原生質(zhì)體融合提高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶菌株產(chǎn)量

侯孝侖，劉雅清，郭瑋婷，高紅亮，常忠義，步國建，魯 偉，解秀娟，金明飛,*

（1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241；2.泰興市東圣食品科技有限公司，江蘇 泰興 225411）

原生質(zhì)體融合提高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶菌株產(chǎn)量

侯孝侖1，劉雅清1，郭瑋婷1，高紅亮1，常忠義1，步國建2，魯 偉2，解秀娟2，金明飛1,*

（1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241；2.泰興市東圣食品科技有限公司，江蘇 泰興 225411）

目的：研究并建立產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶茂原鏈霉菌原生質(zhì)體制備技術(shù)，通過原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選高產(chǎn)菌株。方法：以溶菌酶處理茂原鏈霉菌獲得原生質(zhì)體，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，通過96 孔板高通量初篩、試管復(fù)篩、搖瓶驗證選育高產(chǎn)菌株。結(jié)果：茂原鏈霉菌形成的原生質(zhì)體再生出的菌落直徑比較小，而菌絲生成的菌落直徑比較大，兩種形態(tài)的菌落96 孔板發(fā)酵后酶活力有顯著性差異。不同的茂原鏈霉菌株制備原生質(zhì)體，酶解程度、原生質(zhì)體純度、再生率有很大的差異，再生率最高可達1 804.25%，最低僅為12.76%。原生質(zhì)融合后的高產(chǎn)菌株，選取96 孔板初篩酶活力前3%的菌株進行試管發(fā)酵，得到高產(chǎn)菌株比例為32.2%，酶活力比親本高22.4%，經(jīng)搖瓶驗證產(chǎn)酶比對照提高16.28%。結(jié)論：利用基因組重排技術(shù)，可以初步對茂原鏈霉菌進行高產(chǎn)菌株選育。

茂原鏈霉菌；原生質(zhì)體；再生；融合；基因組重排

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TGase）是一種巰醇酶，能夠催化蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與氨基酸之間發(fā)生酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。這種性質(zhì)能夠使其廣泛地應(yīng)用于食品行業(yè)中，在烘焙面制品[1-2]、酸奶[3-4]、魚糜及其他肉制品[5-6]中改善食品中蛋白質(zhì)的特性，提高保水性、強度、起泡性、乳化性，引入必需氨基酸等，有很大的應(yīng)用價值，被譽為“21世紀超級黏合劑”，另外還在醫(yī)藥[7]、紡織品、保健護理等行業(yè)有很大的應(yīng)用前景[8-10]。

