大豆PM34基因生物信息學(xué)預(yù)測及表達(dá)分析

趙　艷，翟　瑩，宮國強(qiáng)，王　曼，趙　陽

( 1. 齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 吉林省食品檢驗(yàn)所，長春 130000 )

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大豆PM34基因生物信息學(xué)預(yù)測及表達(dá)分析

趙艷1*，翟瑩1，宮國強(qiáng)2，王曼1，趙陽1

( 1. 齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 吉林省食品檢驗(yàn)所，長春 130000 )

以大豆葉片總RNA為模板，采用RT-PCR法從吉豆2號品種中克隆獲得大豆種子成熟蛋白(PM34)基因序列，利用生物信息學(xué)方法對大豆PM34基因編碼的蛋白進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明：該基因編碼蛋白理論分子量為31.7 kDa，等電點(diǎn)為6.60，為親水性蛋白；該蛋白中無跨膜結(jié)構(gòu)；該蛋白中不存在信號肽。PM34基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α 螺旋占12.97%，無規(guī)則卷曲占41.30%，β折疊占45.73%。PM34基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，同源模建的模板是3ijr.1.A，是一種短鏈脫氫酶/還原酶，與該蛋白的同源性為54.65%。在進(jìn)化關(guān)系上，與綠豆、苜蓿的親緣關(guān)系相對較近。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法(qRT-PCR)，檢測大豆PM34基因在大豆各器官中的表達(dá)方式，結(jié)果表明該基因在大豆根、莖、葉、花中的表達(dá)活性低，而在種子中，尤其是成熟種子中的相對表達(dá)活性很高。該研究結(jié)果為大豆PM34基因結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

大豆，PM34基因，克隆，生物信息學(xué)，qRT-PCR

大豆種子中含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白氨基酸組分齊全，其具有抗腫瘤，預(yù)防心血管疾病，增強(qiáng)免疫力等保健作用(Min et al, 2015)。大豆種子發(fā)育過程主要有3個(gè)時(shí)期，即形態(tài)建成期，成熟期和脫水干燥期。在種子成熟期階段，淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)在種子中大量積累(Kim & Lim, 2014)，其中蛋白質(zhì)占40%左右，種子貯藏蛋白在種子形成過程中逐漸合成和積累，是大豆種子萌發(fā)中氨基酸和氮的主要來源(劉春等，2008)。種子蛋白包括貯藏蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白及其它功能性蛋白等，其中貯藏蛋白占種子蛋白的70%～80%。根據(jù)離心時(shí)具有的不同沉降值將大豆貯藏蛋白分為2S、7S、11S和15S 4種組分(Singh et al, 2015; Rudakova et al, 2014)，其它蛋白還包括脈酶、植物凝集素和胰蛋白酶抑制劑等(Meyerl et al, 2012)。顏克亮等(2008)分析大豆種子形態(tài)建成期與成熟期基因差異表達(dá)情況，獲得在發(fā)育過程中可能影響大豆種子形態(tài)建成及蛋白質(zhì)、油脂合成代謝等調(diào)控的重要基因，檢測表明大豆種子成熟蛋白基因(PM34)在大豆種子中表達(dá)量較高(顏克亮等，2008)，但并未對PM34基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)，該基因在大豆各器官中的表達(dá)量做進(jìn)一步研究，此外，至今在各種植物中對PM34基因的研究都鮮有報(bào)道。

本研究主要是克隆大豆PM34基因的序列，利用生物信息學(xué)分析該基因編碼蛋白的一級、二級、三級結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系；此外，通過qRT-PCR方法檢測大豆PM34基因在大豆各器官中的表達(dá)情況，為大豆PM34基因結(jié)構(gòu)功能研究及其他植物中PM34基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 材料及主要試劑

