關蒼術兩性花與雌花花藥的解剖學研究

具紅光，全雪麗，崔馨月，李美善，樸　錦

( 延邊大學 農學院，吉林 延吉 1330021 )

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關蒼術兩性花與雌花花藥的解剖學研究

具紅光，全雪麗，崔馨月，李美善，樸錦*

( 延邊大學 農學院，吉林 延吉 1330021 )

蒼術屬(AtractylodesDC.)是菊科菜薊族(Cynareae)刺苞亞族(Carlininae O. Hoffm.)的一個東亞特有屬，世界上僅有7 種，其中我國有5 種。該研究以關蒼術為材料，采用石蠟切片法比較研究了兩性花和雌花的花藥及雄配子體發育進程，并進一步探討了其雌花產生花藥退化的時期及原因。結果表明：(1)關蒼術小孢子發育與花蕾長度間存在相關性，當花蕾長度在5 mm時進入花粉母細胞時期，花藥壁已分化，在7～9 mm時處于四分體時期，大于11 mm時開始進入花粉粒時期。(2)關蒼術花藥5 個，花粉囊4 個，減數分裂屬同時型，四分體以正四面體為主，屬3-細胞型，萌發溝3個。(3)關蒼術花粉囊壁發育屬雙子葉型，從外層的表皮、藥室內壁，到內層的中層和絨氈層均由一層細胞構成，關蒼術絨氈層為腺質絨氈層。(4)關蒼術雌花花藥退化發生在花藥發育早期至四分體時期，表現為花藥發育早期畸形、藥壁分化異常、小孢子母細胞發育停滯在前期、絨氈層增生4個原因。該研究結果為蒼術屬植物的系統發育、物種形成和進化提供胚胎學依據。

關蒼術, 花藥發育, 聚藥雄蕊, 退化雄蕊, 雄配子體

蒼術屬隸屬菊科菜薊族(Cynareae)刺苞亞族(Carlininae O.Hoffm.)，世界上僅有7 種，其中我國有5 種，分別為茅蒼術、朝鮮蒼術、北蒼術、關蒼術和鄂西蒼術(石濤，1987)。關蒼術(Atractylodesjaponica)主要分布在我國東北的吉林省、黑龍江省、遼寧省，是當地特色藥食兼用植物(馬玲等，2012)。關蒼術味辛、苦，性溫，歸脾、胃、肝經，具有祛風濕、燥濕健胃、明目等功效，能治食欲不振、肢節酸痛、胸痞腹脹、夜盲及濕困脾胃等疾病(南京中醫藥大學，2006)。2003年，關蒼術在抗擊非典過程中脫穎而出，因而越來越多的人們關注其藥用價值(丁立威，2012；比十，2008)。國內市場上關蒼術商品主要來自于野生資源，但近幾年主產區東北三省的野生資源急劇減少(王春亮，2004)。因此，迫切需要實現人工栽培和野生撫育，保證其資源的可持續利用。樸錦等(2015)通過對關蒼術的調查發現，無論是野生還是人工栽培的關蒼術，單果結實率都很低，一般在40%左右；樸錦等(2015)通過關蒼術繁育系統的研究發現，關蒼術屬于專性異花授粉植物，兩性花和雌花的比例接近1∶1，從而使大部分雌花由于花粉緊缺而無法完成授粉，是降低結實率的主要原因之一。

目前，有關蒼術屬植物有效成分、藥理作用及栽培方面的研究報道逐漸增加，而對胚胎學及細胞遺傳學方面的研究尚見甚少。因此，本研究對關蒼術花藥及雄配子體發育過程進行系統觀察，探討雌花花藥退化的原因及發生時期，為蒼術屬的系統發育、物種形成和進化提供胚胎學依據。

1　材料與方法

1.1 材料

于2014年7月6-8日，在延邊大學中藥材種植基地的關蒼術種質資源圃，用手術刀片分別切取不同時期的兩性花和雌花花蕾。材料按花蕾長度(<4、5～7、7～9、9～11、11～13 mm及大于13 mm)的6個標準來劃分。