目前商品化的TGase主要由微生物——茂原鏈霉菌[11]發(fā)酵獲得。隨著TGase商業(yè)化的不斷加深及更加廣泛的應(yīng)用，對TGase產(chǎn)量的要求越來越高，大量學(xué)者通過培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化、菌種選育等方面來提高TGase的產(chǎn)量以滿足商業(yè)化需求，降低生產(chǎn)成本。由于茂原鏈霉菌本身性質(zhì)，其發(fā)酵條件難以控制，通過培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵條件的優(yōu)化已經(jīng)很難使TGase的產(chǎn)量有大幅度的提高，一般在1～3 U/mL左右[12-13]。目前主要通過選育優(yōu)良的菌株來提高TGase的產(chǎn)量。在茂原鏈霉菌的菌種選育上，主要有自然選育或人工誘變篩選等方法，如張瑩[14]、田沛霖[15]等已對茂原鏈霉菌菌株的選育做了大量的工作，但是隨著菌種一定的馴化，會產(chǎn)生飽和效應(yīng)，單位產(chǎn)量難以持續(xù)提高，一般維持在3～5 U/mL[15-16]。隨著原生質(zhì)體制備技術(shù)不斷的成熟，有大量學(xué)者通過原生質(zhì)體融合技術(shù)選育微生物菌種[17-18]，2002年Zhang Yingxin等[19]將原生質(zhì)體融合技術(shù)應(yīng)用到弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）中，使其合成泰樂菌素的能力大大提高，是傳統(tǒng)方法進行20～30 輪誘變才能得到的結(jié)果，并首次提到基因組重組技術(shù)。Patnaik[20]和Wang Yuhua[21]等分別報道了采用原生質(zhì)體融合技術(shù)多輪融合篩選乳酸桿菌耐酸菌株，篩選到的新菌株大大提高了乳酸桿菌合成乳酸的能力。Yu Lei等[22]將鼠李糖乳酸桿菌經(jīng)過兩輪的原生質(zhì)體融合，乳酸產(chǎn)量提高71.5%。多輪融合后玫瑰孢鏈霉菌產(chǎn)達托霉素能力達到野生菌株的6.5～7 倍[23]。納他霉素產(chǎn)生菌經(jīng)過4 輪的原生質(zhì)體融合后納他霉素產(chǎn)量比親本菌株高97.1%[24]。綠色產(chǎn)色鏈霉菌通過5 輪的原生質(zhì)體融合篩選后，高產(chǎn)菌株阿維霉素產(chǎn)量分別比兩株出發(fā)菌株高4.85 倍和36.8 倍[25]。刺糖多胞菌和阿維鏈霉菌原生質(zhì)體紫外處理后進行屬間融合后，高產(chǎn)菌株多殺菌素產(chǎn)量比野生菌株提高447.22%[26]。多輪的原生質(zhì)體融合即基因組重排技術(shù)在微生物育種中顯示了極大的優(yōu)勢，但目前還未有在茂原鏈霉菌中的報道。基因組重排技術(shù)是從基因上改變菌株本身的特性，原生質(zhì)體在聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）的作用下發(fā)生融合，基因發(fā)生交叉互換，菌株獲得新的特性，在熱穩(wěn)定、產(chǎn)量、發(fā)酵時間等方面都會產(chǎn)生變化，因此在微生物菌種改造中有很大的優(yōu)勢，不僅能夠滿足食品安全等要求，又能提高所需產(chǎn)品的產(chǎn)量，備受廣大研究者的青睞。基因組重排技術(shù)中，原生質(zhì)體的制備條件、再生等起著關(guān)鍵性因素，不少研究者對微生物菌種的基因組重排技術(shù)做了大量研究，尤其是對原生質(zhì)體制備及再生的影響因素，早在1981年Baltz等[27]在原生質(zhì)體制備再生中就對菌絲體的培養(yǎng)溫度、時間，及原生質(zhì)體的培養(yǎng)溫度，固體培養(yǎng)基的濕度等做了研究，發(fā)現(xiàn)了原生質(zhì)體的制備及再生在各個方面受到影響。國內(nèi)外對產(chǎn)TGase茂原鏈霉菌基因組重排技術(shù)的研究還比較少，本實驗對茂原鏈霉菌的原生質(zhì)體制備做了研究，觀察原生質(zhì)體的再生情況，并在基因組重排中作了初步的探索。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

茂原鏈霉菌，由華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物發(fā)酵實驗室保存。

溶菌酶、PEG 2000 美國Sigma公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

高氏一號培養(yǎng)基（g/L）：甘油20、魚粉蛋白胨25、酵母膏5、MgSO4?7H2O 2、K2HPO4?3H2O 2、調(diào)pH值至7.4，1×105Pa滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘油20、魚粉蛋白胨25、酵母膏6、MgSO4?7H2O 2、K2HPO4?3H2O 2、調(diào)pH值至7.4，1×105Pa滅菌20 min。高滲培養(yǎng)基[28]：培養(yǎng)前預(yù)培養(yǎng)基中加入體積分數(shù)為20%的甘氨酸645 μL、5 mol/L的MgCl2?6H2O 50 μL。再生培養(yǎng)基[28]（g/L）：蔗糖103、葡萄糖10、K2SO40.25、酵母膏5、N-三（羥甲基）甲基-2-氨基乙磺酸（N-Tr is(hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonic acid，TES）5.73、酶水解干酪素0.1、KH2PO40.05、L-脯氨酸（L-Pro） 3、MgCl2?6H2O 10.12、CaCl2?2H2O 2.22、瓊脂粉12、微量元素溶液2 mL，115 ℃高壓滅菌20 min。微量元素溶液[28]（mg/L）：ZnCl240、FeCl3?6H2O 200、CuCl2?2H2O 10、MnCl2?4H2O 10、Na2B4O7?10H2O 10、(NH4)6Mo7O24?4H2O 10。P Buffer：蔗糖103 g、K2SO40.25 g、MgCl2?6H2O 2.02 g、微量元素溶液2 mL、補足蒸餾水800 mL，115 ℃高壓滅菌20 min，使用前加入0.5%（質(zhì)量分數(shù)，下同）KH2PO410 mL、3.68% CaCl2?2H2O 100 mL、5.73% pH 7.2的TES緩沖液100 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S22電熱恒溫水浴鍋、GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè) 備有限公司；CDA-1650-2超凈工作臺 上海上凈凈化設(shè)備有限公司； DKY-Ⅱ恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)搖床 上海杜科自動化設(shè)備有限公司；BX-51TF相差顯微鏡 日本Olympus公司；SyergyHT多功能微孔板檢測儀 基因有限公司；721可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子培養(yǎng)

