抗呋喃唑酮單克隆抗體的制備及其應用

陳蔭楠，陳 華，石賢愛,2,*，葉小軍，樊海平

（1.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108；2.福建省醫療器械和醫藥技術重點實驗室，福建 福州 350002；3.福建省淡水水產研究所，福建 福州 350002）

抗呋喃唑酮單克隆抗體的制備及其應用

陳蔭楠1，陳 華1，石賢愛1,2,*，葉小軍3，樊海平3

（1.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108；2.福建省醫療器械和醫藥技術重點實驗室，福建 福州 350002；3.福建省淡水水產研究所，福建 福州 350002）

為實現呋喃唑酮（furazolidone，FZD）的快速定量檢測，本研究制備了抗FZD全抗原的單克隆抗體，建立了抗FZD的單克隆抗體酶聯免疫檢測方法。結果表明，FZD單克隆抗體在質量濃度為10～500 ng/mL范圍具有較好的線性，IC50值為0.06 μg/mL，最低檢測限為6.92 ng/mL，對于其他硝基呋喃類抗生素及其代謝物均不存在交叉反應。該方法重現性較好，平均誤差為6.54%，回收率為76.84%～88.31%。

呋喃唑酮；單克隆抗體；酶聯免疫檢測

硝基呋喃類藥物是一類人工合成的具有5-硝基呋喃結構的廣譜抗生素，其中呋喃唑酮（furazolidone，FZD）主要用于治療腸道感染和球蟲病[1-2]。它們作用于微生物酶系統，抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖類代謝，起到很好的抑菌、殺菌作用[3]，被廣泛應用于家禽、水產等動物傳染病的預防與治療[4]。在長期的實驗研究過程中發現，硝基呋喃類藥物和代謝物均可以使實驗動物發生癌變和基因突變[5]。我國于2002年3月發布《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》將呋喃唑酮列為禁用藥[6]。

國內外報道的呋喃唑酮殘留量檢測方法主要有分光光度法[7]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8-9]、液相色譜-質譜聯用法[10-11]、酶聯免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[12-13]法、熒光免疫法[14-15]等。近年來，基于ELISA檢測法快速、靈敏、設備簡便、特異性強等優點，已被廣泛應用于農獸藥殘留的快速檢測[16]。如國外學者Vass等[17]采用ELISA快速測定雞蛋中呋喃西林代謝物，經酸衍生化后的樣品通過酶聯免疫反應，得到回收率在77.8%～110%，檢出限為0.13 μg/kg。Pimpitak等[18]采用ELISA測定蝦中3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ），檢出限為0.16 μg/kg。國內學者們也對呋喃唑酮代謝物的ELISA檢測做了許多研究。徐蓓等[6]用對醛基苯甲酸對呋喃唑酮代謝物AOZ衍生后，再與載體蛋白連接進行免疫，得到針對AOZ與4-羧基苯甲醛的反應產物3-（（4-羧基苯亞甲基）-氨基）-2-惡唑烷酮（3-{[(4-carboxyphenyl)methylene]-amino}-2-oxazolidinone，CPAOZ）的多克隆抗體，其抗體通過直接競爭酶聯免疫法檢測，可得檢出限為0.2 μg/L，且與其他抗生素藥物無交叉反應。汪莉等[19]利用多克隆抗體構建了ELISA檢測法定量檢測食品中呋喃唑酮，回收率為87.3%～107.5%。羅杰等[20]以呋喃唑酮多克隆抗體建立了水產品中呋喃唑酮的ELISA檢測法，該方法對水產品中FZD的檢測限為1.0 ng/g，但IC50值較高，且得到的抗體對呋喃西林有43%的交叉反應率。