1.2 方法

將切取的花蕾用FAA固定，取出后用小鑷子剝掉外圍的總苞片，放入氫氟酸(HF)溶液中浸泡2 d進行預處理(每天更換1次氫氟酸溶液)。常規石蠟切片法制片，用徠卡石蠟切片機(RM 2016)切片，厚度為10 μm，染色用番紅-固綠，中性樹膠封片，利用光學顯微鏡(OLYIMPUS)找出各發育時期，同時顯微照相。

表 1　關蒼術小孢子發育與花蕾長度相關性

圖版 Ⅰ　關蒼術小孢子發生及雄配子體的形成　 1. 花序發育初期；2. 花粉囊；3. 孢原細胞；4. 造孢細胞；5. 絨氈層；6. 花粉母細胞時期；7-8. 花藥壁已分化；9. 第一次核分裂；10-13. 四分體時期；14. 小孢子；15-16. 形成萌發溝(核花粉粒初期)；17. 單核花粉粒；18. 單核靠邊期；19. 二核花粉粒；20. 三核花粉粒；“—”為標尺，均為50 μm。Ep. 表皮；En. 藥室內壁；ML. 中層；Ta. 絨氈層；Gc. 生殖細胞；VC. 營養細胞；PS. 初生造孢細胞；PP. 初生壁細胞；SS. 次生造孢細胞；Tr. 四分體。Plate Ⅰ　Emergency of microspore and male gametophyte for Atractylodes japonica　 1. Early inflorescence development; 2. Pollen sacs; 3. Archesporial cell; 4. Sporogenous cell; 5. Tapetum; 6. Pollen mother cell stage; 7-8. Anther wall of differentiated; 9. The first mitotic figures; 10-13. Tetrad stage; 14. The microspore; 15-16. Germination ditch(Early nuclear pollen grains); 17. Mononuclear pollen grains; 18. Mononuclear aside period; 19. Two nuclear pollen grains; 20. Three nuclear pollen grains; Bars for 50 μm. Ep. Eplidermis；En. Endothecium；ML. Middlelayer；Ta. Tapetum；Gc. Generative cell；VC. Vegetative cell；PS. Primary sporogenou scell；PP. Primaryparietal cell；SS. Secondary sporogenous cell；Tr. tetrad.

圖版 Ⅱ　關蒼術退化雄蕊發育過程　a. 畸形花藥；b. 花粉囊退化；c. 空花粉囊；d. 畸形排列的花粉囊；e. 絨氈層細胞和小孢子母細胞成團；f. 絨氈層不溶解；g-h. 小孢子相互粘連；i. 絨氈層退化；j. 異常絨氈層；k. 花粉粒時期(絨氈層不溶解)；l. 成熟花粉粒(絨氈層不溶解);“-”為標尺，均為50 μm。Plate Ⅱ　Development process of staminode for Atractylodes japonica　 a. The abnormal anthers；b. Anther degeneration；c. Empty pollen sac；d. Anther deformity ranging；e. Tapetum cells and microspore mother cells group；f. Tapetum dissolved；g-h. Mutual adhesion；i. Tapetum degeneration；j. Abnormality of tapetum；k. Pollen grain stage (Tapetum dissolved)；l. Mature pollen grains (The tapetum dissolved)；Bars are 50 μm.

2　結果與分析

2.1 花蕾長度與小孢子發育相關關系

關蒼術小孢子發育與花蕾長度間存在相關關系。當花蕾長度小于4 mm時，處于發芽分化初期和花藥壁形成期；花蕾長度在5～7 mm時，進入花粉母細胞時期，花藥壁已分化；長度在7～9 mm時處于四分體時期，此時絨氈層細胞已成熟，達到最大；長度在9～11 mm時處于四分體的后期，大部分出現胞質分裂現象，絨氈層開始解體；花蕾長度大于11 mm時開始進入花粉粒時期，形成萌發溝；花蕾長度在13 mm 以上時，花粉粒已成熟(表1)。