將甘油保存的孢子懸液稀釋涂布高氏一號培養(yǎng)基上，28 ℃條件下倒置培養(yǎng)6～8 d。

1.3.2 菌絲體預(yù)培養(yǎng)

以107個孢子的接種量，接種到高滲培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)36 h（培養(yǎng)前預(yù)培養(yǎng)基中加入體積分數(shù)20%的甘氨酸645 μL，5 mol/L的MgCl2?6H2O 50 μL）。

1.3.3 原生質(zhì)體制備及再生

菌絲體培養(yǎng)36 h后，取菌懸液3 000 r/min離心10 min，然后棄去上清，用10.3%蔗糖溶液清洗2 次后（記作A），加入含6 mg/mL溶菌酶的P Buffer溶液，混合均勻，置于30 ℃條件下的水浴鍋中孵育，每隔15 min緩慢上下顛倒5 次，用相差顯微鏡觀察菌懸液，當出現(xiàn)大量原生質(zhì)體，僅含少量菌絲體時，將菌液3 000 r/min離心7 min，然后棄去上清，用P Buffer重懸清洗2 次，此時仍然有部分未完全酶解的菌絲體（記作B），500 r/min離心15 min取上層溶液即得到純度較高的原生質(zhì)體（D），保存于－80 ℃低溫冰箱。

原菌液（A）用10.3%的蔗糖溶液10 倍梯度稀釋。原生質(zhì)體菌絲混合液（B）及原生質(zhì)體（D）用P Buffer 10 倍梯度稀釋，并分別做水處理對照，分別記作C和D，取合適濃度的稀釋液于R2YE再生培養(yǎng)基再生；28 ℃條件下倒置培養(yǎng)，8～10 d后進行菌落計數(shù)。

式中：NA、NB、NC、ND、NE分別為1.3.3節(jié)中菌液A、B、C、D、E再生后的菌落總數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.4 原生質(zhì)體融合

不同茂原鏈霉菌菌株制備成純度較高的原生質(zhì)體，然后取1 mL等量混合，3 000 r/min離心7 min后棄上清，用200 μL P Buffer重懸混合均勻，再加入800 μL含50% PEG2000的P Buffer高滲溶液，混合均勻后置于30 ℃恒溫水浴鍋中孵育10 min，立即用P Buffer 10 倍梯度稀釋涂布到再生培養(yǎng)基平板上，并同時用水處理作對照，28 ℃條件下倒置培養(yǎng)8～10 d。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)

96 孔板發(fā)酵：用牙簽刮取再生菌落，加入到96 孔板（每孔含150 μL發(fā)酵培養(yǎng)基）中，同時將每個菌落對應(yīng)擴增，96 孔板200 r/min，30 ℃條件下培養(yǎng)4 d；試管發(fā)酵，擴增后的菌落產(chǎn)生孢子后，刮取一定量孢子加入到含有3 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的試管（24 mm×110 mm）中，200 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)48 h；搖瓶發(fā)酵，取平板孢子總量的1/4接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，以10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，200 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)。