開發具有自主知識產權的快速、準確、靈敏的呋喃唑酮檢測試劑盒有利于從養殖業源頭上解決呋喃唑酮使用的問題，具有重要意義。然而多克隆抗體批間差異大，檢測靈敏度較低，且往往伴隨高交叉反應率，容易增加假陽性的概率，不利于開發性能穩定的快速檢測產品[21-23]。因此，為了提高靈敏度及特異性，單克隆抗體的研制已成為發展趨勢。由于呋喃唑酮是小分子物質[24]，結構簡單，難以制備免疫原性強、能刺激機體產生高親和力、高效價的抗呋喃唑酮特異性抗體，因此，目前國內外關于制備抗呋喃唑酮單克隆抗體的報道較少[25]。本實驗室利用重氮法成功制備了基于FZD的人工抗原并獲得了具有高特異性的抗FZD的單克隆抗體，并在此基礎上建立了酶聯免疫檢測試劑盒并應用于實際樣品檢測，證明了該試劑盒具有諸多優勢且展示了良好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FZD單克隆抗體 自制。

呋喃唑酮、呋喃它酮（furaltadone，FTD）、呋喃妥因（nitrofurantion，NFT）、呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）、氨基脲（semicarbazide，SEM）、3-氨基-2-惡唑烷酮德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；亞硝酸鈉、鋅粉 西隴化工股份有限公司；25%戊二醛 美國Alfa Aesar公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA） 美國Worthington公司；葡聚糖凝膠G-25（Sephadex G-25） 美國Pharmacia公司；含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline with Tween-20，PBST） 美國Amresco公司；四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）北京天根生化科技公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗小鼠IgG 美國Thermo Fisher Scientific公司；UV-1800紫外分光光度儀 日本島津公司。

1.2 儀器與設備

SH-1000全波長酶標儀 日本Corona公司；Z323高速冷凍離心機 德國Hermle公司；BS224S電子天平 德國Sartorius公司；DKZ-1電熱恒溫振蕩水槽上海精宏實驗設備有限公司；1525高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 實驗動物

3 只8 周齡的雌性BALB/c小鼠 福建省醫科大學。1.4 方法

1.4.1 FZD-BSA單克隆抗體的制備

1.4.1.1 重氮法合成人工抗原

1）稱取呋喃唑酮2 mg，溶解于100 μL的乙腈和甲醇中，再加入2 mL 1 mol/L的鹽酸，攪拌并加入1 mg鋅粉，振蕩混勻。將混合液置于80 ℃的水浴中加熱20 min，取上清冷卻至4 ℃。取冷卻后的呋喃唑酮還原液2 mL，用1 mol/L的鹽酸調pH值至1～2；往上述溶液中逐滴加入0.5 mol/L的亞硝酸鈉溶液并攪拌，直至淀粉碘化鉀試紙檢驗呈灰藍色時，停止滴加[20]；2）稱取10 mg BSA，溶解于1 mL 0.01 mol/L pH 7.4的PBS中，冷卻至4 ℃；將1）中溶液逐滴加入到BSA溶液中并攪拌混勻；往上述混合液中加入適量1 mol/L的氫氧化鈉溶液，pH值調為8.5；所得混合液在避光條件下振蕩1 h后，放置在4 ℃冰箱過夜，得到FZD-BSA偶聯產物。用OVA代替BSA制備檢測抗原。

1.4.1.2 偶聯產物的紫外掃描檢測

采用紫外分光光度儀，分別對FZD、BSA和OVA標準品溶液進行全波長掃描（190～800 nm），確定各物質的特征吸收波長。對經Sephadex G-25凝膠層析柱分離純化后的偶聯物進行紫外掃描，檢測偶聯物在該波長附近范圍的特征吸收峰情況，并收集第一個洗脫峰。

1.4.1.3 偶聯產物的液相色譜分析

色譜柱為Thermo SEC-300（300 mm×7.8 mm，10 μm）；二極管陣列檢測器（diode-array detector，DAD），雙通道檢測，檢測波長分別為278 nm和364 nm，其中278 nm是蛋白的吸收峰波長，364 nm是FZD的特征吸收峰波長之一；流動相為0.01 mol/L PBS；流速1.0 mL/min。

