原生質體融合提高產谷氨酰胺轉氨酶菌株產量

侯孝侖，劉雅清，郭瑋婷，高紅亮，常忠義，步國建，魯 偉，解秀娟，金明飛,*

（1.華東師范大學生命科學學院，上海 200241；2.泰興市東圣食品科技有限公司，江蘇 泰興 225411）

原生質體融合提高產谷氨酰胺轉氨酶菌株產量

侯孝侖1，劉雅清1，郭瑋婷1，高紅亮1，常忠義1，步國建2，魯 偉2，解秀娟2，金明飛1,*

（1.華東師范大學生命科學學院，上海 200241；2.泰興市東圣食品科技有限公司，江蘇 泰興 225411）

目的：研究并建立產谷氨酰胺轉氨酶茂原鏈霉菌原生質體制備技術，通過原生質體融合技術篩選高產菌株。方法：以溶菌酶處理茂原鏈霉菌獲得原生質體，采用原生質體融合技術，通過96 孔板高通量初篩、試管復篩、搖瓶驗證選育高產菌株。結果：茂原鏈霉菌形成的原生質體再生出的菌落直徑比較小，而菌絲生成的菌落直徑比較大，兩種形態的菌落96 孔板發酵后酶活力有顯著性差異。不同的茂原鏈霉菌株制備原生質體，酶解程度、原生質體純度、再生率有很大的差異，再生率最高可達1 804.25%，最低僅為12.76%。原生質融合后的高產菌株，選取96 孔板初篩酶活力前3%的菌株進行試管發酵，得到高產菌株比例為32.2%，酶活力比親本高22.4%，經搖瓶驗證產酶比對照提高16.28%。結論：利用基因組重排技術，可以初步對茂原鏈霉菌進行高產菌株選育。

茂原鏈霉菌；原生質體；再生；融合；基因組重排

谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TGase）是一種巰醇酶，能夠催化蛋白質與蛋白質、蛋白質與氨基酸之間發生酰胺基轉移反應，從而使蛋白質發生交聯。這種性質能夠使其廣泛地應用于食品行業中，在烘焙面制品[1-2]、酸奶[3-4]、魚糜及其他肉制品[5-6]中改善食品中蛋白質的特性，提高保水性、強度、起泡性、乳化性，引入必需氨基酸等，有很大的應用價值，被譽為“21世紀超級黏合劑”，另外還在醫藥[7]、紡織品、保健護理等行業有很大的應用前景[8-10]。