1.3.6 酶活力測定

采用氧肟酸比色法[29]：一個酶活力單位定義為恒溫37 ℃，孵育1 min后谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化底物苯甲基氧化碳酰-L-谷氨酰胺甘氨酸（benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl glycine，CBZ-Gln-Gly）生成1 μmol L-谷氨酸-γ-單羥氧肟酸所需要的酶量（U）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 5、Origin 9.0、SPSS 20進行軟件作圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備

在溶菌酶的作用下茂原鏈霉菌失去細胞壁形成大量的原生質(zhì)體，但有部分難以破壁的菌絲體未形成原生質(zhì)體，從而存在于菌懸液中。在低滲溶液中小分子極易透過細胞膜進入原生質(zhì)體，導(dǎo)致原生質(zhì)體胞內(nèi)滲透壓升高，致使原生質(zhì)體破碎。相差顯微鏡觀察培養(yǎng)36 h后的菌絲及原生質(zhì)體形態(tài)，如圖1a所示，茂原鏈霉菌菌絲成絲狀均勻分布，相互交聯(lián)；經(jīng)過溶菌酶的處理后，菌絲體失去細胞壁變成大量的原生質(zhì)體，圖1b可以觀察到產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶茂原鏈霉菌的原生質(zhì)體，成球狀大小不均勻，與絲狀的菌絲體有顯著性差異。而經(jīng)過水處理的原生質(zhì)體由于胞內(nèi)滲透壓過高，致使細胞膜破碎，圖1c中只能觀察到細胞碎片和少量未被溶菌酶破壁的菌絲體，可見原生質(zhì)體制備效果良好。

圖1 茂原鏈霉菌絲和原生質(zhì)體顯微鏡圖（×1 000）Fig.1 Micrograph of Streptomyces mobaraensis and protoplasts (× 1000)

2.2 原生質(zhì)體的再生

將獲得的原生質(zhì)體用P Buffer溶液稀釋成10 倍和1 000 倍，并以水處理1 000 倍為對照組。由圖2a可知，原生質(zhì)體稀釋10 倍后涂布再生，可觀察到大量直徑較大的菌落存在，菌落直徑較小的數(shù)量遠少于圖2b中觀察到的結(jié)果，推測是由于原生質(zhì)體沒有細胞壁，在再生過程中生長較慢，稀釋倍數(shù)小的菌液中（圖2a）含細胞壁的菌絲體數(shù)量較多，生長較快從而影響原生質(zhì)體的再生，甚至抑制原生質(zhì)體再生，致使直徑較小的菌落數(shù)量快速下降。由圖2b可知，原生質(zhì)體稀釋1 000 倍后可以觀察到大量直徑較小的菌落，少量直徑較大的菌落。由圖2c可知，原生質(zhì)體用水稀釋至1 000 倍后再生出的菌落的直徑均比較大。可能是原生質(zhì)體不含細胞壁，在低滲透勢的溶液中，容易致使破碎，失去再生能力，經(jīng)水處理后大量原生質(zhì)體無法再生，而含有細胞壁的菌絲體不受滲透勢的影響可正常再生。推測直徑較小的菌落是由原生質(zhì)體再生出來，直徑較大的菌落是由未被酶解的菌絲體生成的。

圖3 酶解時間對直徑較大菌落再生的影響Fig.3 Effect of enzymatic digestion time on regeneration of larger-diameter colony

以6 mg/mL的溶菌酶處理，以酶解時間為單一變量制備原生質(zhì)體，考察再生后直徑較大菌落的總菌落數(shù)。如圖3所示，酶解時間在一定范圍時，直徑較大菌落的總菌落數(shù)不斷下降，80 min以后再生出的直徑較大菌落數(shù)量下降緩慢，趨于穩(wěn)定，這表明酶解超過一定時間后，溶菌酶的處理不再使原生質(zhì)體數(shù)量增加。同時用相差顯微鏡觀察不同酶解時間的菌懸液，發(fā)現(xiàn)隨著酶解時間延長，原生質(zhì)體數(shù)量不斷增加，菌絲體數(shù)量不斷減少，當酶解90 min后，原生質(zhì)體數(shù)量變化不明顯。實驗確定了茂原鏈霉菌原生質(zhì)體制備的酶解時間在90～120 min，并選擇酶解100 min制備原生質(zhì)體進行融合。

