肉雞生產鏈中腸炎沙門氏菌耐藥性分析及ERIC-PCR分型

李 楠，趙思俊，王 娟，趙建梅，李玉清，黃秀梅，王君瑋，丁宜寶，劉煥奇*，曲志娜,*

（1.中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266032；2.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；3.中國獸醫藥品監察所，北京 100081）

肉雞生產鏈中腸炎沙門氏菌耐藥性分析及ERIC-PCR分型

李 楠1,2，趙思俊1，王 娟1，趙建梅1，李玉清1，黃秀梅1，王君瑋1，丁宜寶3，劉煥奇2,*，曲志娜1,*

（1.中國動物衛生與流行病學中心，山東 青島 266032；2.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；3.中國獸醫藥品監察所，北京 100081）

目的：了解肉雞生產鏈中腸炎沙門氏菌耐藥性情況以及各生產環節菌株間親緣關系，為臨床用藥及菌株追蹤溯源提供依據。方法：采用微量肉湯稀釋法對171 株腸炎沙門氏菌進行13 種抗菌藥物藥敏實驗；采用腸桿菌基因間重復共有序列-聚合酶鏈式反應（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）法對33 株不同生產環節耐藥菌株進行分子分型；采用SPSS 20.0軟件、Gel-Pro Analyer 4.0和NTSYS pc 2.1軟件進行分析。結果：171 株腸炎沙門氏菌對13 種藥物耐藥情況不同，其中對氨芐西林耐藥情況最嚴重，耐藥率高達90.06%，對恩諾沙星、氧氟沙星最為敏感，耐藥率均僅為5.26%；不同環節間耐藥性差異極顯著（P＜0.01）；多重耐藥率高達95.32%，共有26 種耐藥譜型。不同環節的33 株腸炎沙門氏菌分為4 種（Ⅰ～Ⅳ）基因型，遺傳相似性在66%～100%，Ⅰ型為優勢基因型；基因型相同的菌株耐藥譜不一定相同，反之，耐藥譜相同的菌株基因型不一定相同。結論：肉雞生產鏈條中沙門氏菌對多種抗菌藥物產生耐藥性，且耐藥譜種類繁多；沙門氏菌能夠沿著生產鏈進行水平傳播，肉雞場環節菌株基因型相對復雜，菌株基因型與耐藥表型之間無明顯相關性。

腸炎沙門氏菌；肉雞；耐藥性；腸桿菌基因間重復共有序列-聚合酶鏈式反應

沙門氏菌是重要的人畜共患病的病原體，是引起細菌性食物中毒的主要食源性病原菌[1]。目前，沙門氏菌病的預防和治療主要依靠于抗生素類藥物，但由于抗生素的廣泛使用和濫用，沙門氏菌的耐藥性和耐藥譜不斷變化，并且在長期進化過程中出現了多重耐藥現象，使其耐藥性問題成為世界性的公共衛生問題[2-3]。沙門氏菌血清型眾多，其中腸炎沙門氏菌能夠在禽類及其產品中穩定傳播，而禽類產品為人類日常生活中最常見的肉類食品類型，相關報道表明[4-7]，近年來腸炎沙門氏菌引起的食物中毒病例不斷上升，不僅影響養殖業的發展，還威脅人類健康。腸桿菌基因間重復共有序列-聚合酶鏈式反應（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）分子分型方法操作簡單，穩定性高，重復性好，被廣泛應用于菌株的基因分型和溯源等領域[8-10]。本實驗對山東省某地區肉雞生產鏈條包括種雞場、孵化場、肉雞場、屠宰場以及市場的腸炎沙門氏菌進行了藥物敏感性實驗，以了解該地區耐藥性情況以及各生產環節間耐藥性差異，通過ERIC-PCR分型技術對菌株進行分子分型，以期為臨床用藥及追蹤溯源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

2014年分離自泰安的171 株腸炎沙門氏菌（種雞場31 株、孵化場47 株、肉雞場43 株、屠宰場36株、市場14 株，菌株來自同一批次肉雞的不同生產環節）和大腸桿菌標準菌株（ATCC 25922），由中國動物衛生與流行病學中心動物產品安全監測室提供。

1.2 試劑與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯、MH（Mueller-Hinton）肉湯、細菌瓊脂粉 北京陸橋生物技術有限公司；GoTaq?Green Master Mix酶、DNA Marker DL2000 日本TaKaRa公司；分光光度計 上海精科有限責任公司；比濁儀 英國Oxoid公司；PCR儀、Gel Doc XR凝膠成像分析儀 美國Bio-Rad公司；電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 96 孔藥敏板（抗生素）