目前商品化的TGase主要由微生物——茂原鏈霉菌[11]發酵獲得。隨著TGase商業化的不斷加深及更加廣泛的應用，對TGase產量的要求越來越高，大量學者通過培養基優化、發酵條件優化、菌種選育等方面來提高TGase的產量以滿足商業化需求，降低生產成本。由于茂原鏈霉菌本身性質，其發酵條件難以控制，通過培養基優化和發酵條件的優化已經很難使TGase的產量有大幅度的提高，一般在1～3 U/mL左右[12-13]。目前主要通過選育優良的菌株來提高TGase的產量。在茂原鏈霉菌的菌種選育上，主要有自然選育或人工誘變篩選等方法，如張瑩[14]、田沛霖[15]等已對茂原鏈霉菌菌株的選育做了大量的工作，但是隨著菌種一定的馴化，會產生飽和效應，單位產量難以持續提高，一般維持在3～5 U/mL[15-16]。隨著原生質體制備技術不斷的成熟，有大量學者通過原生質體融合技術選育微生物菌種[17-18]，2002年Zhang Yingxin等[19]將原生質體融合技術應用到弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）中，使其合成泰樂菌素的能力大大提高，是傳統方法進行20～30 輪誘變才能得到的結果，并首次提到基因組重組技術。Patnaik[20]和Wang Yuhua[21]等分別報道了采用原生質體融合技術多輪融合篩選乳酸桿菌耐酸菌株，篩選到的新菌株大大提高了乳酸桿菌合成乳酸的能力。Yu Lei等[22]將鼠李糖乳酸桿菌經過兩輪的原生質體融合，乳酸產量提高71.5%。多輪融合后玫瑰孢鏈霉菌產達托霉素能力達到野生菌株的6.5～7 倍[23]。納他霉素產生菌經過4 輪的原生質體融合后納他霉素產量比親本菌株高97.1%[24]。綠色產色鏈霉菌通過5 輪的原生質體融合篩選后，高產菌株阿維霉素產量分別比兩株出發菌株高4.85 倍和36.8 倍[25]。刺糖多胞菌和阿維鏈霉菌原生質體紫外處理后進行屬間融合后，高產菌株多殺菌素產量比野生菌株提高447.22%[26]。多輪的原生質體融合即基因組重排技術在微生物育種中顯示了極大的優勢，但目前還未有在茂原鏈霉菌中的報道。基因組重排技術是從基因上改變菌株本身的特性，原生質體在聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）的作用下發生融合，基因發生交叉互換，菌株獲得新的特性，在熱穩定、產量、發酵時間等方面都會產生變化，因此在微生物菌種改造中有很大的優勢，不僅能夠滿足食品安全等要求，又能提高所需產品的產量，備受廣大研究者的青睞。基因組重排技術中，原生質體的制備條件、再生等起著關鍵性因素，不少研究者對微生物菌種的基因組重排技術做了大量研究，尤其是對原生質體制備及再生的影響因素，早在1981年Baltz等[27]在原生質體制備再生中就對菌絲體的培養溫度、時間，及原生質體的培養溫度，固體培養基的濕度等做了研究，發現了原生質體的制備及再生在各個方面受到影響。國內外對產TGase茂原鏈霉菌基因組重排技術的研究還比較少，本實驗對茂原鏈霉菌的原生質體制備做了研究，觀察原生質體的再生情況，并在基因組重排中作了初步的探索。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養基

茂原鏈霉菌，由華東師范大學生命科學學院微生物發酵實驗室保存。

溶菌酶、PEG 2000 美國Sigma公司；其他試劑為國產分析純。

高氏一號培養基（g/L）：甘油20、魚粉蛋白胨25、酵母膏5、MgSO4?7H2O 2、K2HPO4?3H2O 2、調pH值至7.4，1×105Pa滅菌20 min。發酵培養基（g/L）：甘油20、魚粉蛋白胨25、酵母膏6、MgSO4?7H2O 2、K2HPO4?3H2O 2、調pH值至7.4，1×105Pa滅菌20 min。高滲培養基[28]：培養前預培養基中加入體積分數為20%的甘氨酸645 μL、5 mol/L的MgCl2?6H2O 50 μL。再生培養基[28]（g/L）：蔗糖103、葡萄糖10、K2SO40.25、酵母膏5、N-三（羥甲基）甲基-2-氨基乙磺酸（N-Tr is(hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid，TES）5.73、酶水解干酪素0.1、KH2PO40.05、L-脯氨酸（L-Pro） 3、MgCl2?6H2O 10.12、CaCl2?2H2O 2.22、瓊脂粉12、微量元素溶液2 mL，115 ℃高壓滅菌20 min。微量元素溶液[28]（mg/L）：ZnCl240、FeCl3?6H2O 200、CuCl2?2H2O 10、MnCl2?4H2O 10、Na2B4O7?10H2O 10、(NH4)6Mo7O24?4H2O 10。P Buffer：蔗糖103 g、K2SO40.25 g、MgCl2?6H2O 2.02 g、微量元素溶液2 mL、補足蒸餾水800 mL，115 ℃高壓滅菌20 min，使用前加入0.5%（質量分數，下同）KH2PO410 mL、3.68% CaCl2?2H2O 100 mL、5.73% pH 7.2的TES緩沖液100 mL。