表1 不同來源茂原鏈霉菌原生質(zhì)體制備及再生Table1 Protoplasts formation and regeneration of different mutant strains of Streptomyces mobaraensis

同一株茂原鏈霉菌紫外化學(xué)誘變后，從菌株庫中選取酶活性有差異的3 株菌，以相同的條件制備原生質(zhì)體。由表1可知，3 株不同的菌株之間有很大的差異。菌株A很容易酶解，而菌株B和C酶解程度較A低，推測誘變后不同的細胞壁成分有所差異，影響了溶菌酶對細胞壁的酶解過程。制備得到的原生質(zhì)體純度也是菌株A最高，菌株B次之，菌株C最差。得到的原生質(zhì)體再生，其再生率也有所不同，其中以菌株A最好，高達1 804.25%，菌株B再生率達到178.84%，而菌株C再生率相當差，僅僅只有12.76%。推測是由于在預(yù)培養(yǎng)的過程中一些菌株的菌絲易形成孢子，溶菌酶處理后，每個孢子都能形成一個原生質(zhì)體，便可觀察到原生質(zhì)體的再生率達到1 804.25%，同時也有一些菌株的細胞壁成分可能有所不同，致使溶菌酶難以破壁，難以制備成原生質(zhì)體。不同來源菌株原生質(zhì)體制備及再生的差異極大，這對基因組重排技術(shù)中原生質(zhì)體的制備增加了難度。

2.3 不同直徑大小的再生菌落產(chǎn)酶比較

圖4 兩種不同直徑大小的菌落產(chǎn)酶比較Fig.4 Comparison of TGase activity between two different diameter colonies

由圖4可知，直徑較大的菌落平均酶活力為2.21 U/mL，直徑較小菌落的平均酶活力為1.81 U/mL。運用對兩組數(shù)據(jù)進行獨立t檢驗，得到P＝0.006＜0.05，表明兩組酶活力有差異顯著。表明菌落直徑大小對酶活力有影響，即茂原鏈霉菌經(jīng)過溶菌酶處理后對其產(chǎn)酶有顯著影響。

2.4 原生質(zhì)體融合在茂原鏈霉菌育種的初探

圖5 PEG 2000處理后的原生質(zhì)體（×1 000）Fig.5 Protoplasts after PEG 2000 treatment (× 1000)

不同菌株的原生質(zhì)體等量混合，用PEG 2000處理促進原生質(zhì)體融合，在相差顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖5。如圖5a所示，原生質(zhì)體在PEG 2000的作用下匯集在一起兩兩聚集，或者大量聚集在一起成團。圖5b中可以觀察到原生質(zhì)體聚集在一起后，細胞膜發(fā)生融合，形成比正常原生質(zhì)體大的細胞，原生質(zhì)體發(fā)生融合后，發(fā)生基因組交叉互換，形成具有新特性的菌株，能夠增加菌株的遺傳多態(tài)性。

同一菌株進行紫外化學(xué)誘變后，從菌種庫中選取4 株酶活力和菌落形態(tài)有差異的菌株（親本1、親本2、親本3、親本4）進行原生質(zhì)體融合，再生后選取直徑較小的再生菌落進行96 孔板發(fā)酵，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng) 4 d后測酶活力，選取其中酶活力最高的3%進行試管復(fù)篩（圖6），可以看到其中有32.2%的菌株的酶活力高于菌株親本2，其中菌株58比對照中酶活力最高的親本2提高了22.4%，比親本3提高了249.48%。對高產(chǎn)菌株與親菌株的酶活力進行t檢驗，P值為0.037＜0.05，這說明高產(chǎn)菌株與親本的酶活力有顯著性差異。

圖6 96 孔板初篩高產(chǎn)酶活力菌株試管發(fā)酵Fig.6 TGase activities of high-yield strains from 96-well plate screening in tube fermenta tion

