冷藏海鱸魚優勢腐敗菌的篩選和鑒定

唐文靜，王楚文，柳云龍，寧喜斌*

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

冷藏海鱸魚優勢腐敗菌的篩選和鑒定

唐文靜，王楚文，柳云龍，寧喜斌*

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

分離鑒定4 ℃冷藏條件下海鱸魚的優勢腐敗菌，通過選擇性培養基篩選獲得單一菌株，對各菌株進行致腐能力的測定，確定冷藏海鱸魚的優勢腐敗菌。對冷藏海 鱸魚的優勢腐 敗菌進行菌落形態觀察及部分生理生化實驗、16S rDNA分子鑒定。結果表明，有4 株冷藏海鱸魚優勢腐敗菌，其中1 株為草莓假單胞菌（Pseu domonas fragi），1 株為腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens），其余2 株為假單胞菌（Pseudomonas sp.）。在4 ℃冷藏條件下，草莓假單胞菌的致腐能力最強，其次是腐敗希瓦氏菌和假單胞菌。

海鱸魚；冷藏；優勢腐敗菌；分離；鑒定

魚類在棲息、捕撈、貯運、加工等過程中受到微生物的污染，腐敗微生物在魚體上生長繁殖是引起魚肉腐敗變質的主要原因，魚類的貨架期受此影響而大大縮短[1]。為了抑制腐敗微生物的活動，目前應用較為廣泛的保鮮方法是冷藏。但是，魚類在冷藏過程中依然深受優勢腐敗菌（specifi c spoilage organism，SSO）的影響，魚體上SSO的生長繁殖主導著魚肉腐敗變質的程度[2]。因此，對冷藏魚肉中SSO的確定，并進行靶向抑制對研究魚肉保鮮顯得尤為重要[3]。經研究發現，魚類的棲息環境和貯運條件影響著魚體上SSO的組成和變化，在有氧冷藏條件下貯藏的鮮魚SSO主要為希瓦氏菌（Shewanella）和（或）假單胞菌（Pseudomonas spp.）[4]。

海鱸魚是我國沿海地區均產的一種重要的經濟魚類[5]，不僅肉質細膩鮮美、少有魚骨，且具有較高的營養價值[6]。隨著海鱸魚產量的逐年提升，依靠活魚銷售的方式已經遠遠不能適應市場的需求，因此海鱸魚在保鮮方面的研究顯得尤為重要，然而目前相關研究還尚少[7]，對冷藏海鱸魚中SSO的研究也鮮有報道。魚類SSO的篩選及鑒定的傳統方法是使用各種選擇性培養基篩選和生理生化實驗的鑒定，隨著檢測技術的發展，研究人員開始使用分子檢測技術檢測鑒定魚類的SSO。Lan Weiqing等[8]利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）檢測了在4 ℃有氧包裝條件下帶魚的SSO；Macé等[9]利用時間溫度梯度凝膠電泳（temporal temperature gradient gel electrophesis，TTGE）檢測了在不同溫度條件下使用氣調包裝大馬哈魚的SSO；Wilson等[10]使用了PCR-限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）檢測了鱈魚在不同季節不同水域里的SSO。

本研究通過使用選擇性培養基和測定菌株的致腐能力確定冷藏海鱸魚的優勢腐敗菌，利用菌落形態觀察及部分生理生化實驗、16S rDNA分子鑒定對冷藏海鱸魚優勢腐敗菌進行鑒定。本實驗可為冷藏海鱸魚的腐敗機理、抑制冷藏海鱸魚的腐敗、冷藏海鱸魚的保鮮研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

海鱸魚（0.6～0.8 kg/尾），購于上海銅川路水產批發市場。

假單胞菌選擇性CFC瓊脂培養基、鐵瓊脂培養基、結晶紫膽鹽葡萄糖中性紅瓊脂（VRBGA）培養基、MRS瓊脂培養基 山東青島海博生物技術有限公司。

1.2 試劑與儀器

營養肉湯、MgO、硼酸、鹽酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

Kjeltec2300 凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落的分離和純化

將鮮活海鱸魚冰猝致死，放置于4 ℃條件下冷藏至腐敗，于無菌條件下稱取25.0 g腐敗魚肉充分研磨，加入225 mL無菌生理鹽水中搖勻制成樣品菌懸液，進行梯度稀釋，選取適宜的稀釋度吸取0.1 mL于各選擇性培養基平板上均勻涂布，假單胞菌選擇性CFC瓊脂培養基平板、鐵瓊脂培養基平板和VRBGA培養基平板分別置于30、28、37 ℃條件下培養，MRS瓊脂培養基平板置于37 ℃條件下厭氧培養，均培養24～48 h。挑選各典型菌落，反復進行平板劃線，得到純化的單菌落后保存。

