抗呋喃唑酮單克隆抗體的制備及其應(yīng)用

陳蔭楠，陳 華，石賢愛(ài),2,*，葉小軍，樊海平

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；2.福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002）

抗呋喃唑酮單克隆抗體的制備及其應(yīng)用

陳蔭楠1，陳 華1，石賢愛(ài)1,2,*，葉小軍3，樊海平3

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；2.福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002）

為實(shí)現(xiàn)呋喃唑酮（furazolidone，F(xiàn)ZD）的快速定量檢測(cè)，本研究制備了抗FZD全抗原的單克隆抗體，建立了抗FZD的單克隆抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。結(jié)果表明，F(xiàn)ZD單克隆抗體在質(zhì)量濃度為10～500 ng/mL范圍具有較好的線性，IC50值為0.06 μg/mL，最低檢測(cè)限為6.92 ng/mL，對(duì)于其他硝基呋喃類(lèi)抗生素及其代謝物均不存在交叉反應(yīng)。該方法重現(xiàn)性較好，平均誤差為6.54%，回收率為76.84%～88.31%。

呋喃唑酮；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫檢測(cè)

硝基呋喃類(lèi)藥物是一類(lèi)人工合成的具有5-硝基呋喃結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，其中呋喃唑酮（furazolidone，F(xiàn)ZD）主要用于治療腸道感染和球蟲(chóng)病[1-2]。它們作用于微生物酶系統(tǒng)，抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖類(lèi)代謝，起到很好的抑菌、殺菌作用[3]，被廣泛應(yīng)用于家禽、水產(chǎn)等動(dòng)物傳染病的預(yù)防與治療[4]。在長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類(lèi)藥物和代謝物均可以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生癌變和基因突變[5]。我國(guó)于2002年3月發(fā)布《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》將呋喃唑酮列為禁用藥[6]。

國(guó)內(nèi)外報(bào)道的呋喃唑酮?dú)埩袅繖z測(cè)方法主要有分光光度法[7]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[12-13]法、熒光免疫法[14-15]等。近年來(lái)，基于ELISA檢測(cè)法快速、靈敏、設(shè)備簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留的快速檢測(cè)[16]。如國(guó)外學(xué)者Vass等[17]采用ELISA快速測(cè)定雞蛋中呋喃西林代謝物，經(jīng)酸衍生化后的樣品通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)，得到回收率在77.8%～110%，檢出限為0.13 μg/kg。Pimpitak等[18]采用ELISA測(cè)定蝦中3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ），檢出限為0.16 μg/kg。國(guó)內(nèi)學(xué)者們也對(duì)呋喃唑酮代謝物的ELISA檢測(cè)做了許多研究。徐蓓等[6]用對(duì)醛基苯甲酸對(duì)呋喃唑酮代謝物AOZ衍生后，再與載體蛋白連接進(jìn)行免疫，得到針對(duì)AOZ與4-羧基苯甲醛的反應(yīng)產(chǎn)物3-（（4-羧基苯亞甲基）-氨基）-2-惡唑烷酮（3-{[(4-carboxyphenyl)methylene]-amino}-2-oxazolidinone，CPAOZ）的多克隆抗體，其抗體通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)，可得檢出限為0.2 μg/L，且與其他抗生素藥物無(wú)交叉反應(yīng)。汪莉等[19]利用多克隆抗體構(gòu)建了ELISA檢測(cè)法定量檢測(cè)食品中呋喃唑酮，回收率為87.3%～107.5%。羅杰等[20]以呋喃唑酮多克隆抗體建立了水產(chǎn)品中呋喃唑酮的ELISA檢測(cè)法，該方法對(duì)水產(chǎn)品中FZD的檢測(cè)限為1.0 ng/g，但I(xiàn)C50值較高，且得到的抗體對(duì)呋喃西林有43%的交叉反應(yīng)率。