大豆品種吉豆2號為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH 5α感受態(tài)購自北京索萊寶公司；TRIzol reagent 購自Invitrogen公司；Oligo(dT)18、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Recombinant RNase Inhibitor、ExTaq、pMD18-T克隆載體、SYBP Premix Ex TaqⅡ熒光定量試劑盒、限制性內(nèi)切酶HindIII 和KpnI均購自Takara公司；DNA凝膠回收試劑盒購自維特潔公司；引物合成、測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 大豆PM34基因序列的克隆

取大豆4葉期的葉片，提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄步驟合成大豆cDNA的第一條鏈。根據(jù)大豆基因組序列(http://www.phytozome.net/soybean)，利用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)引物，(Z1: 5′-ATGGCTTCCGGTGAACAGA-3′; Z2: 5′-TTAACCATTCACAACGGTTCCAC-3′)，RT-PCR擴(kuò)增大豆PM34基因序列。反應(yīng)條件為預(yù)變性 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段，按照試劑盒說明將擴(kuò)增片段與pMD18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)，搖菌，重組質(zhì)粒雙酶切鑒定后測序。

1.3 大豆PM34基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

利用TMHMM Serverv 2.0和ExPASy Proteomics Server (http://expasy. org. tools/protparam. html)在線軟件，預(yù)測大豆PM34基因編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)：基本理化性質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)(王同淑等，2015)；利用SignalP4.0和PORTER在線軟件，預(yù)測大豆PM34基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)：信號肽和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(許瑞瑞等，2012)；利用SWISS-MODLE在線軟件，預(yù)測大豆PM34基因編碼蛋白的三級結(jié)(鄭玲等，2011)。

通過NCBI中BLAST，對大豆PM34基因進(jìn)行氨基酸的同源性搜索。利用多序列比對軟件ClustalX和MEGA 5.0軟件，采用鄰接法(Neighbor Joining)，1 000次自檢舉(bootstraping)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Sun et al, 2014; Saitou & Nei, 1987; Kumar et al, 2001; Yuan et al, 2014)。

1.4 QTR-PCR

分別提取大豆根、莖、葉、花、未成熟種子(開花后30 d)、成熟種子(開花后90 d)的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄的步驟分別合成cDNA的第一條鏈。以上不同大豆器官、不同發(fā)育階段的材料cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。大豆的內(nèi)參基因?yàn)棣?tubulin (GMU12286)，上、下游引物分別為(B1: 5′-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3′; B2: 5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′)(Zhao et al, 2015)。根據(jù)大豆PM34基因的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)檢測大豆PM34基因在大豆各器官中表達(dá)量的引物，上游引物為Y1:5′-TGCGAAACTATTGGACTACACG-3′，下游引物為Y2:5′-GAAAGAGGCTGGTATCAAAGG-3′。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s(Pan et al, 2015; Acharya et al, 2014; Schmidt & Delaney, 2010)。

2　結(jié)果與分析

2.1 大豆PM34基因序列的克隆

根據(jù)大豆基因組中的序列，RT-PCR方法克隆獲得大豆PM34基因核苷酸序列，長為882 bp的條帶(圖1)。將該片段連接到pMD18-T載體上，獲得重組質(zhì)粒 pMD18-T-PM34。從大腸桿菌菌液中提取質(zhì)粒，用HindIII 和KpnI 進(jìn)行雙酶切鑒定，得到與預(yù)期相符的片段(圖1)。利用DNAMAN軟件，將測序結(jié)果與大豆基因組中該段序列進(jìn)行同源性比對，同源性達(dá)到100%。

圖 1　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pMD18-T-PM34酶切鑒定M. 2 000 分子標(biāo)識；1. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2. pMD18-T-PM34酶切鑒定。Fig. 1　PCR amplification and restriction enzyme digestion identification of pMD18-T-PM34　M. 2 000 marker; 1. The PCR product; 2. Hind III and Kpn I digestion of pMD18-T-PM34.