1.2 儀器與設備

DK-S22電熱恒溫水浴鍋、GNP-9160隔水式恒溫培養箱 上海精宏實驗設 備有限公司；CDA-1650-2超凈工作臺 上海上凈凈化設備有限公司； DKY-Ⅱ恒溫調速回轉搖床 上海杜科自動化設備有限公司；BX-51TF相差顯微鏡 日本Olympus公司；SyergyHT多功能微孔板檢測儀 基因有限公司；721可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子培養

將甘油保存的孢子懸液稀釋涂布高氏一號培養基上，28 ℃條件下倒置培養6～8 d。

1.3.2 菌絲體預培養

以107個孢子的接種量，接種到高滲培養基中，30 ℃、200 r/min條件下培養36 h（培養前預培養基中加入體積分數20%的甘氨酸645 μL，5 mol/L的MgCl2?6H2O 50 μL）。

1.3.3 原生質體制備及再生

菌絲體培養36 h后，取菌懸液3 000 r/min離心10 min，然后棄去上清，用10.3%蔗糖溶液清洗2 次后（記作A），加入含6 mg/mL溶菌酶的P Buffer溶液，混合均勻，置于30 ℃條件下的水浴鍋中孵育，每隔15 min緩慢上下顛倒5 次，用相差顯微鏡觀察菌懸液，當出現大量原生質體，僅含少量菌絲體時，將菌液3 000 r/min離心7 min，然后棄去上清，用P Buffer重懸清洗2 次，此時仍然有部分未完全酶解的菌絲體（記作B），500 r/min離心15 min取上層溶液即得到純度較高的原生質體（D），保存于－80 ℃低溫冰箱。

原菌液（A）用10.3%的蔗糖溶液10 倍梯度稀釋。原生質體菌絲混合液（B）及原生質體（D）用P Buffer 10 倍梯度稀釋，并分別做水處理對照，分別記作C和D，取合適濃度的稀釋液于R2YE再生培養基再生；28 ℃條件下倒置培養，8～10 d后進行菌落計數。

式中：NA、NB、NC、ND、NE分別為1.3.3節中菌液A、B、C、D、E再生后的菌落總數/（CFU/mL）。

1.3.4 原生質體融合

不同茂原鏈霉菌菌株制備成純度較高的原生質體，然后取1 mL等量混合，3 000 r/min離心7 min后棄上清，用200 μL P Buffer重懸混合均勻，再加入800 μL含50% PEG2000的P Buffer高滲溶液，混合均勻后置于30 ℃恒溫水浴鍋中孵育10 min，立即用P Buffer 10 倍梯度稀釋涂布到再生培養基平板上，并同時用水處理作對照，28 ℃條件下倒置培養8～10 d。

1.3.5 發酵培養

96 孔板發酵：用牙簽刮取再生菌落，加入到96 孔板（每孔含150 μL發酵培養基）中，同時將每個菌落對應擴增，96 孔板200 r/min，30 ℃條件下培養4 d；試管發酵，擴增后的菌落產生孢子后，刮取一定量孢子加入到含有3 mL發酵培養基的試管（24 mm×110 mm）中，200 r/min、30 ℃條件下培養48 h；搖瓶發酵，取平板孢子總量的1/4接種到種子培養基中，30 ℃、200 r/min條件下培養24 h，以10%的接種量接入到發酵培養基中，200 r/min、30 ℃條件下培養。

1.3.6 酶活力測定

采用氧肟酸比色法[29]：一個酶活力單位定義為恒溫37 ℃，孵育1 min后谷氨酰胺轉氨酶催化底物苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸（benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl glycine，CBZ-Gln-Gly）生成1 μmol L-谷氨酸-γ-單羥氧肟酸所需要的酶量（U）。