含有青霉素類（氨芐西林（ampicillin，AM）、奧格門丁（amoxicillin/clavulanic acid，A/C））、頭孢類（頭孢噻呋（ceftiofur，CEF））、氨基糖苷類（慶大霉素（gentamicin，GM）、大觀霉素（spectinomycin，SPT））、四環素類（四環素（tetracycline，TE）、多西環素（doxycycline，DOX））、氯霉素類（氟苯尼考（florfenicol，FFC））、磺胺類（磺胺異噁唑（sulfisoxazole，SF）、新諾明（sulfamethoxazole，SXT））、喹諾酮類（恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL））、粘桿菌素（polymyxin E，CLE）等13 種藥物 天津市金章科技發展有限公司。

1.4 引物

E R I C-P C R擴增引物為E R I C[11]：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 方法

1.5.1 藥物敏感性實驗

按照國際通用標準方法——微量肉湯稀釋法（minimal inhibitory concentration，MIC）測定171 株腸炎沙門氏菌對8 類13 種抗菌藥的最小抑菌濃度。首先從12 mL MH肉湯中吸取100 μL加入藥敏板的空白對照孔中，再挑取新鮮菌落制備0.5 麥氏濁度的菌液，吸取10 μL菌液加入12 mL MH肉湯中混勻，依次加入藥敏板中，每孔100 μL，以大腸桿菌作為質控菌株，于37 ℃溫箱中培養16～20 h。在質控菌株的最低抑菌濃度符合規定的前提下進行結果判定，凡細菌生長的孔內，呈彌散狀混濁或底部有沉淀，無細菌生長的孔內所含最低抑菌藥物濃度即為最低抑菌濃度。

1.5.2 ERIC-PCR分子分型

不同環節耐藥菌株（種雞場Z1～Z7、孵化場F1～F5、肉雞場R1～R8、屠宰場T1～T8、市場S1～S5）共33 株進行ERIC-PCR反應。DNA模板的制備按煮沸法進行，PCR反應體系為25 μL，反應組分：Go Taq?Green Master Mix 12.5 μL；ERIC引物1 μL；模板DNA 2 μL；無核酸水 9.5 μL。PCR反應程序[12]：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min。將擴增產物于1.3%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓100 V電泳30 min，結束后用凝膠成像系統處理圖像。

1.6 數據處理

運用SPSS 20.0軟件對實驗數據進行統計分析；采用Gel-Pro Analyzer4.0和NTSYS pc 2.1軟件對ERIC-PCR結果進行聚類分析[13]。

2 結果與分析

2.1 藥物敏感性實驗結果

2.1.1 耐藥結果

171 株腸炎沙門氏菌對13 種藥物耐藥情況不同，其中90.06%的菌株對AM產生耐藥性，為13 種抗菌藥物中最強。耐SPT的菌株比例為78.95%、SXT為50.88%、CLE為42.69%、CEF為37.43%、SF為35.67%、DOX為33.92%、TE為26.32%、A/C為23.98%、GM為11.70%、FFC為10.53%，對OFL和ENR比較敏感，耐藥率均為5.26%。

不同生產環節菌株對13 種藥物耐藥情況差異極顯著（P＜0.01），如對OFL，來自種雞場、孵化場和市場的菌株表現為全敏感，只有肉雞場和屠宰場的菌株對13 種藥物均產生耐藥性。結果見表1。

表1 腸炎沙門氏菌耐藥率與比較分析Table1 Resistance rates of Salmonella enteritidis and comparative analysis

2.1.2 多重耐藥結果

171 株腸炎沙門氏菌中多重耐藥（≥2 種）菌株高達95.32%（163/171），未出現全耐菌株，6 株菌對13 種藥物表現為敏感。以2 耐、3 耐、4 耐為主，分別以SPT-AM、 SPT-SXT-AM、CL-SPT-SXT-AM為主導譜型，共有26 種耐藥譜。

不同生產環節菌株多重耐藥表現不同，種雞場和孵化場出現了0 耐藥菌株，2 株1 耐菌來自孵化場，而3 株12 耐菌來自肉雞場和屠宰場；來自市場的菌株表現為2 耐、3 耐、4 耐；7 耐以上菌株主要來自種雞場、肉雞場、屠宰場。各生產環節分別有11、9、9、13、3 種耐藥譜，各環節主導耐藥譜不同，種雞場和屠宰場為SPT-AM，孵化場為CL-SPT-SXT-AM，肉雞場為TE-SPT-DOX-CEF-SF-SXT-AM-A/C，市場為SF-AM。結果見表2。