開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的快速、準(zhǔn)確、靈敏的呋喃唑酮檢測(cè)試劑盒有利于從養(yǎng)殖業(yè)源頭上解決呋喃唑酮使用的問(wèn)題，具有重要意義。然而多克隆抗體批間差異大，檢測(cè)靈敏度較低，且往往伴隨高交叉反應(yīng)率，容易增加假陽(yáng)性的概率，不利于開(kāi)發(fā)性能穩(wěn)定的快速檢測(cè)產(chǎn)品[21-23]。因此，為了提高靈敏度及特異性，單克隆抗體的研制已成為發(fā)展趨勢(shì)。由于呋喃唑酮是小分子物質(zhì)[24]，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，難以制備免疫原性強(qiáng)、能刺激機(jī)體產(chǎn)生高親和力、高效價(jià)的抗呋喃唑酮特異性抗體，因此，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于制備抗呋喃唑酮單克隆抗體的報(bào)道較少[25]。本實(shí)驗(yàn)室利用重氮法成功制備了基于FZD的人工抗原并獲得了具有高特異性的抗FZD的單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒并應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，證明了該試劑盒具有諸多優(yōu)勢(shì)且展示了良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FZD單克隆抗體 自制。

呋喃唑酮、呋喃它酮（furaltadone，F(xiàn)TD）、呋喃妥因（nitrofurantion，NFT）、呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）、氨基脲（semicarbazide，SEM）、3-氨基-2-惡唑烷酮德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；亞硝酸鈉、鋅粉 西隴化工股份有限公司；25%戊二醛 美國(guó)Alfa Aesar公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA） 美國(guó)Worthington公司；葡聚糖凝膠G-25（Sephadex G-25） 美國(guó)Pharmacia公司；含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline with Tween-20，PBST） 美國(guó)Amresco公司；四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）北京天根生化科技公司；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗小鼠IgG 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；UV-1800紫外分光光度儀 日本島津公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SH-1000全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 日本Corona公司；Z323高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hermle公司；BS224S電子天平 德國(guó)Sartorius公司；DKZ-1電熱恒溫振蕩水槽上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；1525高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 只8 周齡的雌性BALB/c小鼠 福建省醫(yī)科大學(xué)。1.4 方法

1.4.1 FZD-BSA單克隆抗體的制備

1.4.1.1 重氮法合成人工抗原

1）稱(chēng)取呋喃唑酮2 mg，溶解于100 μL的乙腈和甲醇中，再加入2 mL 1 mol/L的鹽酸，攪拌并加入1 mg鋅粉，振蕩混勻。將混合液置于80 ℃的水浴中加熱20 min，取上清冷卻至4 ℃。取冷卻后的呋喃唑酮還原液2 mL，用1 mol/L的鹽酸調(diào)pH值至1～2；往上述溶液中逐滴加入0.5 mol/L的亞硝酸鈉溶液并攪拌，直至淀粉碘化鉀試紙檢驗(yàn)呈灰藍(lán)色時(shí)，停止滴加[20]；2）稱(chēng)取10 mg BSA，溶解于1 mL 0.01 mol/L pH 7.4的PBS中，冷卻至4 ℃；將1）中溶液逐滴加入到BSA溶液中并攪拌混勻；往上述混合液中加入適量1 mol/L的氫氧化鈉溶液，pH值調(diào)為8.5；所得混合液在避光條件下振蕩1 h后，放置在4 ℃冰箱過(guò)夜，得到FZD-BSA偶聯(lián)產(chǎn)物。用OVA代替BSA制備檢測(cè)抗原。

1.4.1.2 偶聯(lián)產(chǎn)物的紫外掃描檢測(cè)

采用紫外分光光度儀，分別對(duì)FZD、BSA和OVA標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（190～800 nm），確定各物質(zhì)的特征吸收波長(zhǎng)。對(duì)經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析柱分離純化后的偶聯(lián)物進(jìn)行紫外掃描，檢測(cè)偶聯(lián)物在該波長(zhǎng)附近范圍的特征吸收峰情況，并收集第一個(gè)洗脫峰。

1.4.1.3 偶聯(lián)產(chǎn)物的液相色譜分析

色譜柱為T(mén)hermo SEC-300（300 mm×7.8 mm，10 μm）；二極管陣列檢測(cè)器（diode-array detector，DAD），雙通道檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為278 nm和364 nm，其中278 nm是蛋白的吸收峰波長(zhǎng)，364 nm是FZD的特征吸收峰波長(zhǎng)之一；流動(dòng)相為0.01 mol/L PBS；流速1.0 mL/min。

1.4.1.4 偶聯(lián)產(chǎn)物的紅外光譜檢測(cè)