1.4 數據分析

采用GraphPad Prism 5、Origin 9.0、SPSS 20進行軟件作圖和數據分析。

2 結果與分析

2.1 原生質體的制備

在溶菌酶的作用下茂原鏈霉菌失去細胞壁形成大量的原生質體，但有部分難以破壁的菌絲體未形成原生質體，從而存在于菌懸液中。在低滲溶液中小分子極易透過細胞膜進入原生質體，導致原生質體胞內滲透壓升高，致使原生質體破碎。相差顯微鏡觀察培養36 h后的菌絲及原生質體形態，如圖1a所示，茂原鏈霉菌菌絲成絲狀均勻分布，相互交聯；經過溶菌酶的處理后，菌絲體失去細胞壁變成大量的原生質體，圖1b可以觀察到產谷氨酰胺轉氨酶茂原鏈霉菌的原生質體，成球狀大小不均勻，與絲狀的菌絲體有顯著性差異。而經過水處理的原生質體由于胞內滲透壓過高，致使細胞膜破碎，圖1c中只能觀察到細胞碎片和少量未被溶菌酶破壁的菌絲體，可見原生質體制備效果良好。

圖1 茂原鏈霉菌絲和原生質體顯微鏡圖（×1 000）Fig.1 Micrograph of Streptomyces mobaraensis and protoplasts (× 1000)

2.2 原生質體的再生

將獲得的原生質體用P Buffer溶液稀釋成10 倍和1 000 倍，并以水處理1 000 倍為對照組。由圖2a可知，原生質體稀釋10 倍后涂布再生，可觀察到大量直徑較大的菌落存在，菌落直徑較小的數量遠少于圖2b中觀察到的結果，推測是由于原生質體沒有細胞壁，在再生過程中生長較慢，稀釋倍數小的菌液中（圖2a）含細胞壁的菌絲體數量較多，生長較快從而影響原生質體的再生，甚至抑制原生質體再生，致使直徑較小的菌落數量快速下降。由圖2b可知，原生質體稀釋1 000 倍后可以觀察到大量直徑較小的菌落，少量直徑較大的菌落。由圖2c可知，原生質體用水稀釋至1 000 倍后再生出的菌落的直徑均比較大。可能是原生質體不含細胞壁，在低滲透勢的溶液中，容易致使破碎，失去再生能力，經水處理后大量原生質體無法再生，而含有細胞壁的菌絲體不受滲透勢的影響可正常再生。推測直徑較小的菌落是由原生質體再生出來，直徑較大的菌落是由未被酶解的菌絲體生成的。

圖3 酶解時間對直徑較大菌落再生的影響Fig.3 Effect of enzymatic digestion time on regeneration of larger-diameter colony

以6 mg/mL的溶菌酶處理，以酶解時間為單一變量制備原生質體，考察再生后直徑較大菌落的總菌落數。如圖3所示，酶解時間在一定范圍時，直徑較大菌落的總菌落數不斷下降，80 min以后再生出的直徑較大菌落數量下降緩慢，趨于穩定，這表明酶解超過一定時間后，溶菌酶的處理不再使原生質體數量增加。同時用相差顯微鏡觀察不同酶解時間的菌懸液，發現隨著酶解時間延長，原生質體數量不斷增加，菌絲體數量不斷減少，當酶解90 min后，原生質體數量變化不明顯。實驗確定了茂原鏈霉菌原生質體制備的酶解時間在90～120 min，并選擇酶解100 min制備原生質體進行融合。

表1 不同來源茂原鏈霉菌原生質體制備及再生Table1 Protoplasts formation and regeneration of different mutant strains of Streptomyces mobaraensis

同一株茂原鏈霉菌紫外化學誘變后，從菌株庫中選取酶活性有差異的3 株菌，以相同的條件制備原生質體。由表1可知，3 株不同的菌株之間有很大的差異。菌株A很容易酶解，而菌株B和C酶解程度較A低，推測誘變后不同的細胞壁成分有所差異，影響了溶菌酶對細胞壁的酶解過程。制備得到的原生質體純度也是菌株A最高，菌株B次之，菌株C最差。得到的原生質體再生，其再生率也有所不同，其中以菌株A最好，高達1 804.25%，菌株B再生率達到178.84%，而菌株C再生率相當差，僅僅只有12.76%。推測是由于在預培養的過程中一些菌株的菌絲易形成孢子，溶菌酶處理后，每個孢子都能形成一個原生質體，便可觀察到原生質體的再生率達到1 804.25%，同時也有一些菌株的細胞壁成分可能有所不同，致使溶菌酶難以破壁，難以制備成原生質體。不同來源菌株原生質體制備及再生的差異極大，這對基因組重排技術中原生質體的制備增加了難度。