1.3.2 優勢腐敗菌的篩選

對各菌株進行致腐能力的測定以確定冷藏海鱸魚的優勢腐敗菌，致腐能力的測定由感官評定和揮發性鹽基氮（TVB-N）含量的測定組成。

將保存的各菌株活化后分別制成菌懸液，通過預實驗涂平板確定菌濃度，調整菌濃度為105～106CFU/mL。將無菌海鱸魚塊浸入各菌株的菌懸液中10 s后取出，置于無菌培養皿中，于4 ℃條件下冷藏，分別在0、2、4、6、8 d后進行感官評定，確定疑似優勢腐敗菌。

將疑似優勢腐敗菌活化后分別制成菌懸液，通過預實驗涂平板確定菌濃度，調整菌濃度為105～106CFU/mL。將無菌海鱸魚塊浸入各疑似優勢腐敗菌株的菌懸液中10 s，取出置于無菌培養皿中，放于4 ℃條件下冷藏，在0、2、4、6、8 d時測定TVB-N含量，確定優勢腐敗菌。

1.3.3 無菌魚塊的制備

海鱸魚去鱗、去內臟、清凈后，于無菌條件下，用無菌水沖洗，用75%酒精擦拭魚體，用無菌解剖刀切取背脊部內部無污染魚肉，保持魚塊大小厚度基本一致，每塊無菌魚塊為5 g左右[11-12]。

1.3.4 感官評定

選擇5 名經培訓的感官評定員，對魚塊的外觀和氣味進行評價，感官評定標準如表1所示[13-14]。

表1 感官評定標準Table1 Sensory analysis standards

1.3.5 TVB-N含量的測定

使用Kjeltec2300凱氏定氮儀進行測定，方法參考FOSS應用子報[15]。以40 g/L硼酸為吸收液，0.1 mol/L鹽酸滴定，精確稱取5 g左右碾碎樣品于到750 mL的蒸餾管中，加入1 g MgO和少許去離子水，連接到定氮儀進行測定[16]。

1.3.6 優勢腐敗菌的形態特征和生理生化特征鑒定

對優勢腐敗菌的單菌落進行形態特征觀察和生理生化特征鑒定。生理生化實驗根據《伯杰氏系統細菌學手冊》[17]和《常見細菌系統鑒定手冊》[18]選擇鑒定項目。具體生理生化實驗方法參照《現代細菌學培養基和生化試驗手冊》[19]。

1.3.7 優勢腐敗菌的分子生物學鑒定

將各優勢腐敗菌培養至對數期，使用E z u p柱式基因組D N A抽提試劑盒提取各菌株的總DNA，作為16S rDNA序列擴增反應模板。PCR擴增細菌的16S rDNA基因，PCR體系為引物27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）和模板各1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，完成30 個循環，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取5 μL 16S rDNA 擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗。將PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。使用美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中的BLAST對各菌株序列分析比對，選取同源性在99%以上的菌株序列，利用MEGA 6.05軟件進行多重序列對比，并構建Neighbor-Joining系統發育樹[20-21]。

2 結果與分析

2.1 優勢腐敗菌的分離

樣品 通過稀釋涂布平板和平板劃線分離方法，在假單胞菌選擇性CFC瓊脂培養基平板上依據菌落形態不同分離出5 株菌，編號為P1～P5，鐵瓊脂培養基平板上依據菌落形態不同分離出1 株菌，編號為S1，結晶紫膽鹽葡萄糖中性紅瓊脂培養基平板上依據菌落形態不同分離出菌落形態各異的2 株菌，編號為V1、V2，MRS瓊脂培養基平板上依據菌落形態不同分離出菌落形態各異的2 株菌，編號為L1、L2。

2.2 優勢腐敗菌的腐敗特性

將上述10 株菌活化后制成菌懸液分別接種到無菌海鱸魚塊上，研究冷藏時間對接種各菌株的海鱸魚塊感官評定的影響，結果見圖1。實驗組的感官評定分值均比對照組低，其中接種菌株P2、P3、P4、S1魚塊的感官評分均極顯著（P＜0.01）低于接種其他6 株菌的魚塊。冷藏第4天時，接種菌株P2、P3、P4和S1的魚塊的感官 評分均極顯著（P＜0.01）下降；冷藏第8天時，接種菌株P2、P3、P4和S1的魚塊的感官評分均極顯著（P＜0.01）低于其他接種菌株的魚塊，接種菌株P4的魚塊的感官評分最低，為0.72 分，其次是接種菌株S1的魚塊，為0.76 分。經對比分析，確定菌株P2、P3、P4、S1為冷藏海鱸魚的疑似優勢腐敗菌。

