紫色紅曲霉Mp-24高產Monacolin K發酵工藝響應面優化

Bedelkhan Almagul， 任 浩， 章 婷， 鄭婕施， 韓肖飛， 蔣冬花

浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004

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紫色紅曲霉Mp-24高產Monacolin K發酵工藝響應面優化

Bedelkhan Almagul， 任 浩， 章 婷， 鄭婕施， 韓肖飛， 蔣冬花*

浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004

將單因素實驗結果與響應面法相結合，對高產Monacolin K的紫色紅曲霉Mp-24菌株進行發酵工藝條件優化。通過搖瓶發酵對碳源、氮源、碳源含量、氮源含量、培養時間等進行單因素優化，確定Mp-24菌株搖瓶發酵適宜條件：乳糖為碳源、酵母膏為氮源、碳源含量7%、氮源含量2%、培養時間12 d，Monacolin K產量為167 mg/L。應用Box-Behnken中心組合試驗設計建立數學模型，進行響應面分析優化發酵條件，結果顯示最佳發酵工藝條件為：碳源(乳糖)8%，氮源(酵母膏)3%，培養時間11 d，在此條件下Monacolin K的含量達到247.8 mg/L，比優化前提高1.5倍。

紫色紅曲霉； Monacolin K； 發酵工藝； 應面優化

莫納可林K(Monacolin K)是控制膽固醇合成的抑制劑，是紅曲霉菌種的次級代謝產物；它能抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶(EC1.1.1.34)在膽固醇生物合成中轉化為甲羥戊酸[1]。Monacolin K已經被描述為降低血清膽固醇含量的最有效的一類藥物，并已報道可以減少心血管疾病和冠狀動脈疾病患者的死亡率[2]。與傳統固態發酵法相比，液態發酵法具有規模大、自動化程度高、人力成本低及生產過程中可以控制雜菌染菌的顯著優點，近年來國內在 Monacolin K的研究和生產取得了一些進展，但是生產水平仍較低[3]，目前Monacolin K市場價格居高不下也源于此。因此，如何提高Monacolin K的產量是目前國內外相關科研工作者解決的重要問題。響應面法(response surface methodology，RSM)可用于優化培養基配方和培養條件[4,5]，提升發酵產品的產量；響應面法中的Box-Benhken實驗設計已廣泛地應用于發酵工藝優化，其中包括 Monacolin K的液態發酵工藝[6,7]。本文利用響應面中的Box-Benhken實驗設計法，回歸分析法對紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)Mp-24菌株液態發酵產Monacolin K的工藝條件進行了優化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)Mp-24菌株(以下稱Mp-24菌株)：為本實驗室前期從紅曲米中篩選到的高產Monacolin K的優良菌株。

1.1.2 培養基[8]

PDA培養基(%)：馬鈴薯20、葡萄糖2、瓊脂1.5,pH 5.5～6.0。用于Mp-24菌株的常規培養和活化。

麥芽汁瓊脂培養基(%)：麥芽汁2、瓊脂2、蔗糖2、蛋白胨1,pH 5.5～6.0。用于Mp-24菌株的常規培養。

種子培養液(%)：葡萄糖6、蛋白胨2、NaNO30.2、MgSO4.7H2O 0.1、KH2PO40.2,pH 5.5～6.0。用于Mp-24菌株的種子培養。

發酵培養液(%)：乳糖7、酵母膏2、NaNO30.2、MgSO4.7H2O 0.1、KH2PO40.2，pH 5.5。用于Mp-24菌株的發酵培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 Mp-24菌株的培養[9]

菌株的活化培養：將所保存的菌種接種到PDA培養基上，28 ℃恒溫活化培養6 d～7 d。再將PDA培養基上的菌種轉接到麥芽汁瓊脂培養基上，28 ℃恒溫培養7 d～8 d。

菌株的種子液培養：500 mL三角瓶裝200 mL種子培養液，將在麥芽汁瓊脂培養基上培養7 d～8 d的菌落用打孔的方法取4個菌餅(直徑0.6 cm)接入種子培養液中，26 ℃、100 r/min旋轉式搖床上培養4 d，用作種子液。