采用紅外光譜檢測(cè)法對(duì)偶聯(lián)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)，具體操作如下：將純品KBr放入研缽中研細(xì)，壓片，裝入紅外光譜儀，進(jìn)行紅外掃描檢測(cè)，作為空白；分別將BSA、OVA標(biāo)準(zhǔn)品及凍干的偶聯(lián)產(chǎn)物與KBr按質(zhì)量比100∶1放入研缽中研細(xì)，壓片；將樣品的薄片固定好，裝入紅外光譜儀，在500～4 000 cm－1范圍分別對(duì)BSA、OVA標(biāo)準(zhǔn)品及偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行紅外掃描檢測(cè)，獲得各樣品的紅外光譜圖。

1.4.1.5 動(dòng)物免疫

選取8 周齡的雌性BALB/c小鼠，用免疫抗原FZD-BSA進(jìn)行免疫。免疫劑量以相同的呋喃唑酮量計(jì)算，每只小鼠每次免疫劑量為3.0 μg的呋喃唑酮。首次免疫將人工免疫抗原與等體積的弗氏完全佐劑混合，振蕩至完全乳化，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。此后每隔14 d加強(qiáng)免疫一次，將免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑混合，免疫方法同首次免疫，共免疫5 次[21]。每次加強(qiáng)免疫前，對(duì)小鼠尾靜脈采血，采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)多抗的效價(jià)，直至抗血清效價(jià)大于5×104，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，4 d后取小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞采用50%聚乙二醇（分子質(zhì)量4 000 D）進(jìn)行融合。

1.4.1.6 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法

采用重氮法制備的FZD-OVA作為檢測(cè)抗原，測(cè)定多抗血清中抗FZD多克隆抗體的特異性。檢測(cè)抗原FZD-OVA與免疫抗原FZD-BSA采用相同的制備方法。

具體操作如下：包被：用碳酸鹽緩沖液稀釋抗原FZD-OVA至蛋白質(zhì)量濃度為20 μg/mL，包被于酶標(biāo)孔板條，100 μL/孔，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。洗滌：傾去包被液，洗滌3 次，4 min/次，扣干。封閉：每孔加入5%脫脂奶200 μL，37 ℃封閉3 h；傾去封閉液，洗滌3 次。競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：取還原后的FZD 1 mg，溶解于1 mL 的甲醇-乙腈溶液中，倍比稀釋到質(zhì)量濃度為：80 000、40 000、8 000、4 000、800、400、80、40、8、4、2 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別將各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液與適當(dāng)濃度的多抗血清等體積混合，每孔加入混合液100 μL，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，37 ℃孵育2 h；傾去抗血清，洗滌3 次，扣干。加入酶標(biāo)二抗：加入稀釋好的HRP-羊抗小鼠IgG，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；傾去酶標(biāo)二抗，洗滌3 次，扣干。顯色反應(yīng)：每孔加入100 μL的底物TMB，37 ℃避光反應(yīng)30 min；終止反應(yīng)：每孔加入100 μL的終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A450nm）。

結(jié)果判定：以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，以FZD質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制競(jìng)爭(zhēng)曲線，觀察抗FZD抗體與FZD的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)情況，判斷抗體的特異性。以抗FZD特異性抗體對(duì)FZD的競(jìng)爭(zhēng)抑制率為縱坐標(biāo)，以FZD質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)曲線上計(jì)算出抑制率為50%時(shí)混合液中FZD的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度作為競(jìng)爭(zhēng)抑制率IC50。

式中：A為加入不同質(zhì)量濃度的底物FZD的A450nm值；A0為不加底物FZD的A450nm值；A空白對(duì)照為不加底物FZD、不加抗血清的A450nm值。

1.4.1.7 腹水單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）的制備

雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)篩選和克隆化后，往BALB/c小鼠腹腔接種0.5 mL液體石蠟，7 d后收集雜交瘤細(xì)胞，用無(wú)完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至2×106個(gè)/mL，每只小鼠腹腔注射0.5 mL。觀察小鼠腹部，若腹部明顯膨大，即可用針筒采集腹水。

1.4.1.8 腹水mAb效價(jià)的測(cè)定

以FZD-OVA包被酶標(biāo)板，將收集到的腹水3 000 r/min離心20 min，棄去脂肪層和細(xì)胞殘?jiān)龋〕吻宀糠郑捎瞄g接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)腹水效價(jià)。