在試管發(fā)酵中通過接種環(huán)接種，接種量的控制精確度低于搖瓶發(fā)酵中接種量控制，試管發(fā)酵酶活力存在一定偏差，從而運用搖瓶發(fā)酵驗證高產(chǎn)菌株。試管發(fā)酵中共含有19 株菌，酶活力高于產(chǎn)酶最高的親本2，選取菌株58與親本2進行搖瓶發(fā)酵驗證，如圖7所示，兩株菌在36 h時酶活力達到最高，菌株58為6.1 U/mL，比對照親本2提高了16.28%，表明基因組重排技術(shù)能夠有效地提高茂原鏈霉菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量，篩選更加優(yōu)良的菌株，為工廠生產(chǎn)降低了成本。

圖7 高產(chǎn)菌株和親本菌株發(fā)酵曲線Fig.7 Fermentation curves of high-yield strain and parental strain

3 結(jié) 論

通過本研究，可以看到在產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶茂原鏈霉菌的原生質(zhì)體制備中，溶菌酶處理后，原生質(zhì)體不含細胞壁，生長緩慢，再生出的菌落直徑較小。而菌絲體再生后的菌落直徑較大。兩種不同直徑大小的菌落進行96 孔板發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)它們的平均酶活力不同，經(jīng)t檢驗得到P＝0.006＜0.05，說明兩種直徑大小的菌落產(chǎn)酶差異顯著。在基因組重排菌株選育中，可以通過直徑大小的篩選，減小親本對篩選的影響，提高高通量篩選效率。

在酶解時間實驗中，確定茂原鏈霉菌溶菌酶處理時間為90～120 min，并選擇100 min作為原生質(zhì)體制備的酶解時間。以相同的制備條件處理不同的3 株菌，發(fā)現(xiàn)酶解程度均可達到80%以上，原生質(zhì)體純度差異明顯，在60%～100%之間，不同菌株原生質(zhì)體的再生率差異極大，最高可達1 804.25%，最低僅為12.76%。基因組重排的過程中，需要不同來源的茂原鏈霉菌作為親本，增加遺傳的多樣性，由于原生質(zhì)體制備條件及再生情況不同，基因組重排便增加了難度。

在原生質(zhì)體融合中， 選取4 株誘變后的茂原鏈霉菌制備原生質(zhì)體，進行谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株的選育。96 孔板高通量篩選后，選擇前3%的菌株進行試管發(fā)酵，在試管發(fā)酵中有32.2%的菌株高于對照組中產(chǎn)酶最高的親本2，對獲得高產(chǎn)菌株與親本菌株進行t檢驗，具有十分顯著的差異。選取菌株58和親本2進行搖瓶發(fā)酵驗證，發(fā)現(xiàn)這兩株菌同在36 h有最高酶活力，高產(chǎn)菌株58比親本2提高16.28%。表明了原生質(zhì)體融合技術(shù)在產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶茂原鏈霉菌菌種改造中具有明顯優(yōu)勢，可以運用多輪原生質(zhì)體融合即基因組重排技術(shù)來改造茂原鏈霉菌，篩選高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的菌株。但不同的菌株原生質(zhì)體制備及再生條件要求不同，在茂原鏈霉菌的基因組重排技術(shù)中仍有很多的問題需要解決。

[1] 李鑫, 趙燕, 李建科. 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對小麥粉品質(zhì)的影響[J].食品科學(xué), 2013, 34(1): 135-139.

[2] ONYANGO C, MUTUNGI C, UNBEHEND G, et al. Rheological and baking characteristics of batter and bread prepared from pregelatinised cassava starch and sorghum and modifi ed using microbial transglutaminase[J]. Journal of Food Engineering, 2010, 97(4): 465-470. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2009.11.002.

[3] JAROS D, JACOB M, OTTO C, et al. Excessive cross-linking of caseins by microbial transglutaminase and its impact on physical properties of acidifi ed milk gels[J]. International Dairy Journal, 2010, 20(5): 321-327. DOI:10.1016/j.idairyj.2009.11.021.

[4] GUYOT C, KULOZIK U. Effect of transglutaminase-treated milk powders on the properties of skim milk yoghurt[J]. International Dairy Journal, 2011, 21(9): 628-635. DOI:10.1016/j.idairyj.2010.10.010.