2.2 關蒼術小孢子各發育階段細胞學特征

關蒼術花分為兩性花或雌花，兩性花盛開后直接能觀察看到淡紫色的聚藥雄蕊圍繞在花柱周圍，其聚藥雄蕊是5個花藥聯合而成，縱切后可看到釋放在筒內的成熟花粉粒，散粉之后聚藥雄蕊由淡紫色變為枯黃色；雌花盛開后花柱周圍無聚藥雄蕊，掰開花瓣基部露出5 個分離的箭頭狀退化雄蕊。

關蒼術于5 月末進入生殖生長，花序發育初期(圖版Ⅰ：a)，花芽分化整齊。關蒼術具有5 個花藥，花藥橫切面呈蝴蝶狀，具4 個花粉囊(圖版Ⅰ：b)，早先由一群分裂活躍的基本分生組織來構成花藥，之后4 個角隅處的表皮下分化出孢原細胞，孢原細胞通過平周分裂形成初生造孢細胞和初生壁細胞(圖版Ⅰ：c)，初生造孢細胞再經過有絲分裂形成次生造孢細胞(圖版Ⅰ：d)，之后次生造孢細胞逐漸發育成體積大、排列緊密、核大的圓形狀小孢子母細胞，(圖版Ⅰ：f)；小孢子母細胞經減數分裂的第一次分裂后形成2個子核，但其胞質不發生分裂，因此沒有二分體時期(圖版Ⅰ:i)，接著進入第二次分裂形成4 個子核(圖版Ⅰ:j)，在四個子核之間同時形成細胞壁，成四分體(圖版Ⅰ:k)，即胞質分裂屬同時型。四分體時期4 個小孢子被包裹在共同的胼胝質中，排列方式多數為正四面體(圖版Ⅰ:k)，少有十字型(圖版Ⅰ:l)或環型(圖版Ⅰ:m)，隨后胼胝質壁溶解，4個小孢子被釋放出形成游離單核小孢子(圖版Ⅰ:n)。

2.3 花藥壁的發育

在初生造孢分裂形成小孢子母細胞時，初生周緣細胞也通過分裂、分化而形成花藥壁。另外，初生壁細胞通過分裂產生排列成同心圓的細胞層(圖版Ⅰ：d)；次生壁外層發育為藥室內壁和中層，次生壁內層發育為絨氈層，剛分化的絨氈層緊貼中層細胞(圖版Ⅰ：e)，而成熟后的絨氈層逐漸遠離中層，緊緊圍繞著小孢子母細胞(圖版Ⅰ：g)。按照 Davis (1966)的劃分標準，關蒼術藥壁發育屬于雙子葉型，表皮、藥室內壁、中層、絨氈層均為一層(圖版Ⅰ：g,h)。表皮細胞呈扁平狀，細胞核較大，進行垂周分裂，花藥成熟時表皮細胞形態變得不規則(圖版Ⅰ：i)。藥室內壁緊挨著表皮內側，細胞核大，發育后期內壁細胞開始徑向延長，體積逐漸變大(圖版Ⅰ：q)，在單核花粉粒時期出現纖維加厚的現象。中層位于藥室內壁的內側，由一層細胞組成，體積小，一直處于扁平狀，孢子形成后中層完全解體(圖版Ⅰ：n)。

初期的絨氈層細胞是單核，扁平狀和其他花藥壁細胞區別不大；隨著花藥的發育，絨氈層細胞逐漸遠離中層細胞，靠近小孢子母細胞，體積變大，細胞質變濃，呈長方形。絨氈層細胞隨著減數分裂逐漸變大，到四分體時期達到最大值，這時出現2 核至多核(圖版Ⅰ：l, m)；四分體時期結束后絨氈層細胞開始解體，但溶解解體的速度在各花粉囊的表現有差異，有的剛進入四分體就開始溶解(圖版Ⅰ：j)，而有些是萌發溝形成為止絨氈層未完全溶解(圖版Ⅰ：p)，關蒼術絨氈層細胞不發生內壁和徑向壁的破壞現象，原生質體保持完好，因此屬腺質絨氈層(或分泌型)；當花粉成熟后，絨氈層細胞完全溶解掉(圖版Ⅰ：q)，花藥壁只剩表皮細胞和藥室內壁兩層。