表2 不同生產環節耐藥譜統計Table2 Antibiograms of different production chains

2.2 ERIC-PCR分子分型結果

如圖1所示，來自不同生產環節的33 株沙門氏菌分為4 種（Ⅰ～Ⅳ）基因型，遺傳相似性在66%～100%。Ⅰ型為優勢基因型，共有23 株，包括種雞場（Z1、Z2、Z3、Z6、Z7）5 株、孵化場（F1、F2、F4、F5）4 株、肉雞場（R1、R4、R5）3 株、屠宰場（T3、T4、T5、T6、T7、T8）6 株以及市場（S1、S2、S3、S4、S5）5 株。Ⅳ型中只有2 株菌，且均來自肉雞場。

基因型相同的菌株耐藥譜不一定相同，如Ⅰ型中包含了2～11 種藥物的耐藥譜；耐藥譜相同的菌株基因型不一定相同，如F2、F3、F5耐藥譜均為CLE-SPT-SXT-AM-A/C，但F2、F5屬于Ⅰ型，F3屬于Ⅲ型。只有Ⅳ型的兩株菌基因型相同，耐藥譜也相同。

圖1 不同生產環節腸炎沙門氏菌遺傳關系聚類樹狀圖Fig.1 Phylogenetic tree of Salmonella enteritidis in different production chains

3 討 論

腸炎沙門氏菌作為一種食源性病原菌，通過食物鏈直接或間接感染人類，而抗生素藥物在畜牧生產中作為預防、治療首選藥物而被廣泛使用，耐藥性的出現使其治療和預防成為獸醫臨床、人醫臨床的難點[14-15]。本實驗中各生產環節菌株對氨芐西林的耐藥情況都比較嚴重，而關文英等[16]對河北省食品中沙門氏菌進行耐藥性分析，81 株菌對氨芐西林的耐藥率為16%，與本實驗結果差異極顯著（P＜0.01），張秀英等[17]對江西、遼寧、廣東三省養殖場的沙門氏菌進行藥敏實驗發現氨芐西林總體耐藥率為55.6%，而三省間耐藥率不同，廣東省耐藥最嚴重，遼寧省表現全敏感，朱冬梅等[18]對四川屠宰場沙門氏菌的耐藥性研究發現，分離株對氨芐西林的耐藥率高達85.90%，以上研究可以看出沙門氏菌對某一抗菌藥物的耐藥情況與地域和菌株來源有一定的關系。從各生產環節耐藥率來看，不同生產環節的菌株耐藥情況存在差異，肉雞場和屠宰場的菌株耐藥情況比較嚴重，孵化場和市場的菌株耐藥情況相對較輕，謝懋英等[19]對肉雞生產鏈中沙門氏菌的耐藥性研究也發現了不同環節采集樣品分離菌株的耐藥情況表現出差異性。本實驗多重耐藥率高達95.32%，7 耐以上菌株主要出現在種雞場、肉雞場和屠宰場，不同生產環節的主導耐藥譜型也不相同，說明養殖過程抗菌藥物使用所造成的選擇壓力對耐藥性的產生具有很大的影響；本實驗對13 種藥物共產生了26 種耐藥譜型，吳云鳳等[20]對分離自肉雞胴體的沙門氏菌進行藥敏實驗，對16 種抗菌藥物產生了26 種耐藥譜，郭云昌等[21]對分離自市場雞肉的沙門氏菌進行藥敏實驗，對30 種藥物產生了29 種耐藥譜，說明目前沙門氏菌能夠對多種抗菌藥產生耐藥性，且耐藥譜種類繁多，在生產過程中通過食物鏈的傳遞，可能最終影響人類對抗生素的敏感性。

本實驗將33 株耐藥性相關的菌株分為四大類（Ⅰ～Ⅳ），其中Ⅰ型包含了種雞場、孵化場、肉雞場、屠宰場和市場的菌株，說明生產鏈條中相同克隆株能夠沿生產鏈水平傳播，而Ⅱ型包括種雞場、屠宰場，Ⅲ型包括種雞場、孵化場、肉雞場，與Ⅰ類基因型稍微不同，Ⅳ型中菌株均來自肉雞場，而且與其他基因型差異較大，說明生產鏈條中克隆株的來源不同，侯小剛[22]對四川主要肉品生產鏈中沙門氏菌脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型，在豬肉和鴨肉生產鏈中也發現了克隆株水平傳播的現象，而雞肉生產鏈中，譜型差異較大，說明克隆株的來源較為廣泛。陳玲等[23]對南方地區食品中沙門氏菌進行了血清學鑒定和ERIC-PCR分子分型，發現14 株德爾卑沙門氏菌可分為5 種基因型別，均在E9簇之中，而13 株鼠傷寒沙門氏菌可分為5 種基因型別，卻分布在E1、E3、E4、E8之中，同一血清型的菌株基因型可能相同也可能不同，本實驗也發現同一血清型可以被分為不同基因型，而Imen等[24]利用ERIC-PCR方法對45 株沙門氏菌進行分型，腸炎沙門氏菌被分為2 種基因型，肯塔基沙門氏菌被分為4 種基因型，而基因型相同的菌株血清型也相同，所以血清型不同基因型是否一定不同有待進一步探索。在耐藥表型方面，具有相同基因型的菌株耐藥譜不一定相同，具有相同耐藥譜的菌株基因型也不一定相同，只有Ⅳ型的兩株菌基因型相同，耐藥譜也相同，說明耐藥表型與基因型沒有明顯的相關性，Marjo Cado等[25]對分離采自巴西37 個農場的66 株豬源鼠傷寒沙門氏菌進行PFGE分型，鑒定出12 個譜型，其中具有不同的耐藥表型39 株菌株分屬于同一PFGE譜型，雖然分型方法不同，但分型結果也表明基因型與耐藥表型之間沒有直接的相關性。