[5] BASARAN P, BASARAN-AKGUL N, RASCO B A. Dielectric properties of chicken and fish muscle treated with microbial transglutaminase[J]. Food Chemistry, 2010, 120(2): 361-370. DOI:10.1016/j. foodchem.2009.09.050.

[6] MORENO H M, CARBALLO J, BORDERIAS A J. Use of microbial transglutaminase and sodium alginate in the preparation of restructured fi sh models using cold gelation: effect of frozen storage[J]. Innova tive Food Science & Emerging Technologies, 2010, 11(2): 394-400. DOI:10.1016/j.ifset.2009.12.002.

[7] 謝霞, 田江克, 于騰飛, 等. 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶交聯(lián)的原位明膠止血劑體外凝血實驗的研究[J]. 明膠科學(xué)與技術(shù), 2012, 32(1): 25-27. DOI:10.3969/j.issn.1004-9657.2012.01.004.

[8] MOTOKI M, SEGURO K. Transglutaminase and its use for food processing[J]. Trends in Food Science & Technology, 1998, 9(5): 204-210. DOI:10.1016/S0924-2244(98)00038-7.

[9] KASHIWAGI T, YOKOYAMA K, ISHIKAWA K, et al. Crystal structure of microbial transglutaminase from Streptoverticillium mobaraense[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(46): 44252-44260. DOI:10.1074/jbc.m203933200.

[10] ZHU Y, RINZEMA A, TRAMPER J, et al. Microbial transglutaminase: a revie w of its production and application in food processing[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1995, 44(3/4): 277-282. DOI:10.1007/BF00169916.

[11] MOTOKI M, KUMAZAWA Y. Recent research trends in transglutaminase technology for food processing[J]. Food Science and Technology Research, 2000, 6(3): 151-160. DOI:10.3136/fstr.6.151.

[12] 黃六容, 何冬蘭, 劉梅芳. 產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2005, 24(4): 369-372. DOI:10.3321/j.issn:1000-2421.2005.04.011.

[13] 燕國梁, 堵國成, 陳堅. 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J]. 工業(yè)微生物, 2003, 33(1): 4-8. DOI:10.3969/ j.issn.1001-6678.2003.01.002.

[14] 張瑩, 郭琛琛, 黑東燕, 等. 復(fù)合誘變法選育谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高產(chǎn)菌株[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(11): 139-142. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201411028.

[15] 田沛霖. 產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的茂原鏈霉菌的發(fā)酵優(yōu)化及誘變育種[D].上海: 華東師范大學(xué), 2013: 17-25.

[16] 柏映國, 燕國梁, 堵國成, 等. Streptomyces hygroscopicus產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30(2): 27-31. DOI:10.3321/j.issn:0253-990X.2004.02.007.

[17] 田豐偉, 程傳榮, 袁維涵, 等. 原生質(zhì)體誘變選育ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌株[J]. 微生物學(xué)通報, 2010, 37(10): 1457-1461.

[18] 王麗寧, 趙妍, 張寶粉, 等. 利用原生質(zhì)體紫外誘變技術(shù)選育耐高溫香菇菌株[J]. 微生物學(xué)通報, 2014, 41(7): 1350-1357. DOI:10.13344/ j.microbiol.china.140226.

[19] ZHANG Y X, PERRY K, VINCI V A, et al. Genome shuffl ing leads to rapid phenotypic improvement in bacteria[J]. Nature, 2002, 415: 644-646. DOI:10.1038/415644a.

[20] PATNAIK R, LOUIE S, GAVRILOVIC V, et al. Genome shuffl ing of Lactobacillus for improved acid tolerance[J]. Nature Biotechnology, 2002, 20(7): 7 07-712. DOI:10.1038/nbt0702-707.

[21] WANG Y H, LI Y, PEI X L, et al. Genome-shuffl ing improved acid tolerance and L-lactic acid volumetric productivity in Lactobacillus r hamnosus[J]. Journal of Biotechnology, 2007, 129(3): 510-515. DOI:10.1016/j.jbiotec.2007.01.011.

[22] YU L, PEI X L, LEI T, et al. Genome shuffling enhanced L-lactic acid production by improving glucose tolerance of Lactobacillus rhamnosus[J]. Journal of Biotechnology, 2008, 134(1): 154-159. DOI:10.1016/j.jbiotec.2008.01.008.