1.4.1.4 偶聯產物的紅外光譜檢測

采用紅外光譜檢測法對偶聯產物的結構進行進一步的確認，具體操作如下：將純品KBr放入研缽中研細，壓片，裝入紅外光譜儀，進行紅外掃描檢測，作為空白；分別將BSA、OVA標準品及凍干的偶聯產物與KBr按質量比100∶1放入研缽中研細，壓片；將樣品的薄片固定好，裝入紅外光譜儀，在500～4 000 cm－1范圍分別對BSA、OVA標準品及偶聯產物進行紅外掃描檢測，獲得各樣品的紅外光譜圖。

1.4.1.5 動物免疫

選取8 周齡的雌性BALB/c小鼠，用免疫抗原FZD-BSA進行免疫。免疫劑量以相同的呋喃唑酮量計算，每只小鼠每次免疫劑量為3.0 μg的呋喃唑酮。首次免疫將人工免疫抗原與等體積的弗氏完全佐劑混合，振蕩至完全乳化，對小鼠進行腹腔注射。此后每隔14 d加強免疫一次，將免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑混合，免疫方法同首次免疫，共免疫5 次[21]。每次加強免疫前，對小鼠尾靜脈采血，采用間接非競爭ELISA檢測多抗的效價，直至抗血清效價大于5×104，進行加強免疫，4 d后取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞采用50%聚乙二醇（分子質量4 000 D）進行融合。

1.4.1.6 間接競爭ELISA檢測方法

采用重氮法制備的FZD-OVA作為檢測抗原，測定多抗血清中抗FZD多克隆抗體的特異性。檢測抗原FZD-OVA與免疫抗原FZD-BSA采用相同的制備方法。

具體操作如下：包被：用碳酸鹽緩沖液稀釋抗原FZD-OVA至蛋白質量濃度為20 μg/mL，包被于酶標孔板條，100 μL/孔，4 ℃反應過夜。洗滌：傾去包被液，洗滌3 次，4 min/次，扣干。封閉：每孔加入5%脫脂奶200 μL，37 ℃封閉3 h；傾去封閉液，洗滌3 次。競爭反應：取還原后的FZD 1 mg，溶解于1 mL 的甲醇-乙腈溶液中，倍比稀釋到質量濃度為：80 000、40 000、8 000、4 000、800、400、80、40、8、4、2 ng/mL的標準液。分別將各質量濃度標準品溶液與適當濃度的多抗血清等體積混合，每孔加入混合液100 μL，同時設置陽性對照組、陰性對照組和空白對照組，37 ℃孵育2 h；傾去抗血清，洗滌3 次，扣干。加入酶標二抗：加入稀釋好的HRP-羊抗小鼠IgG，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；傾去酶標二抗，洗滌3 次，扣干。顯色反應：每孔加入100 μL的底物TMB，37 ℃避光反應30 min；終止反應：每孔加入100 μL的終止液，用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度（A450nm）。

結果判定：以結合率為縱坐標，以FZD質量濃度的對數值為橫坐標，繪制競爭曲線，觀察抗FZD抗體與FZD的競爭反應情況，判斷抗體的特異性。以抗FZD特異性抗體對FZD的競爭抑制率為縱坐標，以FZD質量濃度的對數值為橫坐標，繪制標準競爭曲線。在標準競爭曲線上計算出抑制率為50%時混合液中FZD的標準質量濃度作為競爭抑制率IC50。

式中：A為加入不同質量濃度的底物FZD的A450nm值；A0為不加底物FZD的A450nm值；A空白對照為不加底物FZD、不加抗血清的A450nm值。

1.4.1.7 腹水單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）的制備

雜交瘤細胞株經篩選和克隆化后，往BALB/c小鼠腹腔接種0.5 mL液體石蠟，7 d后收集雜交瘤細胞，用無完全培養液調整細胞密度至2×106個/mL，每只小鼠腹腔注射0.5 mL。觀察小鼠腹部，若腹部明顯膨大，即可用針筒采集腹水。