1.4.1.9 單抗的分離純化

為了進(jìn)一步除去脂肪粒、小顆粒物質(zhì)、細(xì)胞及其殘?jiān)龋稍趩慰辜兓埃捎枚趸栉椒▽?duì)腹水進(jìn)行預(yù)處理。得到澄清的腹水后于4 ℃條件下向腹水中滴加硫酸銨飽和加至45%，4 ℃冰箱放置過(guò)夜，隔天，3 000 r/min離心20 min，收集沉淀。用4 倍原體積的PBS溶解。將此樣品立即用Sephadex G-25凝膠過(guò)濾進(jìn)行脫鹽，收集第1個(gè)洗脫峰，凍干后重新溶解、測(cè)定。

1.4.1.10 單抗免疫球蛋白的類(lèi)別和亞類(lèi)鑒定

采用間接ELISA的方法鑒定單抗Ig類(lèi)和亞類(lèi)。對(duì)比不同類(lèi)別及亞類(lèi)的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM作用下的顯色結(jié)果，以顯色與否判定該株雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗所屬類(lèi)別及亞類(lèi)。

1.4.1.11 純化后mAb純度的鑒定

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)純化后的單抗進(jìn)行純度鑒定。

1.4.2 間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定純化前后單抗的效價(jià)

包被：用碳酸鹽緩沖液稀釋抗原FZD-OVA至蛋白質(zhì)量濃度為20 μg/mL，包被于酶標(biāo)孔板條，100 μL/孔，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。洗滌：傾去包被液，每孔用300 μL PBST洗滌3 次，4 min/次，扣干。封閉：每孔加入5%脫脂奶200 μL，37 ℃封閉3 h；傾去封閉液，洗滌3 次。加一抗：每孔加入100 μL經(jīng)PBS倍比稀釋的小鼠抗血清，37 ℃孵育2 h；傾去抗血清，洗滌3 次，扣干。加二抗：每孔加入100 μL經(jīng)PBS稀釋2 000 倍的HRP-羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h；傾去酶標(biāo)二抗，洗滌3 次，扣干。顯色：每孔加入100 μL TMB，37 ℃避光反應(yīng)30 min；加入2 mol/L H2SO4，100 μL/孔以終止反應(yīng)。檢測(cè)：測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A450nm）。結(jié)果判定：當(dāng)2.1×（A陰性對(duì)照－A空白對(duì)照）≤（A陽(yáng)性血清－A空白對(duì)照），且陰性對(duì)照的A450nm大于0.1時(shí)，此時(shí)的抗體稀釋倍數(shù)即是抗體的效價(jià)。

1.4.3 ELISA試劑盒最佳工藝的確定

1.4.3.1 最佳包被抗原及單抗工作質(zhì)量濃度的確定

采用方陣實(shí)驗(yàn)法，將包被抗原和抗呋喃唑酮單克隆抗體分別作系列稀釋?zhuān)乖|(zhì)量濃度分別稀釋為10、5、2、1、0.2 μg/mL，單抗稀釋倍數(shù)分別為1 000、5 000、10 000、50 000、100 000、500 000。以重氮化法制備的FZD-OVA作為檢測(cè)抗原，其余步驟同間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA。根據(jù)檢測(cè)得到的A450nm值，確定實(shí)驗(yàn)最佳的包被抗原質(zhì)量濃度和單抗的最佳稀釋倍數(shù)。

1.4.3.2 單抗與標(biāo)準(zhǔn)品加入次序及最佳時(shí)間的確定

將抗呋喃唑酮單克隆抗體與FZD標(biāo)準(zhǔn)品按等體積比混合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)檢測(cè)效果進(jìn)行觀察。方案A：抗呋喃唑酮單克隆抗體與FZD板外反應(yīng)60 min后，板內(nèi)反應(yīng)60 min；方案B：呋喃唑酮單克隆抗體與FZD板外反應(yīng)90 min后，板內(nèi)反應(yīng)30 min；方案C：呋喃唑酮單克隆抗體與FZD混合后直接板內(nèi)反應(yīng)120 min。

1.4.3.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用重氮化法制備的FZD-OVA作為檢測(cè)抗原，包被質(zhì)量濃度為5 μg/mL，4 ℃包被過(guò)夜；傾去包被液，洗滌后用5%的脫脂奶封閉過(guò)夜。