2.2 大豆PM34基因的生物信息學(xué)預(yù)測

2.2.1 大豆PM34基因編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用Protparam在線軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析，預(yù)測得知大豆PM34基因編碼蛋白的分子式為C1404H2213N385O431S12，分子量為31.7 KD, 等電點(diǎn)(pI)為6.60，帶正電殘基(Arg + Lys) 總數(shù)為30，帶負(fù)電殘基(Asp + Glu)總數(shù)為31，總的親水性平均系數(shù)為-0.286，該蛋白屬于親水性蛋白。氨基酸組成見表1。此外，通過TMHMM在線軟件對大豆PM34基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2.2 大豆PM34基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用SignalP4.0軟件預(yù)測得知，大豆PM34基因編碼的蛋白不存在信號肽；用PORTER在線軟件預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)表明，此蛋白的α螺旋占12.97%，無規(guī)則卷曲占41.30%，β折疊占45.73%。

2.2.3 大豆PM34基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測表明，同源模建的模板是3ijr.1.A，它是一種短鏈脫氫酶/還原酶，與大豆PM34基因編碼蛋白的同源性為54.65%。預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)如圖2。

2.2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析除有報(bào)道該基因?yàn)榇蠖狗N子成熟蛋白基因外，在各種植物中對PM34基因的研究都很少。本研究在NCBI中搜索與大豆PM34基因編碼氨基酸序列同源性高的序列，分別來源于大豆(Glycinemax)、綠豆(Vignaradiata)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、苜蓿(Medicagotruncatula)，桑樹 (Morusnotabilis)和擬南芥(Arabidopsis)。利用ClustalX和 Mega5.0 軟件，構(gòu)建大豆PM34基因編碼氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化關(guān)系如圖3所示：大豆PM34基因(AAF89645)與大豆葡萄糖、核糖醇脫氫酶基因(NP 001242815)關(guān)系最近，同源性為95.56%。其次是綠豆葡萄糖、核糖醇脫氫酶基因(XP 014513287)，苜蓿葡萄糖、核糖醇脫氫酶基因(XP 003591094)，同源性分別為89.42%、88.40%。而與擬南芥葡萄糖、核糖醇脫氫酶基因(NP 564670.2)及擬南芥氧化還原酶基因(XP 002891915)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，同源性分別為67.16%、64.37%。以上結(jié)果比較符合傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)，大豆、綠豆、苜蓿同屬雙子葉植物中的豆科植物，擬南芥屬于單子葉植物中的十字花科植物。

2.3 大豆PM34基因的表達(dá)特性

大豆持家基因β-tubulin為內(nèi)參，利用qRT-PCR方法對大豆根、莖、葉、花、未成熟種子和成熟種子中PM34基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。圖4結(jié)果顯示，大豆PM34基因在大豆根、莖、葉、花中的表達(dá)低，相對于葉中的表達(dá)量，大豆PM34基因在根、莖、花中表達(dá)活性分別為10.4、0.08、0.49；而在大豆種子中，尤其是成熟種子中的相對表達(dá)活性很高，相對于葉中的表達(dá)量，大豆PM34基因在未成熟種子和成熟種子中的表達(dá)活性分別為219.79和930.65。

表 1　大豆PM34基因編碼蛋白的氨基酸組成

圖 2　大豆PM34基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2　Protein tertiary structure prediction of soybean PM34 proteins

3　討論與結(jié)論

PM34基因是大豆種子成熟蛋白基因，其編碼蛋白可能在種子發(fā)育過程中起作用。PM34基因在各種植物中鮮有報(bào)道。本研究提取大豆吉豆2號品種的總RNA，克隆大豆PM34基因的序列，測序結(jié)果表明克隆的PM34基因序列與大豆基因組(williams 82)中的相應(yīng)序列一致，說明品種間無差異。通過生物信息學(xué)相關(guān)軟件對該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化等方面進(jìn)行預(yù)測，這些結(jié)果有助于該基因所編碼蛋白的功能研究。