1.4.1.8 腹水mAb效價的測定

以FZD-OVA包被酶標板，將收集到的腹水3 000 r/min離心20 min，棄去脂肪層和細胞殘渣等，吸取澄清部分，采用間接非競爭ELISA檢測腹水效價。

1.4.1.9 單抗的分離純化

為了進一步除去脂肪粒、小顆粒物質、細胞及其殘渣等，可在單抗純化之前，采用二氧化硅吸附法對腹水進行預處理。得到澄清的腹水后于4 ℃條件下向腹水中滴加硫酸銨飽和加至45%，4 ℃冰箱放置過夜，隔天，3 000 r/min離心20 min，收集沉淀。用4 倍原體積的PBS溶解。將此樣品立即用Sephadex G-25凝膠過濾進行脫鹽，收集第1個洗脫峰，凍干后重新溶解、測定。

1.4.1.10 單抗免疫球蛋白的類別和亞類鑒定

采用間接ELISA的方法鑒定單抗Ig類和亞類。對比不同類別及亞類的HRP標記的羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM作用下的顯色結果，以顯色與否判定該株雜交瘤細胞分泌的單抗所屬類別及亞類。

1.4.1.11 純化后mAb純度的鑒定

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對純化后的單抗進行純度鑒定。

1.4.2 間接非競爭ELISA測定純化前后單抗的效價

包被：用碳酸鹽緩沖液稀釋抗原FZD-OVA至蛋白質量濃度為20 μg/mL，包被于酶標孔板條，100 μL/孔，4 ℃反應過夜。洗滌：傾去包被液，每孔用300 μL PBST洗滌3 次，4 min/次，扣干。封閉：每孔加入5%脫脂奶200 μL，37 ℃封閉3 h；傾去封閉液，洗滌3 次。加一抗：每孔加入100 μL經PBS倍比稀釋的小鼠抗血清，37 ℃孵育2 h；傾去抗血清，洗滌3 次，扣干。加二抗：每孔加入100 μL經PBS稀釋2 000 倍的HRP-羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h；傾去酶標二抗，洗滌3 次，扣干。顯色：每孔加入100 μL TMB，37 ℃避光反應30 min；加入2 mol/L H2SO4，100 μL/孔以終止反應。檢測：測定450 nm波長處的吸光度（A450nm）。結果判定：當2.1×（A陰性對照－A空白對照）≤（A陽性血清－A空白對照），且陰性對照的A450nm大于0.1時，此時的抗體稀釋倍數即是抗體的效價。

1.4.3 ELISA試劑盒最佳工藝的確定

1.4.3.1 最佳包被抗原及單抗工作質量濃度的確定

采用方陣實驗法，將包被抗原和抗呋喃唑酮單克隆抗體分別作系列稀釋，抗原質量濃度分別稀釋為10、5、2、1、0.2 μg/mL，單抗稀釋倍數分別為1 000、5 000、10 000、50 000、100 000、500 000。以重氮化法制備的FZD-OVA作為檢測抗原，其余步驟同間接競爭ELISA。根據檢測得到的A450nm值，確定實驗最佳的包被抗原質量濃度和單抗的最佳稀釋倍數。

1.4.3.2 單抗與標準品加入次序及最佳時間的確定

將抗呋喃唑酮單克隆抗體與FZD標準品按等體積比混合，采用間接競爭ELISA法對檢測效果進行觀察。方案A：抗呋喃唑酮單克隆抗體與FZD板外反應60 min后，板內反應60 min；方案B：呋喃唑酮單克隆抗體與FZD板外反應90 min后，板內反應30 min；方案C：呋喃唑酮單克隆抗體與FZD混合后直接板內反應120 min。