FZD：取還原后的FZD 1 mg，溶解于1 mL的甲醇-乙腈中，用PBS倍比稀釋到質(zhì)量濃度為：10 000、5 000、1 000、500、100、50、10、5、1、0.1 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別將各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液與適當(dāng)溶度的多抗血清等體積混合，37 ℃孵育一定時(shí)間后加板，每孔加入混合液100 μL，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，繼續(xù)37 ℃孵育一定時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)1.4.3.2節(jié)確定；傾去混合液傾去抗血清，用300 μL PBST洗滌3 次，每次間隔4 min，扣干。其余步驟同1.4.2節(jié)。

1.4.3.4 檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限分析

從包被的10 塊板中隨機(jī)選擇10 個(gè)孔，加入50 μL零標(biāo)準(zhǔn)品和50 μL稀釋到工作質(zhì)量濃度的抗呋喃唑酮單克隆抗體，應(yīng)用建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。求得10 個(gè)孔的標(biāo)準(zhǔn)差（s），在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)3s/A0的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度即為此方法的最低檢測(cè)限。

式中：A0為不加底物FZD的A450nm值；Ai為加底物FZD的不同孔的A450nm值；n為孔數(shù)，取值10。

1.4.3.5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的精密度測(cè)定

取3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析，每個(gè)質(zhì)量濃度每天做一次分析，綜合5 次測(cè)定的抑制率，求出變異系數(shù)。

1.4.3.6 交叉反應(yīng)率的確定

分別將FTD、NFT、NFZ、SEM以及AOZ這5 種結(jié)構(gòu)類(lèi)似物標(biāo)準(zhǔn)液倍比稀釋?zhuān)總€(gè)質(zhì)量濃度分別取50 μL與等體積稀釋到最適工作質(zhì)量濃度的單抗于37 ℃溫育反應(yīng)60 min，再加入到包被封閉好的96 孔內(nèi)反應(yīng)60 min，其余步驟同間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA。最后以FTD、NFT、NFZ、SEM和AOZ的IC50與FZD的IC50百分比可得該單抗與各結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率。

式中：IC50,FZD為當(dāng)FZD對(duì)抗血清抑制率為50%時(shí)，F(xiàn)ZD的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度/（μg/mL）；IC50,結(jié)構(gòu)類(lèi)似物為FZD結(jié)構(gòu)類(lèi)似物對(duì)抗血清抑制率達(dá)到50%時(shí)，F(xiàn)ZD結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.4.4 樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定

將空白飼料樣本研磨粉碎，過(guò)篩備用。取適量樣品于50 mL離心管中，按10.0、50.0、100.0 μg/g的添加量分別加入適量的FZD標(biāo)準(zhǔn)品。然后加入甲醇-乙腈（3∶7，V/V）提取液，劇烈振蕩30 min。靜置一段時(shí)間后，離心取上清液進(jìn)行還原。待冷卻至室溫后采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。最后，根據(jù)FZD競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 FZD人工抗原的制備與鑒定

2.1.1 偶聯(lián)產(chǎn)物的液相色譜分析

按照1.4.1.1節(jié)所述制備的FZD-BSA人工抗原，經(jīng)Sephadex G-25柱層析分離純化后進(jìn)行液相色譜分析，結(jié)果如圖1所示。偶聯(lián)產(chǎn)物FZD-BSA的出峰時(shí)間為8.283 min，比BSA的出峰時(shí)間（8.929 min）略早一點(diǎn)，符合色譜柱分離原理，因?yàn)榕悸?lián)反應(yīng)后的蛋白分子質(zhì)量增大。同時(shí)在FZD-BSA的HPLC圖中未觀察到FZD的吸收峰（15.531 min），表明經(jīng)過(guò)Sephadex G-25凝膠分離純化后的偶聯(lián)物中不含有游離的FZD。

圖1 FZD（a）、BSA（b）及FZD-BSA（c）的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of FZD (a), BSA (b) and FZD-BSA (c)

2.1.2 偶聯(lián)產(chǎn)物的紫外分析

圖2 BSA、FZD和FZD-BSA紫外掃描圖Fig.2 UV absorption spectra of BSA, FZD and FZD-BSA

通過(guò)紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果（圖2）可知，BSA在278 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰；FZD在258 nm和364 nm波長(zhǎng)處有主要特征吸收峰；而偶聯(lián)抗原除了在278 nm波長(zhǎng)處有明顯的特征吸收峰外，在360～364 nm波長(zhǎng)處還存在明顯肩峰，這是偶聯(lián)產(chǎn)物中FZD的特征吸收峰，進(jìn)一步證明FZD與載體蛋白BSA偶聯(lián)成功。

