0.6～0.8，以3%接種量轉發酵；37 ℃、240 r/min發酵培養4 h加入IPTG，IPTG終濃度為0.5 mmol/L；28 ℃、240 r/min誘導培養14 h～16 h。

2.2.2 正交試驗二

以發酵培養基Ⅰ-1為基礎，進行第二輪發酵培養基優化。從正交試驗一的實驗結果看，葡萄糖濃度 >0.2%時重組菌的酶活明顯降低，原因可能是作為常用碳源的葡萄糖，其含量對大腸桿菌生長有顯著影響，存在明顯的葡萄糖效應。葡萄糖濃度過高會抑制大腸桿菌的生長。而碳源是菌體產酶必需的營養元素，0.2%的葡萄糖含量無法滿足此需求(一般產酶細菌的發酵培養基中葡萄糖含量為1%～2%)，在無法以葡萄糖為碳源的情況下，采用一些非快速利用的碳源來替代葡萄糖。

甘油是一種常見的非快速利用的碳源，在Ⅰ-1培養基中加入不同量的甘油，考察重組菌放瓶發酵液的酶活。培養方法同2.2.1所述最優方法，放瓶發酵液直接按酶活測定方法測酶活，結果見表8。

從表8結果可看出，發酵培養基中加入甘油有助于菌體量及酶活的提高，將甘油與正交試驗一中除葡萄糖外的其他組分一起進行正交試驗，進一步細化正交試驗一各組分的水平，縮小各因素水平范圍，培養基中0.2%葡萄糖為確定組分。正交試驗采用L18(37)，試驗設計和結果如表9、10、11所示。

表8 甘油對重組菌發酵的影響

表9 正交試驗二的因素和水平設計

注：10*M9 salt水平為v/v%；甘油配成10%(v/v)的溶液，按表中體積百分比加入培養基中；培養基中其他組分水平為w/v%。

表10 正交試驗二的方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.01，F0.25(2,2)=3.00，表中顯著性以F0.05(2,2)為臨界值。

從表10看，甘油為顯著影響因素，與試驗前所做碳源對產酶的重要性分析相符。

在表11的極差分析中，甘油的均值M1(對應水平0.5%)與均值M2(對應水平0.7%)相近且明顯高于均值M3(對應水平1.0%)，需做進一步試驗確定。其他各組分的M1、M2和M3值都很接近。蛋白胨各水平的均值很接近。考慮到氮源濃度不易過高，以保證培養基的碳氮比適中及控制培養基成本，選用蛋白胨1.2%。10*M9 salt各水平均值接近，呈現出谷形走勢而不是峰形走勢，選用兩端水平點7%和13%做進一步試驗確定。除了需進一步確定的因素水平(甘油0.5%或0.7%、10*M9 salt 7%或13%)外，根據極差分析結果確定其他培養基組分為：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%，pH 7.2。

將需要確定的兩個因素的兩個水平相互組合，加入已確定的培養基組分配制成以下4組培養基，試驗設計和結果見表12、13。

從表13結果看，Ⅱ-1為最佳培養基：葡萄糖0.2%、甘油0.7% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、10*M9 salt 13% (v/v)，pH 7.2。將10*M9 salt中各組分拆分換算得到各組分含量：NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%。

2.2.3 正交試驗三

將發酵培養基Ⅱ-1中10*M9 salt的各組分拆分，進行第三輪正交試驗優化。同時加入在第二輪優化結果中顯示具有顯著影響性的甘油，培養基中其他組分為葡萄糖0.2%、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%，pH 7.2。試驗設計見表14，采用正交試驗表L18(37)。培養方法同2.2.1所述最優方法，放瓶發酵液直接按酶活測定方法測酶活，試驗結果及分析見表15、16。

表11 正交試驗二的結果

表12 甘油及M9 salt組分含量的確定

表13 甘油及M9 salt組分含量確定的試驗結果

注：對照為不加甘油。

從表16可看出，各因素的F值都較低，當F0.25(2,2)=3.00和F0.05(2,2)=19.00時都不具有顯著性影響。根據表15的極差分析得到最佳發酵培養基(命名為Ⅲ-1)為葡萄糖0.2%、甘油0.5% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.15%、Na2HPO4·12H2O 1.5%、KH2PO40.8%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH 7.2。