[23] YU G H, HU Y S, HUI M M, et al. Genome shuffl ing of Streptomyces roseosporus for improving daptomycin production[J]. App lied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 172(5): 2661-2669. DOI:10.1007/s12010-013-0687-z.

[24] LUO J M, LI J S, LIU D, et al. Genome shuffling of Streptomyces gilvosporeus for improving natamycin production[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(23): 6026-6036. DOI:10.1021/jf300663w.

[25] LV X G, JIN Y Y, LI Y D, et al. Genome shuffl ing of Streptomyces viridochromogenes for improved production of avilamycin[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(2): 641-648. DOI:10.1007/ s00253-012-4322-7.

[26] WANG C, ZHANG X L, CHEN Z, et al. Strain construction for enhanced production of spinosad via intergeneric protoplast fusion[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2009, 55(9): 1070-1075. DOI:10.1139/w09-064.

[27] BALTZ R H, MATSUSHIMA P. Protoplast fusion in Streptomyces: conditions for effi cient genetic recombination and cell regeneration[J]. Journal of General Microbiology, 1981, 127(1): 137-146. DOI:10.1099/00221287-127-1-137.

[28] KIESER T, BIBB M J, BUTTNER M J, et al. Practical streptomyces genetics[M]. England: John Innes Foundation Norwich, 2000: 33-67.

[29] GROSSOWICZ N, WAINFAN E, BOREK E, et al. The enzymatic formation of hydroxamic acids from glutamine and asparagine[J]. Journal of Biological Chemistry, 1950, 187(1): 111-125.

Strain Improvement by Protoplast Fusion for Enhanced Transglutaminase Production

HOU Xiaolun1, LIU Yaqing1, GUO Weiting1, GAO Hongliang1, CHANG Zhongyi1, BU Guojian2, LU Wei2, XIE Xiujuan2, JIN Mingfei1,*
(1. School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China; 2. Taixing Dongsheng Food Co. Ltd., Taixing 225411, China)

Objective: To obtain a high-yield transglutaminase (TGase)-producing str ain through protoplast fusion between mutant strains of Streptomyces mobaraensis. Methods: Protoplasts were obtained by lysozyme digestion, and after protoplast fusion, the selected fusants were screened for TGase production by primary high-throughput screening in 96-well plates and fermentation in test tubes and shake flasks, respectively. Results: The coloni es regenerated from prot oplasts had a smaller diameter, and the diameter of colonies formed by mycelia was larger. The two different colonies had a significant difference in TGase activity during fermentation in 96-well microplates. Different mutant strains of Streptomyces mobaraensis were very different with respect to TGase activity, protoplast purity and protoplast regeneration rate. The maximum protoplast regeneration rate was 1 804.25%, and the minimum was only 12.76%. After genome shuffling, we selected the top 3% of f usant strains with high TGase activity through high-throughput screening in 96-well plates to carry out fermentation i n test tubes. Of these strains, 32.2% were high-yield strains having a 22.4% higher TGase activity than the parental strain. The production was in creased by 16.28% in shake flask fermentation. Conclusion: Genome shuffling can be used to improve Streptomyces mobaraensis for enhanced TGase production.

Streptomyces mobaraensis; protoplasts; regeneration; fusion; genome shuffling

10.7506/spkx1002-6630-201603027

Q939.97

A

1002-6630（2016）03-0145-06

侯孝侖, 劉雅清, 郭瑋婷, 等. 原生質(zhì)體融合提高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶菌株產(chǎn)量[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 145-150. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603027. http://www.spkx.net.cn

HOU Xiaolun, LIU Yaqing, GUO Weiting, et al. Strain improvement by protoplast fusion for enhanced transglutaminase production[J]. Food Science, 2016, 37(3): 145-150. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603027. http://www.spkx.net.cn

2015-03-19

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（78210203）

侯孝侖（1989—），男，碩士研究生，研究方向為應(yīng)用微生物。E-mail：houxiaolun@126.com

*通信作者：金明飛（1979—），男，講師，博士，研究方向為應(yīng)用微生物。E-mail：mfjin@bio.ecnu.edu.cn