2.1.3 偶聯(lián)產(chǎn)物的紅外光譜分析

圖3 FZD、BSA和FZD-BSA紅外光譜圖Fig.3 IR absorption spectra of FZDFZD, BSA, and FZDFZD-BSA

由圖3可知，BSA分別在1 500～1 700 cm－1區(qū)域、2 958～2 925 cm－1區(qū)域以及2 800～3 400 cm－1區(qū)域存在蛋白質(zhì)中酰胺基和胺基伸縮的特征吸收峰。FZD在500～1 700 cm－1區(qū)域有一系列的特征吸收峰，主要為在3 450 cm－1和1 760 cm－1有C＝O特征峰；1 233 cm－1處有C—O—C的特征峰，1 511、1 470、1 388、1 348 cm－1有—NO2特征峰；857、963、1 025、1 106、1 233、1 638 cm－1處有呋喃環(huán)的特征吸收峰。而FZD-BSA除具有上述蛋白質(zhì)的特征吸收峰外，在3 450、500～1 700 cm－1區(qū)域出現(xiàn)與FZD相類(lèi)似的特征吸收峰，分別在3 452、1 638、1 160、1 074、861 cm－1。說(shuō)明FZD-BSA偶聯(lián)抗原成功制備。

2.2 FZD-BSA單克隆抗體的制備

2.2.1 FZD-BSA抗原免疫小鼠

將制備得到的偶聯(lián)抗原免疫小鼠，5 次免疫后獲得的多克隆抗體的最高效價(jià)為1∶306 000，進(jìn)行細(xì)胞融合。2.2.2 重氮化法制備抗原獲得抗體的特異性分析

對(duì)重氮化法制備的人工抗原免疫小鼠后獲得的抗血清，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，對(duì)多克隆抗體針對(duì)FZD的特異性分析。分別加入不同質(zhì)量濃度的FZD還原溶液與檢測(cè)抗原FZD-OVA競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 抗FZD特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合曲線Fig.4 Competitive inhibition standard curve of anti-FZD antibody

由圖4可知，加入還原后的FZD，游離的FZD對(duì)小鼠多抗與檢測(cè)抗原的結(jié)合產(chǎn)生了一定的競(jìng)爭(zhēng)抑制，且隨著FZD質(zhì)量濃度的不斷增大，其與FZD-OVA的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力不斷下降，當(dāng)游離的FZD質(zhì)量濃度達(dá)到8 000 ng/mL后，繼續(xù)增加游離抗原質(zhì)量濃度，F(xiàn)ZD與FZD-OVA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力開(kāi)始趨于平緩，下降不再明顯。

同時(shí)由圖4可看出，當(dāng)FZD質(zhì)量濃度在40～8 000 ng/mL時(shí)，抑制率呈一定的線性關(guān)系。以抑制率為縱坐標(biāo)，F(xiàn)ZD質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線后得到的線性方程為y＝32.147x－45.712（R2＝0.992 2）。以抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為IC50，F(xiàn)ZD的IC50值為0.93 μg/mL，最低檢測(cè)限為53.70 ng/mL。由此可見(jiàn)，以重氮化法制備的FZD-BSA人工抗原可刺激小鼠產(chǎn)生抗FZD的特異性抗體。

2.2.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選

將FZD-BSA人工抗原免疫得到的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。以SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)的上清液作陰性對(duì)照，陽(yáng)性的鼠血清作陽(yáng)性對(duì)照，采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，以A450nm值大于1.4為陽(yáng)性克隆孔。選擇陽(yáng)性較強(qiáng)的單克隆細(xì)胞孔內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。重復(fù)上述步驟，直至得到穩(wěn)定分泌抗FZD的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)過(guò)間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)后，細(xì)胞融合率為83.75%，陽(yáng)性率為50.00%。采用有限稀釋法，對(duì)A450nm值較高，且融合細(xì)胞團(tuán)較少的孔進(jìn)行克隆化培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)3 次克隆化，得到穩(wěn)定分泌FZD的雜交瘤細(xì)胞株。命名為C2-H5。