1.4.3.3 間接競爭ELISA標準曲線的繪制

采用重氮化法制備的FZD-OVA作為檢測抗原，包被質量濃度為5 μg/mL，4 ℃包被過夜；傾去包被液，洗滌后用5%的脫脂奶封閉過夜。

FZD：取還原后的FZD 1 mg，溶解于1 mL的甲醇-乙腈中，用PBS倍比稀釋到質量濃度為：10 000、5 000、1 000、500、100、50、10、5、1、0.1 ng/mL的標準液。分別將各質量濃度標準品溶液與適當溶度的多抗血清等體積混合，37 ℃孵育一定時間后加板，每孔加入混合液100 μL，同時設置陽性對照組、陰性對照組和空白對照組，繼續37 ℃孵育一定時間，反應時間根據1.4.3.2節確定；傾去混合液傾去抗血清，用300 μL PBST洗滌3 次，每次間隔4 min，扣干。其余步驟同1.4.2節。

1.4.3.4 檢測方法的最低檢測限分析

從包被的10 塊板中隨機選擇10 個孔，加入50 μL零標準品和50 μL稀釋到工作質量濃度的抗呋喃唑酮單克隆抗體，應用建立的間接競爭ELISA法測定450 nm波長處的吸光度。求得10 個孔的標準差（s），在標準曲線上對應3s/A0的標準品質量濃度即為此方法的最低檢測限。

式中：A0為不加底物FZD的A450nm值；Ai為加底物FZD的不同孔的A450nm值；n為孔數，取值10。

1.4.3.5 間接競爭ELISA檢測方法的精密度測定

取3 個不同質量濃度的呋喃唑酮標準品，進行間接競爭ELISA分析，每個質量濃度每天做一次分析，綜合5 次測定的抑制率，求出變異系數。

1.4.3.6 交叉反應率的確定

分別將FTD、NFT、NFZ、SEM以及AOZ這5 種結構類似物標準液倍比稀釋，每個質量濃度分別取50 μL與等體積稀釋到最適工作質量濃度的單抗于37 ℃溫育反應60 min，再加入到包被封閉好的96 孔內反應60 min，其余步驟同間接競爭ELISA。最后以FTD、NFT、NFZ、SEM和AOZ的IC50與FZD的IC50百分比可得該單抗與各結構類似物的交叉反應率。

式中：IC50,FZD為當FZD對抗血清抑制率為50%時，FZD的標準質量濃度/（μg/mL）；IC50,結構類似物為FZD結構類似物對抗血清抑制率達到50%時，FZD結構類似物的標準質量濃度/（μg/mL）。

1.4.4 樣品加標回收率的測定

將空白飼料樣本研磨粉碎，過篩備用。取適量樣品于50 mL離心管中，按10.0、50.0、100.0 μg/g的添加量分別加入適量的FZD標準品。然后加入甲醇-乙腈（3∶7，V/V）提取液，劇烈振蕩30 min。靜置一段時間后，離心取上清液進行還原。待冷卻至室溫后采用間接競爭ELISA法進行檢測。最后，根據FZD競爭抑制標準曲線，計算加標回收率。

2 結果與分析

2.1 FZD人工抗原的制備與鑒定

2.1.1 偶聯產物的液相色譜分析

按照1.4.1.1節所述制備的FZD-BSA人工抗原，經Sephadex G-25柱層析分離純化后進行液相色譜分析，結果如圖1所示。偶聯產物FZD-BSA的出峰時間為8.283 min，比BSA的出峰時間（8.929 min）略早一點，符合色譜柱分離原理，因為偶聯反應后的蛋白分子質量增大。同時在FZD-BSA的HPLC圖中未觀察到FZD的吸收峰（15.531 min），表明經過Sephadex G-25凝膠分離純化后的偶聯物中不含有游離的FZD。

圖1 FZD（a）、BSA（b）及FZD-BSA（c）的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of FZD (a), BSA (b) and FZD-BSA (c)

2.1.2 偶聯產物的紫外分析

圖2 BSA、FZD和FZD-BSA紫外掃描圖Fig.2 UV absorption spectra of BSA, FZD and FZD-BSA

通過紫外全波長掃描結果（圖2）可知，BSA在278 nm波長處有最大吸收峰；FZD在258 nm和364 nm波長處有主要特征吸收峰；而偶聯抗原除了在278 nm波長處有明顯的特征吸收峰外，在360～364 nm波長處還存在明顯肩峰，這是偶聯產物中FZD的特征吸收峰，進一步證明FZD與載體蛋白BSA偶聯成功。