2.4 關蒼術雄配子體發育

新產生的小孢子，細胞質比較濃、細胞核位于中央。小孢子從四分體釋放后從周圍吸取絨氈層的分泌物或其降解物，體積增大，柱狀結構上沉積孢粉素，形成花粉外壁及三條萌發溝(圖版Ⅰ：o，p)，進入單核花粉粒時期(圖版Ⅰ：q)；單核花粉粒細胞質明顯液泡化，逐漸形成中央大液泡，細胞核被擠向壁一側，進入單核靠邊期(圖版Ⅰ：r)；此后，細胞核在近壁處不均等分裂，形成不同形狀的兩個細胞，圓形狀靠近液泡的即為營養細胞，弧形狀靠近花粉粒壁的為生殖細胞(圖版Ⅰ：s)；生殖細胞漸漸伸長，呈紡錘形，再進行1次有絲分裂，形成兩個精細胞，成為3-細胞型花粉粒(圖版Ⅰ：t)。

2.5 關蒼術雌花退化雄蕊的發育異常的觀察

關蒼術雌花的雄性不育在形態上表現為花藥退化型，花藥變形，呈箭頭狀，發生扭曲或全部干癟，雌花花藥發育的不同階段觀察到多種變異類型(圖版Ⅱ)。 雌花大部分花藥在發育早期即形成畸形 (圖版Ⅱ：a)，有的花藥原始體雖然形成蝴蝶狀,但其花粉囊全部皺縮退化(圖版Ⅱ：b)，或空花粉囊、看不到花粉母細胞(圖版Ⅱ：c)，而有的花藥原始體直接發育為異常，呈一字排列(圖版Ⅱ：d)；少數花粉母細胞可進入減數分裂，但后期表現如下：第一，絨氈層與小孢子混成一團物質(圖版Ⅱ：e)；第二，到花藥發育后期，絨氈層細胞仍然不發生解體(圖版Ⅱ：f)，反而藥室內壁和表皮層卻消失(圖版Ⅱ：h)；第三，四分體時期胼胝質壁較早溶解，使小孢子相互粘連一團，形成不規則形狀(圖版Ⅱ：g)；第四，花藥壁分化時，藥室內壁和中層細胞增大，而絨氈層異常分化(圖版Ⅱ：i)，絨氈層細胞畸形緊貼中層細胞(圖版Ⅱ：j)，絨氈層增厚(圖版Ⅱ：k)、徒長，擠壓小孢子為不規則狀或被擠壓混成一團物質(圖版Ⅱ：l)。

3　討論與結論

本研究中，關蒼術小孢子發育與花蕾長度間存在相關關系，當花蕾長度在4～5 mm進入花粉母細胞時期，花藥壁已分化，在7～9 mm時處于四分體時期，大于11 mm時開始進入花粉粒時期。本研究表明，關蒼術的胚胎學特征表現為花藥發育過程共經歷孢原細胞、造孢細胞、小孢子母細胞、四分體、小孢子、成熟花粉粒等具有雙子葉植物花藥發育的典型特性。其小孢子母細胞是同時型胞質分裂，無明顯的二分體時期，四分體多數為正四面體排列。而菊科植物的成熟花粉粒多數為3-細胞花粉粒，但也存在2-細胞花粉粒，如牛膝菊(胡鐵鋒，2012)、黃頂菊(鄭書馨等，2009)等植物的成熟花粉粒是2-細胞型。通過本研究發現，關蒼術的成熟花粉粒屬于3-細胞型。

黃衡宇等(2009)、鄭書馨等(2009)和馬虹等(2000)的研究發現，多數菊科植物的藥壁發育都屬于雙子葉型。但也有例外，如黃花蒿(荊風雪等，2014)藥壁發育類型屬單子葉型，牛膝菊(胡鐵鋒，2012)藥壁發育類型屬簡化型。本研究結果發現關蒼術藥壁發育屬于雙子葉型，由外到內4層細胞組成，即表皮、藥室內壁、中層和絨氈層。Pullaiah(1984) 指出絨氈層類型是菊科具有重要系統學意義的胚胎學性狀之一。關蒼術的絨氈層類型為腺質絨氈層，無原生質體突出并移動至花藥腔的現象，其結果有別于菊科植物普遍的變形絨氈層。因此，可以認為菊科的不同植物藥壁發育類型和絨氈層類型間存在著差異。