綜上所述，腸炎沙門氏菌在肉雞生產鏈中能夠水平傳播且耐藥性問題嚴重，但各生產環節間耐藥程度不同，參考環節間差異可以指導臨床治療、預防用藥。通過ERIC-PCR分子分型可以對腸炎沙門氏菌進行追蹤溯源，且具有簡便、高效低成本的優點，在流行病學調查方面具有重要價值。

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Resistance and ERIC-PCR Genotyping of Salmonella enteritidis in Broiler Production Chain

LI Nan1,2, ZHAO Sijun1, WANG Juan1, ZHAO Jianmei1, LI Yuqing1, HUANG Xiumei1, WANG Junwei1, DING Yibao3, LIU Huanqi2,*, QU Zhina1,*
(1. China Animal Health and Epidemiology Center, Qingdao 266032, China; 2. School of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 3. China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081, China)

Objective: To investigate the antimicrobial resistance and genetic relationship of Salmonella enteritidis in the production chain of broiler, and to provide the basis for clinical treatment and strain traceability. Methods: The susceptibility of 171 Salmonella enteritidis to 13 antimicrobial agents was analyzed by micro-dilution method. The molecular types of 33 strains from different production links associated with resistance were analyzed by ERIC-PCR. The data were analyzed by SPSS 20.0 software, Gel-Pro analyzer 4.0 and NTSYS pc 2.1 software. Results: The resistance degrees of 171 Salmonella enteritidis to 13 antimicrobial agents were different. The resistance rate of these strains to ampicillin was the highest and up to 90.06%, and the resistance rate to ofloxacin was the most sensitive and only 5.26%. The resistance rates of different links were significantly different (P < 0.01). The multidrug resistance rate was 95.32%, and there were 26 kinds of anti-biograms. Totally 33 Salmonella enteritidis were divided into 4 (I–IV) different genotypes, and the genetic similarity was 66%–100%, and type I was the dominant genotype. Anti-biograms between the same genotype were also different; conversely, the genotypes between the same antibiogram were different. Conclusion: The Salmonella enteritidis in broiler production chain could generate resistance to many antimicrobial agents, generating many kinds of antibiograms. The Salmonella enteritidis could be spread horizontally along the production chain. The genotypes of broiler farm were relatively complex. There was no significant correlation between genotype and resistant phenotype.

Salmonella enteritidis; broiler; antimicrobial resistance; enterobacterial repetitive intergenic consensuspolymerase chain reaction

10.7506/spkx1002-6630-201603023

S859.7

A

1002-6630（2016）03-0120-05

李楠, 趙思俊, 王娟, 等. 肉雞生產鏈中腸炎沙門氏菌耐藥性分析及ERIC-PCR分型[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 120-124. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603023. http://www.spkx.net.cn

LI Nan, ZHAO Sijun, WANG Juan, et al. Resistance and ERIC-PCR genotyping of Salmonella enteritidis in broiler production chain[J]. Food Science, 2016, 37(3): 120-124. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603023. http://www.spkx.net.cn

2015-03-16

“十二五”科技基礎性工作專項（2012FY111000）；農業部“引進國際先進科學技術”重點項目“獸藥監管技術引進項目”（2011-G14）

李楠（1988—），女，碩士研究生，研究方向為獸醫臨床。E-mail：linan5m@126.com

*通信作者：劉煥奇（1970—），男，教授，博士，研究方向為獸醫臨床。E-mail：huanqiliu@126.com曲志娜（1970—），女，研究員，碩士，研究方向為動物源性食品安全監測與風險評估。E-mail：641117207@qq.com