菌株的液體發酵培養：250 mL 三角瓶裝100 mL發酵培養液，將種子液按5%的體積接種到發酵培養液中，26 ℃、180 r/min旋轉式搖床上培養12 d。

這個設備利用晶體管取代開關。與上述的裝置一樣，開啟和關閉電壓用來檢測傳感器的工況。與利用開關的裝置一樣，由發動機ECU提供一個5V電壓給傳感器，當晶體管打開或關閉時會產生端子電壓的變化，ECU使用端子電壓的變化來檢測傳感器的工況。另外，有些裝置使用12V的電源。

1.2.2 Monacolin K含量測定

(1)樣品處理：取發酵液1 mL，煮沸10 min，4 ℃，8 000 r/min離心10 min，上清液用HPLC法檢測Monacolin K產量[10]。

(2)高效液相色譜法測定Monacolin K含量[11]：配制梯度濃度的Monacolin K標準品用下述色譜條件測定產量并繪制標準曲線。色譜條件：Agilent TC-C18液相色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)，A溶液為乙腈(0.45 μm有機相濾膜過濾)，B溶液為pH 2.5的磷酸溶液(0.45 μm水相濾膜過濾)。檢測波長λ=237 nm，流速1 mL/min，流動相為乙腈∶磷酸緩沖液(pH 2.5)=75∶25，進樣體積20 μL，柱溫27 ℃。得出相關系數高的標準曲線，HPLC法檢測Monacolin K的標準曲線為：y=58.61x，相關系數R2=0.999 4，符合要求(圖1)。發酵上清液用相同的色譜條件測定Monacolin K產量。

圖1 Monacolin K標準曲線

1.2.3 單因素對Monacolin K產量影響的優化實驗

Mp-24菌株26 ℃、180 r/min液體培養12 d，探討培養基配方和培養條件對Mp-24菌株產Monacolin K的影響。① 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖和蔗糖；② 氮源：黃豆粉、玉米粉、蛋白胨、酵母膏、硝酸鈉和硫酸銨；③碳源含量：3%、4%、5%、6%、7%和8%；④氮源含量：1%、2%、3%、4%和5%；⑤ 培養時間：6 d、8 d、10 d、12 d和14 d。

實驗設3次重復，發酵液用HPLC法檢測Monacolin K產量。

1.2.4 Box-Behnken實驗設計

在單因素優化實驗的基礎上選擇碳源含量(%)，氮源含量(%)，培養時間(d)等因素作為考察對象，Monacolin K的產量為響應值，通過Box-Behnken[12]實驗設計法篩選出產Monacolin K最高的條件因素。

1.2.5 響應面優化

本實驗采用Stat-Ease Design-Expert 8.0.0中的Box-Bennken實驗設計法。

2 結果與分析

2.1 紅曲霉Mp-42菌株的鑒定

2.1.1 形態特征

Mp-24紅曲霉菌株在麥芽汁瓊脂培養基上30 ℃培養10 d的菌落見圖2.A，表面平坦，菌絲短小，絲絨狀，起初大部分呈淺紅色，邊緣呈淡黃色；培養10 d以后顏色變為深紅色，背面無輻射紋(圖2.B)，中間為深紅色，邊緣為橘黃色，菌落直徑達50 mm；顯微鏡觀察下菌絲光滑，有隔膜(圖2.C)；分生孢子直徑(7～8) μm近球形，單生或鏈狀(圖2.D)；閉囊殼呈球形(圖2.E)，囊內孢子可見，直徑(6～8) μm，無色或者淡黃色。

2.1.2 ITS基因序列和系統發育樹

Mp-24菌株的ITS 基因序列分析結果見圖3，其長度為556 bp，基于紅曲霉屬ITS序列建立的系統發育樹如圖4，與紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)的相似度最高，為99%。

2.1.3 Mp-24菌株鑒定結果

圖2 Mp-24菌株的菌落(A，B)、菌絲(C)、分生孢子(D)及閉囊殼和子囊孢子(E)

圖3 Mp-24菌株ITS基因序列(556 bp)

圖4 基于14株紅曲霉屬ITS基因序列建立的

2.2 單因素優化Mp-24菌株發酵條件

以Monacolin K產量為指標，經單因素優化Mp-24菌株適宜的發酵條件為：碳源為乳糖、氮源為酵母膏、碳源含量7%、氮源含量2%、培養時間12 d，Monacolin K產量最高為167 mg/L(圖5)。