將培養基Ⅱ-1和Ⅲ-1作為發酵培養基進行比較，試驗結果見表17。

表17結果顯示，Ⅱ-1和Ⅲ-1的發酵產酶效果相近，在無機鹽使用量上后者明顯高于前者，增加了原料成本，因此仍選Ⅱ-1為最佳培養基。

2.2.4 水質實驗

以上發酵培養基優化試驗中都是用去離子水配制培養基，為了適應工業化生產，改用自來水配制培養基。用去離子水和自來水分別配制以上優化試驗獲得的Ⅱ-1和Ⅲ-1培養基，既考察了水質對發酵的影響，又再次比較優化培養基Ⅱ-1和Ⅲ-1。結果見表18。

表14 正交試驗三的因素和水平設計

注：甘油配成10%(v/v)的溶液，按表中體積百分比加入培養基中；其他組分水平為w/v%。

表15 正交試驗三的結果

表16 正交試驗二的方差分析結果

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.01，F0.25(2,2)=3.00，表中顯著性以F0.05(2,2)為臨界值。

表17 發酵培養基Ⅱ-1和Ⅲ-1對產酶效果

表18 水質對發酵效果的影響

從表18的結果可知，可用自來水替代去離子水配制培養基，用發酵培養基Ⅱ-1和Ⅲ-1的發酵結果相近，結果能重現。確定最優培養基為Ⅱ-1：葡萄糖0.2%、甘油0.7% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%，自來水配制，pH 7.2。

經過3輪正交試驗，確定了最佳培養基配方及相應培養方法。在優化條件下，重組菌的產酶水平可達(0.9～1)×105U，比野生菌的產酶水平提高了50%以上。

3 結論

通過對產腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)-pETNYNit的酶基因誘導表達條件及發酵條件進行優化，成功提高了該重組菌的產酶水平。

通過研究獲得的最優培養方法為：斜面挑菌接入種子培養基，種子培養至OD600為0.6～0.8時，以3%接種量轉接發酵培養基，培養4 h加入0.5 mmol/L的誘導劑IPTG。種子及發酵培養條件均為37 ℃、240 r/min。加入IPTG后，在28 ℃、240 r/min下誘導酶基因表達14 h～16 h。經正交優化所得的最佳發酵培養基為：葡萄糖0.2%、甘油0.7% (v/v)、蛋白胨1.2%、酵母膏0.8%、NaCl 0.3%、(NH4)2SO40.3%、NH4Cl 0.13%、Na2HPO4·12H2O 1.04%、KH2PO40.39%、MgSO4·7H2O 0.03%，pH 7.2。試驗同時證明，培養基可使用自來水進行配制。培養基中均含100 μg/mL Amp。

采用最優培養方法，重組菌產酶水平可提升到(0.9～1)×105U，與野生菌株相比提高幅度超過50%。同時重組菌培養僅需 24 h，相比之下，野生菌株培養需72 h～120 h，培養周期大幅縮短。該優化方法在工業生產中能有效提高腈水解酶的產能，具有很高的工業應用價值。

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Optimization of culture conditions for production of nitrilase by using recombinantE.coli

TANG Lu-min, XUE Jian-ping

Biological Engineering Center，Shanghai Pesticide Research Institute，Shanghai 200032, China

In this study, the production of nitrilase by using recombinant strainE.coliBL21 (DE3) -pETNYNit was improved by optimization of induced conditions and fermentation medium. The results indicated that the optimal medium were as follows: glucose 0.2%, glycerol 0.7% (v/v), peptone 1.2%, yeast extract 0.8%, NaCl 0.3%, (NH4)2SO40.3%, NH4Cl and 0.13%, Na2HPO4·12H2O 1.04%, KH2PO40.39%, MgSO4·7H2O 0.03%, pH 7.2; the optimal induced conditions were the following: 0.5 mmol/L IPTG induced expression after fermented for 4 hours, and then cultured for 14 hours to 16 hours at 28 ℃ and 240 r/min. After optimization, the nitrilase activity of the recombinant strain increased to (1～0.9)×105U. Compared with that of the wild strain, the enzyme activity increased by more than 50%. At the same time, the culture time of the recombinant strain was about 24 hours, reduced more than 50 hours.

nitrilase; recombinant strain; induction condition optimization; culture medium optimization

國家高技術研究發展計劃(863計劃)，課題編號SS2014AA022106。

唐璐敏(1982～)，女，工程碩士。電話：021-64387891-133，E-mail：coriah@126.com。

*通訊作者: 薛建萍(1961～)，女，高級工程師。電話：021-64387891-133，E-mail：xjp54241246@163.com。