2.2.4 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液mAb效價(jià)、亞類(lèi)分析

以骨髓瘤細(xì)胞上清液為空白對(duì)照、空白小鼠血清為陰性對(duì)照。采用ELISA法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液mAb效價(jià)，測(cè)得C2-H5的效價(jià)為1∶1 892。

采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定抗FZD單克隆抗體的亞類(lèi)，結(jié)果如圖5所示。雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體與不同類(lèi)別的亞類(lèi)二抗顯色結(jié)果有著明顯差異，其中與IgG2b二抗的A450nm值最高，與IgG1、IgG2a、IgG3的二抗微弱顯色，而與IgA和IgM二抗幾乎不顯色，該細(xì)胞分泌的抗體類(lèi)型以IgG2b為主。

圖5 單抗類(lèi)別及亞類(lèi)的測(cè)定結(jié)果Fig.5 Subclass composition of monoclonal antibody

2.2.5 單克隆抗體的制備及純化細(xì)胞株C2-H5分泌的腹水mAb效價(jià)平均可達(dá)1∶2.49×106。分別將未經(jīng)任何處理和經(jīng)過(guò)預(yù)處理的腹水采用硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化，后者純化效果略?xún)?yōu)于前者，但后者抗體效價(jià)損失較大。C2-H5純化后的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖中均有2 條帶，一條為IgG的重鏈，分子質(zhì)量約65 kD，另一條為輕鏈，分子質(zhì)量約為25 kD。

2.3 包被抗原及單抗工作質(zhì)量濃度的確定包被抗原和單抗質(zhì)量濃度是ELISA測(cè)定方法中影響靈敏度的重要因素，因此選擇合適的包被抗原質(zhì)量濃度和單抗質(zhì)量濃度能有效提高ELISA測(cè)定的重要指標(biāo)。采用了方陣滴定法來(lái)確定最佳的包被抗原質(zhì)量濃度與抗體稀釋倍數(shù)。通過(guò)非間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA表明FZD-OVA

最佳抗原工作質(zhì)量濃度為2 μg/mL。在此包被質(zhì)量濃度下，抗體稀釋倍數(shù)在1∶10 000時(shí)A450nm值在1.0附近，故選擇1∶10 000作為抗體最佳稀釋倍數(shù)。

2.4 單抗與標(biāo)準(zhǔn)品加入次序及最佳作用時(shí)間的確定

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了板內(nèi)外競(jìng)爭(zhēng)的3 種方案。結(jié)果如表1所示，方案A產(chǎn)生的抑制率明顯優(yōu)于方案B與方案C，所以確定將呋喃唑酮與單抗等體積混合后，于板外反應(yīng)60 min，再將混合液加入封閉后洗滌好的酶標(biāo)板上競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)60 min。

表1 FZD標(biāo)準(zhǔn)品與單抗加入次序及作用時(shí)間的確定（A450 nm）Table1 Determination of the addition sequence and reaction time of FZD and mAb (

2.5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

當(dāng)FZD質(zhì)量濃度在10～500 ng/mL范圍時(shí)，抑制率呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。以抑制率為縱坐標(biāo)，F(xiàn)ZD添加質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線后得到線性方程為y＝42.027x－26.143（R2＝0.998 4）。以抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為IC50，F(xiàn)ZD的IC50值為0.06 μg/mL。

2.6 最低檢測(cè)限

在包被好的酶標(biāo)板中隨機(jī)挑選10 孔，按建立好的間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA模式做零標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)。求所得12 個(gè)A450nm值的標(biāo)準(zhǔn)差s，3s位置相應(yīng)的抑制率為9.34%，對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線上FZD的質(zhì)量濃度為6.92 ng/mL，即最低檢測(cè)限為6.92 ng/mL。

2.7 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的精密度

按照1.4.3.5節(jié)的方法，重復(fù)做5 次呋喃唑酮的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，每次做3 個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度做3 個(gè)平行孔，以平行孔的均值作為每次每個(gè)質(zhì)量濃度下的抑制率，得出每個(gè)質(zhì)量濃度下的變異系數(shù)均小于10%，平均誤差為6.54%。實(shí)驗(yàn)表明，該方法具有較好的重現(xiàn)性。