2.1.3 偶聯產物的紅外光譜分析

圖3 FZD、BSA和FZD-BSA紅外光譜圖Fig.3 IR absorption spectra of FZDFZD, BSA, and FZDFZD-BSA

由圖3可知，BSA分別在1 500～1 700 cm－1區域、2 958～2 925 cm－1區域以及2 800～3 400 cm－1區域存在蛋白質中酰胺基和胺基伸縮的特征吸收峰。FZD在500～1 700 cm－1區域有一系列的特征吸收峰，主要為在3 450 cm－1和1 760 cm－1有C＝O特征峰；1 233 cm－1處有C—O—C的特征峰，1 511、1 470、1 388、1 348 cm－1有—NO2特征峰；857、963、1 025、1 106、1 233、1 638 cm－1處有呋喃環的特征吸收峰。而FZD-BSA除具有上述蛋白質的特征吸收峰外，在3 450、500～1 700 cm－1區域出現與FZD相類似的特征吸收峰，分別在3 452、1 638、1 160、1 074、861 cm－1。說明FZD-BSA偶聯抗原成功制備。

2.2 FZD-BSA單克隆抗體的制備

2.2.1 FZD-BSA抗原免疫小鼠

將制備得到的偶聯抗原免疫小鼠，5 次免疫后獲得的多克隆抗體的最高效價為1∶306 000，進行細胞融合。2.2.2 重氮化法制備抗原獲得抗體的特異性分析

對重氮化法制備的人工抗原免疫小鼠后獲得的抗血清，采用間接競爭ELISA方法，對多克隆抗體針對FZD的特異性分析。分別加入不同質量濃度的FZD還原溶液與檢測抗原FZD-OVA競爭抗體的結合位點，結果見圖4。

圖4 抗FZD特異性抗體競爭結合曲線Fig.4 Competitive inhibition standard curve of anti-FZD antibody

由圖4可知，加入還原后的FZD，游離的FZD對小鼠多抗與檢測抗原的結合產生了一定的競爭抑制，且隨著FZD質量濃度的不斷增大，其與FZD-OVA的競爭結合能力不斷下降，當游離的FZD質量濃度達到8 000 ng/mL后，繼續增加游離抗原質量濃度，FZD與FZD-OVA競爭結合能力開始趨于平緩，下降不再明顯。

同時由圖4可看出，當FZD質量濃度在40～8 000 ng/mL時，抑制率呈一定的線性關系。以抑制率為縱坐標，FZD質量濃度的對數值為橫坐標，擬合標準曲線后得到的線性方程為y＝32.147x－45.712（R2＝0.992 2）。以抑制率為50%時對應的質量濃度為IC50，FZD的IC50值為0.93 μg/mL，最低檢測限為53.70 ng/mL。由此可見，以重氮化法制備的FZD-BSA人工抗原可刺激小鼠產生抗FZD的特異性抗體。

2.2.3 雜交瘤細胞的篩選

將FZD-BSA人工抗原免疫得到的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合。以SP2/0細胞培養的上清液作陰性對照，陽性的鼠血清作陽性對照，采用間接非競爭ELISA法對雜交瘤細胞上清進行檢測，以A450nm值大于1.4為陽性克隆孔。選擇陽性較強的單克隆細胞孔內的雜交瘤細胞進行克隆化。重復上述步驟，直至得到穩定分泌抗FZD的雜交瘤細胞株。經過間接非競爭ELISA檢測后，細胞融合率為83.75%，陽性率為50.00%。采用有限稀釋法，對A450nm值較高，且融合細胞團較少的孔進行克隆化培養細胞。通過3 次克隆化，得到穩定分泌FZD的雜交瘤細胞株。命名為C2-H5。