植物雄性不育系花粉敗育的形成時期具有多樣性，單子葉植物花粉敗育多數在接近雙核期或雙核期時，雙子葉植物花粉敗育則多在四分小孢子時期或小孢子早期發育階段(Laser et al，1972)。目前，有關植物雄性不育的研究比較多，特別是有關不育花粉發育、絨氈層、孢粉素及胼胝質等研究。通過對關蒼術雌花花藥發育過程的觀察，其花藥退化原因及時期可歸結為以下幾點：(1)花藥在發育早期即形成畸形，表現為花粉囊皺縮退化或空花粉囊；(2)雌花花藥壁的發育異常，表現為藥壁細胞排列非常松散、藥室內壁和中層細胞增大或絨氈層未能正常分化；(3)花粉囊內的大部分小孢子母細胞發育止步于減數分裂前期，不能進入四分體時期；(4)完成減數分裂形成小孢子或單核花粉粒的少部分花藥，因其絨氈層細胞不能及時解體，反而增生、徒長或徑向增生充塞花粉囊室，擠壓花粉粒而不能形成有功能的花粉粒。

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Anatomical studies of hermaphrodite and female flower anther development ofActractycodesjaponica

JU Hong-Guang，QUAN Xue-Li，CUI Xin-Yue, LI Mei-Shan, PIAO Jin*

( College of Agricultural, Yanbian University, Yanji 133002, Jilin，China )

AtractylodesDC. is a special Carlininae O. Hoffm. of Cynareae in Northeast Asia. Among the only 7 varieties in the world there are 5 in our country. Anther development and the developing process of male gametophyte ofActractycodesjaponicawere studied by paraffin method, and the causes and occurrence period of the female flowers anther degradation were further studied. The results were as follows: (1)There was a relationship between microspore cytological development and bud length of actractycodes japonica. It entered into the pollen mother cells period when the bud length reached 5 mm and the anther wall had already been divided. Then it was tetrad stage when it reached 7-9 mm. And it turned into the pollen grain period when it was longer than 11mm. (2)There are five anthers in one flower and there are four pollen sacs in every anther. Meiotic division of microsporocyte developed synchronously and the arrangement of microspores in the tetrad was mainly tetrahedral and it had 3 germinal furrows. (3)The development of anther wall follows the dicotyledonous type was composed of four layers, namely epidermis, endothecium, middle layer and tapetum from outside to inside,which belonged to glandular type. (4)The female flowers anther degradation ofA.japonicawas due to four reasons which were anther early developmental malformation, medicine wall differentiation abnormality, the microspore mother cells stop in meiosis prophase and cannot enter into tetrad stage and tapetum hyperplasia. This study provides the embryological basis for the phylogeny, speciation and evolution ofA.japonica.

Actractycodesjaponica, anther development, synantherous stamen, staminodium, male gametophyte

10.11931/guihaia.gxzw201505027

2015-12-26

2016-03-20

吉林省教育廳“十二五”規劃項目(012015064)[Supported by the Education Department of Jilin Province, the “Twelfth Five Year Plan” Project(012015064)]。

具紅光(1972-)，男(朝鮮族)，吉林舒蘭人，博士，副教授，主要從事作物栽培育種研究，(E-mail)hgju@ybu.edu.cn。

樸錦，博士，副教授，主要從事中藥材栽培及遺傳育種，(E-mail)piaojin@ybu.edu.cn。

Q944，S567.21

A

1000-3142(2016)10-1259-06

具紅光，全雪麗，崔馨月，等. 關蒼術兩性花與雌花花藥的解剖學研究 [J]. 廣西植物，2016，36(10):1259-1264

JU HG，QUAN XL，CUI XY，et al. Anatomical studies of hermaphrodite and female flower anther development ofActractycodesjaponica[J]. Guihaia，2016，36(10):1259-1264