2.3 響應面優化Mp-24菌株發酵條件

2.3.1 Box-Behnken試驗設計和結果

實驗中自變量為碳源含量(%)、氮源含量(%)和培養時間(d)，分別用X1、X2、X3代表，每個自變量又有低、中、高水平編碼值分別為-1、0、+1，發酵液中Monacolin K的產量為響應值。試驗因素水平見表1，試驗結果見表2。

表1 Box-Behnken試驗設計因子編碼水平與取值表

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

圖5 培養基配方和培養時間對Mp-24菌株Monacolin K產生的影響

2.3.2 模型方程的建立與顯著性檢驗

利用SAS8軟件對表2中的試驗結果進行二次線性回歸擬合，得到數學模型：

Y1=180.4+12X1+44.13X2-54.38X3-2.50X1X2-8.50X1X3-20.75X2X3+7.18X12-10.57X22-102.07X32

由表3可知，該模型極顯著(P<0.01)，從表可知R2=0.941 7，說明該模型能解釋94%響應值的變化，復相關系數R2Adj=0.866 6，進一步說明該模型擬合度較好，失擬合不顯著(P>0.05)，說明二次線性回歸方程高度顯著，對響應值能很好的進行預測[14]。一次項X2、X3表現為極顯著，(P<0.01)，說明它們對響應值有影響。從響應值F值可知，發酵條件對 Monacolin K質量濃度影響因素顯著性順序為：培養時間>氮源含量>碳源含量。

2.3.3 響應面分析圖

響應圖和等高線圖由SAS8.1軟件分析得出，可以直觀反映出各個因素與響應值的交互作用，等高線圖的形狀可以反映出效應的強弱，如果高線圖形狀為橢圓形的，則證明自變量之間交互作用顯著，圓形則為相反效應[15]。具體的響應圖結果見圖6～8。

從圖6的響應面圖與等高線圖中可以看出，當固定培養時間為12 d，在1%～3%的氮源(酵母膏)含量試驗水平范圍內，Mp-24菌株中Monacolin K含量隨著碳源(乳糖)濃度的增加呈先較少后增加趨勢，當碳源(乳糖)濃度在7.5%～8%時Monacolin K的濃度為最高。在6%～8%碳源(乳糖)濃度試驗水平范圍內，Monacolin K含量隨氮源(酵母膏)濃度的升高而先較少后增加，氮源的最適濃度區間在2.5%～3%。添加不同碳源與氮源含量從低到高時，Monacolin K的濃度則先較少后增加，從等高線圖中因素軸向等高線變化密集度可知，氮源含量(%)對Monacolin K的影響高于碳源含量(%)。

表3 回歸方程統計分析結果

注:**極顯著(P<0.01); *顯著(0.01

圖6 碳源含量(X1)與氮源含量(X2)之間相互作用的響應面和等高線圖

從圖7的響應面圖與等高線圖中可以看出，當固定氮源(酵母膏)含量為2%，在6%～8%的碳源含量(乳糖)試驗水平范圍內，Mp-24菌株中Monacolin K含量隨著培養時間的增加呈先上升后下降趨勢，最適的培養時間在11 d～12 d。在10 d～14 d培養時間試驗水平范圍內，Monacolin K含量隨碳源(乳糖)濃度的升高而先較低后增加，碳源的最適濃度區間在7.5%～8%。添加不同碳源與不同培養時間從低到高時，Monacolin K 的濃度則先上升后下降，從等高線圖中因素軸向等高線變化密集度可知，培養時間對Monacolin K的影響高于碳源含量。

從圖8的響應面圖與等高線圖中可以看出，當固定碳源(乳糖)含量為7%，在1%～3%的氮源含量(酵母膏)試驗水平范圍內，Mp-24菌株中Monacolin K含量隨著培養時間的增加呈先上升后下降趨勢，最適的培養時間在11 d～12 d。在10 d～14 d培養時間(d)試驗水平范圍內，Monacolin K含量隨氮源(酵母膏)含量的增加而先較低后增加，氮源的最適含量區間在2.5%～3%。添加不同氮源含量與增加培養時間從低到高時，Monacolin K 的濃度則先較少后增加，從等高線圖中因素軸向等高線變化密集度可知，培養時間對Monacolin K的影響高于氮源含量。