2.2.4 雜交瘤細胞培養上清液mAb效價、亞類分析

以骨髓瘤細胞上清液為空白對照、空白小鼠血清為陰性對照。采用ELISA法測定雜交瘤細胞株培養上清液mAb效價，測得C2-H5的效價為1∶1 892。

采用間接非競爭ELISA方法測定抗FZD單克隆抗體的亞類，結果如圖5所示。雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體與不同類別的亞類二抗顯色結果有著明顯差異，其中與IgG2b二抗的A450nm值最高，與IgG1、IgG2a、IgG3的二抗微弱顯色，而與IgA和IgM二抗幾乎不顯色，該細胞分泌的抗體類型以IgG2b為主。

圖5 單抗類別及亞類的測定結果Fig.5 Subclass composition of monoclonal antibody

2.2.5 單克隆抗體的制備及純化細胞株C2-H5分泌的腹水mAb效價平均可達1∶2.49×106。分別將未經任何處理和經過預處理的腹水采用硫酸銨沉淀法進行純化，后者純化效果略優于前者，但后者抗體效價損失較大。C2-H5純化后的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖中均有2 條帶，一條為IgG的重鏈，分子質量約65 kD，另一條為輕鏈，分子質量約為25 kD。

2.3 包被抗原及單抗工作質量濃度的確定包被抗原和單抗質量濃度是ELISA測定方法中影響靈敏度的重要因素，因此選擇合適的包被抗原質量濃度和單抗質量濃度能有效提高ELISA測定的重要指標。采用了方陣滴定法來確定最佳的包被抗原質量濃度與抗體稀釋倍數。通過非間接競爭ELISA表明FZD-OVA

最佳抗原工作質量濃度為2 μg/mL。在此包被質量濃度下，抗體稀釋倍數在1∶10 000時A450nm值在1.0附近，故選擇1∶10 000作為抗體最佳稀釋倍數。

2.4 單抗與標準品加入次序及最佳作用時間的確定

本實驗設計了板內外競爭的3 種方案。結果如表1所示，方案A產生的抑制率明顯優于方案B與方案C，所以確定將呋喃唑酮與單抗等體積混合后，于板外反應60 min，再將混合液加入封閉后洗滌好的酶標板上競爭反應60 min。

表1 FZD標準品與單抗加入次序及作用時間的確定（A450 nm）Table1 Determination of the addition sequence and reaction time of FZD and mAb (

2.5 間接競爭ELISA標準曲線

當FZD質量濃度在10～500 ng/mL范圍時，抑制率呈現較好的線性關系。以抑制率為縱坐標，FZD添加質量濃度的對數值為橫坐標，擬合標準曲線后得到線性方程為y＝42.027x－26.143（R2＝0.998 4）。以抑制率為50%時對應的質量濃度為IC50，FZD的IC50值為0.06 μg/mL。

2.6 最低檢測限

在包被好的酶標板中隨機挑選10 孔，按建立好的間接競爭性ELISA模式做零標準的實驗。求所得12 個A450nm值的標準差s，3s位置相應的抑制率為9.34%，對應于標準曲線上FZD的質量濃度為6.92 ng/mL，即最低檢測限為6.92 ng/mL。

2.7 間接競爭ELISA檢測方法的精密度

按照1.4.3.5節的方法，重復做5 次呋喃唑酮的競爭抑制曲線，每次做3 個質量濃度，每個質量濃度做3 個平行孔，以平行孔的均值作為每次每個質量濃度下的抑制率，得出每個質量濃度下的變異系數均小于10%，平均誤差為6.54%。實驗表明，該方法具有較好的重現性。

2.8 交叉反應率

以重氮化法制備的FZD-OVA作為包被抗原，將FTD、NFT、NFZ、SEM和AOZ分別稀釋成梯度質量濃度的標準品，采用間接競爭ELISA法檢測，得出抗呋喃唑酮單克隆抗體與各FZD結構類似物的IC50，計算出交叉反應率，得出抗呋喃唑酮單克隆抗體對5 種硝基呋喃抗生素的交叉反應率均低于0.01%，說明篩選到的單抗具有很高的特異性，可有效避免假陽性問題的出現。