2.8 交叉反應(yīng)率

以重氮化法制備的FZD-OVA作為包被抗原，將FTD、NFT、NFZ、SEM和AOZ分別稀釋成梯度質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)，得出抗呋喃唑酮單克隆抗體與各FZD結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的IC50，計(jì)算出交叉反應(yīng)率，得出抗呋喃唑酮單克隆抗體對(duì)5 種硝基呋喃抗生素的交叉反應(yīng)率均低于0.01%，說(shuō)明篩選到的單抗具有很高的特異性，可有效避免假陽(yáng)性問(wèn)題的出現(xiàn)。

2.9 樣品加標(biāo)回收率

往不含呋喃唑酮的飼料中分別加入FZD使其添加量為10.0、50.0、100.0 μg/g，樣品經(jīng)提取后進(jìn)行ELISA檢測(cè)，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)檢測(cè)3 次，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。FZD樣品的加標(biāo)回收率為76.84%～88.31%，變異系數(shù)9.36%～15.79%。

表2 呋喃唑酮加標(biāo)回收率Table2 Recovery rates of FZD from blank samples

3 結(jié) 論

以重氮化法制備的FZD-BSA為免疫抗原免疫小鼠，獲得的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，篩選到一株穩(wěn)定分泌抗FZD單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞C2-H5。采用動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法，獲得腹水，并進(jìn)行純化。其細(xì)胞培養(yǎng)上清液效價(jià)為1∶1 892；獲得的鼠腹水效價(jià)為1∶2.49×106，蛋白質(zhì)含量為43.36 mg/mL。采用硫酸銨沉淀法對(duì)腹水進(jìn)行純化，純化后抗體效價(jià)為1∶7.06×105，蛋白回收率為16.79%。

對(duì)篩選到的抗呋喃唑酮單抗進(jìn)行了特性鑒定。該單抗為IgG2b類(lèi)，其重鏈約65 kD，輕鏈約25 kD。篩選到的單抗具有良好的特異性，與5 種硝基呋喃抗生素及其代謝物（FTD、NFT、NFZ、SEM、AOZ）的交叉反應(yīng)率均低于0.01%。

建立了基于抗FZD單克隆抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)得最佳抗原工作質(zhì)量濃度為2 μg/mL，最佳抗體稀釋度為1∶10 000，檢測(cè)范圍為10～500 ng/mL，IC50值為0.06 μg/mL，最低檢測(cè)限為6.92 ng/mL。本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法重現(xiàn)性較好，平均誤差為6.54%。樣品加標(biāo)回收率為76.84%～88.31%，變異系數(shù)為9.36%～15.79%。

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Preparation and Application of Monoclonal Antibody against Furazolidone

CHEN Yinnan1, CHEN Hua1, SHI Xianai1,2,*, YE Xiaojun3, FAN Haiping3
(1. College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China; 2. Fujian Key Laboratory of Medical Instrument and Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350002, China; 3. Fresh Water Fisheries Research Institute of Fujian Province, Fuzhou 350002, China)

Based on the hapten of furazolidone (FZD), a monoclonal (mAb)-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method for the detection of FZD was established after the preparation of mAb against FZD-bovine serum albumin (BSA). The linear range for furazolidone detection was 10–500 ng/mL, and the IC50was 0.06 μg/mL with a lowest detection limit of 6.92 ng/mL. Meanwhile, the mAb showed almost no cross reactivity with other nitrofurans or their metabolites. This method had good reproducibility, with an average error of 6.54%. In tested samples, the recovery for furazolidone addition was 76.84%–88.31%.

furazolidone (FZD); monoclonal antibody (mAb); enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

10.7506/spkx1002-6630-201603029

TS207.3

A

1002-6630（2016）03-0157-07

陳蔭楠, 陳華, 石賢愛(ài), 等. 抗呋喃唑酮單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 157-163. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603029. http://www.spkx.net.cn

CHEN Yinnan, CHEN Hua, SHI Xianai, et al. Preparation and application of monoclonal antibody against furazolidone[J]. Food Science, 2016, 37(3): 157-163. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603029. http://www.spkx.net.cn

2015-02-15

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)（201205022-3）；福建省科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2013NZ0003）；福建省海洋與漁業(yè)廳重點(diǎn)項(xiàng)目（閩海漁合同[2010]2-27號(hào)）

陳蔭楠（1991—），女，碩士，研究方向?yàn)槊钢苿┑难邪l(fā)與產(chǎn)業(yè)化。E-mail：165456164@qq.com

*通信作者：石賢愛(ài)（1971—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楦哽`敏度生物檢測(cè)。E-mail：shixa@fzu.edu.cn