2.3 不同直徑大小的再生菌落產酶比較

圖4 兩種不同直徑大小的菌落產酶比較Fig.4 Comparison of TGase activity between two different diameter colonies

由圖4可知，直徑較大的菌落平均酶活力為2.21 U/mL，直徑較小菌落的平均酶活力為1.81 U/mL。運用對兩組數據進行獨立t檢驗，得到P＝0.006＜0.05，表明兩組酶活力有差異顯著。表明菌落直徑大小對酶活力有影響，即茂原鏈霉菌經過溶菌酶處理后對其產酶有顯著影響。

2.4 原生質體融合在茂原鏈霉菌育種的初探

圖5 PEG 2000處理后的原生質體（×1 000）Fig.5 Protoplasts after PEG 2000 treatment (× 1000)

不同菌株的原生質體等量混合，用PEG 2000處理促進原生質體融合，在相差顯微鏡下觀察，結果見圖5。如圖5a所示，原生質體在PEG 2000的作用下匯集在一起兩兩聚集，或者大量聚集在一起成團。圖5b中可以觀察到原生質體聚集在一起后，細胞膜發生融合，形成比正常原生質體大的細胞，原生質體發生融合后，發生基因組交叉互換，形成具有新特性的菌株，能夠增加菌株的遺傳多態性。

同一菌株進行紫外化學誘變后，從菌種庫中選取4 株酶活力和菌落形態有差異的菌株（親本1、親本2、親本3、親本4）進行原生質體融合，再生后選取直徑較小的再生菌落進行96 孔板發酵，30 ℃、200 r/min條件下培養 4 d后測酶活力，選取其中酶活力最高的3%進行試管復篩（圖6），可以看到其中有32.2%的菌株的酶活力高于菌株親本2，其中菌株58比對照中酶活力最高的親本2提高了22.4%，比親本3提高了249.48%。對高產菌株與親菌株的酶活力進行t檢驗，P值為0.037＜0.05，這說明高產菌株與親本的酶活力有顯著性差異。

圖6 96 孔板初篩高產酶活力菌株試管發酵Fig.6 TGase activities of high-yield strains from 96-well plate screening in tube fermenta tion

在試管發酵中通過接種環接種，接種量的控制精確度低于搖瓶發酵中接種量控制，試管發酵酶活力存在一定偏差，從而運用搖瓶發酵驗證高產菌株。試管發酵中共含有19 株菌，酶活力高于產酶最高的親本2，選取菌株58與親本2進行搖瓶發酵驗證，如圖7所示，兩株菌在36 h時酶活力達到最高，菌株58為6.1 U/mL，比對照親本2提高了16.28%，表明基因組重排技術能夠有效地提高茂原鏈霉菌的谷氨酰胺轉氨酶產量，篩選更加優良的菌株，為工廠生產降低了成本。

圖7 高產菌株和親本菌株發酵曲線Fig.7 Fermentation curves of high-yield strain and parental strain

3 結 論

通過本研究，可以看到在產谷氨酰胺轉氨酶茂原鏈霉菌的原生質體制備中，溶菌酶處理后，原生質體不含細胞壁，生長緩慢，再生出的菌落直徑較小。而菌絲體再生后的菌落直徑較大。兩種不同直徑大小的菌落進行96 孔板發酵培養，發現它們的平均酶活力不同，經t檢驗得到P＝0.006＜0.05，說明兩種直徑大小的菌落產酶差異顯著。在基因組重排菌株選育中，可以通過直徑大小的篩選，減小親本對篩選的影響，提高高通量篩選效率。