2.9 樣品加標回收率

往不含呋喃唑酮的飼料中分別加入FZD使其添加量為10.0、50.0、100.0 μg/g，樣品經提取后進行ELISA檢測，每個質量濃度重復檢測3 次，計算加標回收率，結果見表2。FZD樣品的加標回收率為76.84%～88.31%，變異系數9.36%～15.79%。

表2 呋喃唑酮加標回收率Table2 Recovery rates of FZD from blank samples

3 結 論

以重氮化法制備的FZD-BSA為免疫抗原免疫小鼠，獲得的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，篩選到一株穩定分泌抗FZD單克隆抗體的雜交瘤細胞C2-H5。采用動物體內生產單抗的方法，獲得腹水，并進行純化。其細胞培養上清液效價為1∶1 892；獲得的鼠腹水效價為1∶2.49×106，蛋白質含量為43.36 mg/mL。采用硫酸銨沉淀法對腹水進行純化，純化后抗體效價為1∶7.06×105，蛋白回收率為16.79%。

對篩選到的抗呋喃唑酮單抗進行了特性鑒定。該單抗為IgG2b類，其重鏈約65 kD，輕鏈約25 kD。篩選到的單抗具有良好的特異性，與5 種硝基呋喃抗生素及其代謝物（FTD、NFT、NFZ、SEM、AOZ）的交叉反應率均低于0.01%。

建立了基于抗FZD單克隆抗體的間接競爭ELISA檢測方法。實驗得最佳抗原工作質量濃度為2 μg/mL，最佳抗體稀釋度為1∶10 000，檢測范圍為10～500 ng/mL，IC50值為0.06 μg/mL，最低檢測限為6.92 ng/mL。本實驗建立的檢測方法重現性較好，平均誤差為6.54%。樣品加標回收率為76.84%～88.31%，變異系數為9.36%～15.79%。

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Preparation and Application of Monoclonal Antibody against Furazolidone

CHEN Yinnan1, CHEN Hua1, SHI Xianai1,2,*, YE Xiaojun3, FAN Haiping3
(1. College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China; 2. Fujian Key Laboratory of Medical Instrument and Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350002, China; 3. Fresh Water Fisheries Research Institute of Fujian Province, Fuzhou 350002, China)

Based on the hapten of furazolidone (FZD), a monoclonal (mAb)-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method for the detection of FZD was established after the preparation of mAb against FZD-bovine serum albumin (BSA). The linear range for furazolidone detection was 10–500 ng/mL, and the IC50was 0.06 μg/mL with a lowest detection limit of 6.92 ng/mL. Meanwhile, the mAb showed almost no cross reactivity with other nitrofurans or their metabolites. This method had good reproducibility, with an average error of 6.54%. In tested samples, the recovery for furazolidone addition was 76.84%–88.31%.

furazolidone (FZD); monoclonal antibody (mAb); enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

10.7506/spkx1002-6630-201603029

TS207.3

A

1002-6630（2016）03-0157-07

陳蔭楠, 陳華, 石賢愛, 等. 抗呋喃唑酮單克隆抗體的制備及其應用[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 157-163. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603029. http://www.spkx.net.cn

CHEN Yinnan, CHEN Hua, SHI Xianai, et al. Preparation and application of monoclonal antibody against furazolidone[J]. Food Science, 2016, 37(3): 157-163. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603029. http://www.spkx.net.cn

2015-02-15

國家海洋公益性行業科研專項（201205022-3）；福建省科技重大專項（2013NZ0003）；福建省海洋與漁業廳重點項目（閩海漁合同[2010]2-27號）

陳蔭楠（1991—），女，碩士，研究方向為酶制劑的研發與產業化。E-mail：165456164@qq.com

*通信作者：石賢愛（1971—），男，教授，博士，研究方向為高靈敏度生物檢測。E-mail：shixa@fzu.edu.cn