圖7 碳源含量(X1)與培養時間(X3)之間相互作用的響應面和等高線圖

圖8 氮源含量(X2)與培養時間(X3)之間相互作用的響應面圖與等高線圖

2.3.4 模型結論

為確定最佳點，再對數學回歸模型求一階偏導，得出優化條件：X1=+12﹑X2=+44.13、X3=-54.38，此時Y1=260。利用編碼公式將上述編碼值轉變為實際參數為：碳源含量8%、氮源含量3%、培養時間11.18 d，考慮實際操作性，調整確定優化工藝為：碳源含量8 g/mL(100 mL)、氮源含量3 g/mL(100 mL)、培養時間11 d，經驗證實驗，在此條件下發酵液的Monacolin K 質量濃度達到247.8 mg/L。在本實驗條件下建立數學模型準確可靠，試驗實際值和預測值擬合度較好。

3 討論與結論

通過對紅曲霉發酵過程中各種條件進行優化，可以促進 Monacolin K產量的增加。國內外學者在這方面做了較多研究，從發酵過程中的培養基的組成到培養條件，均有相關報道。在培養基的配方上，國內外學者多從碳源、氮源、碳氮含量等因素進行研究；在培養條件的優化上，從發酵時間、初始 pH、搖瓶轉數、裝液量等因素進行研究，Monacolin K的產量均有提高。

本實驗通過單因素試驗獲得適宜發酵條件為：乳糖7%，酵母膏2%，培養時間12 d，通過單因素實驗與響應面法結合可以進一步有效的優化Mp-24菌株液態發酵產Monacolin K 的工藝條件。響應面優化后的發酵條件為：乳糖8%、酵母膏3%、培養時間11 d，在此條件下Monacolin K的質量濃度達到：247.8 mg/L，比優化前提高1.5倍。方春玉等[16]的研究結果：最佳發酵條件碳源(甘油)為7%，氮源含量(酵母膏)為3%，培養時間為14 d，Monacolin K 產量達到了245 mg/L；張朝暉等[17]對1株不產桔霉素的紫色紅曲霉菌株，在2 L的發酵罐中，利用添加了酵母膏的葡萄糖-甘油培養基，在第13 d的Monacolin K產量可達104 mg/L。胡文效等[18]對1株紅曲霉菌株MS-12進行三次誘變，結合液態發酵各因素的優化結果，當碳源為甘油7%+大米粉2%和氮源為0.5%的蛋白胨，培養時間則為12 d，Monacolin K的質量濃度為264.7 mg/L。

本實驗獲得最佳發酵條件為：碳源(乳糖)含量8%，氮源(酵母膏)含量為3%，培養時間為11 d，在此條件下得到的Monacolin K的質量濃度與方春玉[16]等和胡文效等[18]的研究結果相接近。本實驗應用Box-Behnken中心組合試驗設計和響應面分析優化發酵條件獲得最佳發酵工藝條件為：碳源8%，氮源3%，培養時間11 d，在此條件下Monacolin K的含量達到了247.8 mg/L，豐富了Monacolin K生產的菌株資源。

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Optimizing fermentation conditions of high-yielding Monacolin K byMonascuspurpureusstrain Mp-24 using response surface methodology

Bedelkhan Almagul, REN Hao, ZHANG Ting, ZHENG Jie-shi, HAN Xiao-fei, JIANG Dong-hua

College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004

Response surface methodology and single factor experiment were combined to optimize the submerged culture conditions for the production of Monacolin K usingMonascuspurpureusstrain Mp-24. Through analyzing the influence of carbon sources, nitrogen sources, carbon content, nitrogen content and culture time, the results showed that optimal fermentation conditions were as follows: lactose(carbon source), yeast extract(nitrogen source), carbon content of 7%, nitrogen content of 2% and culture time of 12 d. Monacolin K yield was 167 mg/L. After using Box-Behnken central composite design and response surface analysis, the optimum conditions were: carbon (lactose) of 8%, nitrogen (yeast extract) of 3% and culture time of 11 d. Under the optimized conditions, the content of Monacolin K reached 247.8 mg/L. The optimized fermentation conditions resulted in 1.5 times increase of Monacolin K yield in comparison with that of the original conditions.

Monascuspurpureus; Monacolin K; fermentation conditions; response surface methodology

國家自然科學基金項目(NO. 31270061; NO. 31570013)。

Bedelkhan Almagul(1989～), 女, 哈薩克斯坦人, 在讀研究生，研究方向為應用微生物。

*通訊作者:蔣冬花(1964～)，女，教授。E-mail: jdh@zjnu.cn。