本研究中根據(jù)大豆PM34基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，在NCBI的BLAST中進(jìn)行大豆PM34基因編碼蛋白序列的搜索并構(gòu)建進(jìn)化樹。無論是同源性達(dá)到95.56%的來源于大豆的基因，還是綠豆、苜蓿中高同源性的基因，甚至是進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)的擬南芥中的基因，這些基因都是葡萄糖、核糖醇脫氫酶基因，說明大豆PM34基因很可能是另一個(gè)大豆葡萄糖、核糖醇脫氫酶基因，該方面仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

由qRT-PCR結(jié)果可知，大豆PM34基因的表達(dá)主要集中在種子中，在其他器官中的相對表達(dá)量較低，屬于種子特異表達(dá)基因，這可能與其是種子成熟蛋白基因有關(guān)，此外，其上游的啟動子很可能具有調(diào)控下游基因在種子中特異表達(dá)的特性(Yang et al, 2012; Fu et al, 2010; Zavallo et al, 2010)。本研究為大豆PM34基因及其上游啟動子的結(jié)構(gòu)和功能研究提供理論基礎(chǔ)。大豆PM34基因是否為另一個(gè)大豆葡萄糖、核糖醇脫氫酶基因，PM34基因及其啟動子的功能研究將是下一步實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

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圖 3　大豆PM34基因編碼氨基酸的進(jìn)化樹分析Fig. 3　Phylogenetic relationships of soybean PM34 gene

圖 4　大豆PM34基因在大豆各器官中的表達(dá)Fig. 4　Expression of soybean PM34 gene in different soybean organs

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Bioinformatics and the expression pattern analysis of soybeanPM34 gene

ZHAO Yan1*, ZHAI Ying1, GONG Guo-Qiang2,WANG Man1, ZHAO Yang1

( 1. College of Life Sciences and Agroforestry, Qiqihaer University, Qiqihaer 161006, Heilongjiang，China;2.JilinProvincialInstituteofFoodInspection, Changchun 130000, China )

In this paper, the structure and tissue-specificity of the soybean seeds mature protein gene (PM34 ) were studied, which could become the the foundations for further research the function ofPM34 gene in soybean or the other plants. The sequence of soybean(Jidou2)PM34 gene was amplified by RT-PCR with the total RNA of soybean leaf as templet. The structure of soybeanPM34 gene was predicted by bioinformatics. The expression pattern of soybeanPM34 gene in soybean organs was detected by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). The results showed that the molecular weight of the protein was 31.7 kDa, the isoelectric point was 6.60, and belonging to the hydrophilic protein. There was absent transmembrane domain and singal peptide. The secondary structure was comprosed of 12.97% alpha helix, 41.30% coil and 45.73% extended strand. The protein tertiary structure prediction showed that the homologous model template was 3 ijr. 1. A, which was a kind of short chain dehydrogenase/reductase and the homology was 54%. The evolutionary relationship demonstrated that soybean had relatively closer relationship withVignaradiataandMedicagotrun-catulathan others. In addtion, the result showed that there was a little activity in roots, stems, leaves and flowers, but there was the highest activity in seeds, especially in mature seeds.

soybean，PM34 gene，cloning，bioinformaics，qRT-PCR

10.11931/guihaia.gxzw201601026

2016-03-17

2016-09-15

黑龍江省自然科學(xué)基金(C201458)；黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃(UNPYSCT_2016090)；國家自然科學(xué)基金(31301335) [Supported by the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (C201458); Training Plan of Young Creative Talents of Average Four-Year College of Heilongjiang (UNPYSCT_2016090)；the National Nature Science Foundation of China (31301335) ]。

趙艷(1981-)，女，吉林吉林市人，博士，副教授，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)，(E-mail)zhaoyan3053877@163.com。

Q943.2

A

1000-3142(2016)10-1220-05

趙艷，翟瑩，宮國強(qiáng)，等. 大豆PM34基因生物信息學(xué)預(yù)測及表達(dá)分析 [J]. 廣西植物，2016，36(10):1220-1224

ZHAO Y, ZHAI Y, GONG GQ，et al. Bioinformatics and the expression pattern analysis of soybeanPM34 gene [J]. Guihaia，2016，36(10):1220-1224