在酶解時間實驗中，確定茂原鏈霉菌溶菌酶處理時間為90～120 min，并選擇100 min作為原生質體制備的酶解時間。以相同的制備條件處理不同的3 株菌，發現酶解程度均可達到80%以上，原生質體純度差異明顯，在60%～100%之間，不同菌株原生質體的再生率差異極大，最高可達1 804.25%，最低僅為12.76%。基因組重排的過程中，需要不同來源的茂原鏈霉菌作為親本，增加遺傳的多樣性，由于原生質體制備條件及再生情況不同，基因組重排便增加了難度。

在原生質體融合中， 選取4 株誘變后的茂原鏈霉菌制備原生質體，進行谷氨酰胺轉氨酶高產菌株的選育。96 孔板高通量篩選后，選擇前3%的菌株進行試管發酵，在試管發酵中有32.2%的菌株高于對照組中產酶最高的親本2，對獲得高產菌株與親本菌株進行t檢驗，具有十分顯著的差異。選取菌株58和親本2進行搖瓶發酵驗證，發現這兩株菌同在36 h有最高酶活力，高產菌株58比親本2提高16.28%。表明了原生質體融合技術在產谷氨酰胺轉氨酶茂原鏈霉菌菌種改造中具有明顯優勢，可以運用多輪原生質體融合即基因組重排技術來改造茂原鏈霉菌，篩選高產谷氨酰胺轉氨酶的菌株。但不同的菌株原生質體制備及再生條件要求不同，在茂原鏈霉菌的基因組重排技術中仍有很多的問題需要解決。

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Strain Improvement by Protoplast Fusion for Enhanced Transglutaminase Production

HOU Xiaolun1, LIU Yaqing1, GUO Weiting1, GAO Hongliang1, CHANG Zhongyi1, BU Guojian2, LU Wei2, XIE Xiujuan2, JIN Mingfei1,*
(1. School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China; 2. Taixing Dongsheng Food Co. Ltd., Taixing 225411, China)

Objective: To obtain a high-yield transglutaminase (TGase)-producing str ain through protoplast fusion between mutant strains of Streptomyces mobaraensis. Methods: Protoplasts were obtained by lysozyme digestion, and after protoplast fusion, the selected fusants were screened for TGase production by primary high-throughput screening in 96-well plates and fermentation in test tubes and shake flasks, respectively. Results: The coloni es regenerated from prot oplasts had a smaller diameter, and the diameter of colonies formed by mycelia was larger. The two different colonies had a significant difference in TGase activity during fermentation in 96-well microplates. Different mutant strains of Streptomyces mobaraensis were very different with respect to TGase activity, protoplast purity and protoplast regeneration rate. The maximum protoplast regeneration rate was 1 804.25%, and the minimum was only 12.76%. After genome shuffling, we selected the top 3% of f usant strains with high TGase activity through high-throughput screening in 96-well plates to carry out fermentation i n test tubes. Of these strains, 32.2% were high-yield strains having a 22.4% higher TGase activity than the parental strain. The production was in creased by 16.28% in shake flask fermentation. Conclusion: Genome shuffling can be used to improve Streptomyces mobaraensis for enhanced TGase production.

Streptomyces mobaraensis; protoplasts; regeneration; fusion; genome shuffling

10.7506/spkx1002-6630-201603027

Q939.97

A

1002-6630（2016）03-0145-06

侯孝侖, 劉雅清, 郭瑋婷, 等. 原生質體融合提高產谷氨酰胺轉氨酶菌株產量[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 145-150. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603027. http://www.spkx.net.cn

HOU Xiaolun, LIU Yaqing, GUO Weiting, et al. Strain improvement by protoplast fusion for enhanced transglutaminase production[J]. Food Science, 2016, 37(3): 145-150. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603027. http://www.spkx.net.cn

2015-03-19

中央高校基本科研業務費專項資金項目（78210203）

侯孝侖（1989—），男，碩士研究生，研究方向為應用微生物。E-mail：houxiaolun@126.com

*通信作者：金明飛（1979—），男，講師，博士，研究方向為應用微生物。E-mail：mfjin@bio.ecnu.edu.cn