圖1 冷藏時間對接種各菌株的海鱸魚塊感官評定的影響Fig.1 Effect of refrigeration time on sensory analysis of sea bass piece inoculated with various bacteria

將冷藏海鱸魚疑似優勢腐敗菌P2、P3、P4、S1制成菌懸液接種于無菌海鱸魚塊上，研究冷藏時間對接種疑似優勢腐敗菌的海鱸魚塊TVB-N含量的影響，結果見圖2。根據GB/T 18108—2008《鮮海水魚》[22]規定，鮮海水魚的TVB-N含量≤15 mg N/100 g為一級品，TVB-N含量≤20 mg N/100 g為二級品，TVB-N含量≤30 mg N/ 100 g為三級品。

圖2 冷藏時間對接種疑似優勢腐敗菌的海鱸魚塊TVB-N含量的影響Fig.2 Effect of refrigeration time on TVB-N value of sea bass piece inoculated with suspected dominant spoilage bacteria

由圖2可知，冷藏第4天時，接種菌株P2、P3、P4、S1魚塊的TVB-N含量極顯著（P＜0.01）大于對照魚塊，分別為68.81、21.61、95.35、76.52 mg N/100 g；冷藏第6天時，接種菌株P3魚塊的TVB-N含量迅速上升，為121.19 mg N/100 g；冷藏第8天時，接種菌株P2、P3、P4、S1魚塊的TVB-N含量極顯著（P＜0.01）高于對照魚塊，遠遠超過標準規定，且接種菌株P4魚塊的TVB-N含量最高，其次是接種菌株S1、P3、P2的魚塊。經對比分析，確定菌株P2、P3、P4、S1為冷藏海鱸魚的優勢腐敗菌。

2.3 優勢腐敗菌的鑒定

2.3.1 優勢腐敗菌的形態特征及生理生化鑒定觀察冷藏海鱸魚的4 株優勢腐敗菌的形態特征，并進行生理生化實驗，根據《伯杰氏系統細菌學手冊》[17]和《常見細菌系統鑒定手冊》[18]判定結果，結果見表2。

表2 冷藏海鱸魚的優勢腐敗菌的形態特征及生理生化特征Table2 Morphological and physiological characteristics of dominant spoilage bacteria in chilled sea bass

2.3.2 優勢腐敗菌的分子鑒定

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測4 株冷藏海鱸魚優勢腐敗菌的16S rDNA擴增產物，均得到特異性條帶，片段大小為1 500 bp左右，電泳圖譜如圖3所示。

圖3 4 株冷藏海鱸魚優勢腐敗菌的16S rDNA電泳圖譜Fig.3 Electropherogram of 16S rDNA genes from four dominant spoilage bacteria in chilled sea bass

將冷藏海鱸魚的4 株優勢腐敗菌未純化16S rDNA擴增產物送檢測序后，使用NCBI的BLAST分析，選取同源性在99%以上的菌株序列，利用MEGA 6.05軟件進行多重序列對比、構建Neighbor-Joining系統發育樹，細菌系統發育樹見圖4。菌株P2、P3與Pseudomonas sp.親緣關系最近，菌株P4與Pseudomonas fragi親緣關系最近，菌株S1與Shewanella sp.親緣關系最近。

圖4 基于16S rDNA序列同源性的4 株優勢腐敗細菌系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of four dominant spoilage bacteria based on 16S rDNA sequences

結合4 株優勢腐敗菌的菌落形態及部分生理生化實驗和分子鑒定，可判定菌株P2、P3、P4為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），其中菌株P4為草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi），菌株S1為腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）。故4 株優勢腐敗菌分別為Pseudomonas P2、Pseudomonas P3、Pseudomonas fragi P4、Shewanella putrefaciens S1。

3 結論與討論

本研究得出冷藏海鱸魚的優勢腐敗菌主要為假單胞菌和腐敗希瓦氏菌，與其他相關研究結果相似。藍蔚青等[23]對冷藏鯧魚貯藏期間的細菌種群變化進行了研究，研究發現熒光假單胞菌與腐敗希瓦氏菌為鯧魚冷藏期間的優勢腐敗菌。崔正翠等[24]研究了冷藏大菱鲆細菌組成變化和優勢腐敗菌，結果表明在0～10 ℃冷藏過程中大菱鲆的優勢腐敗菌是腐敗希瓦氏菌，其次是假單胞菌。郭全友等[25]對冷藏羅非魚優勢腐敗菌進行了鑒定，確定了假單胞菌為0～10 ℃貯藏羅非魚的優勢腐敗菌。本課題組將對冷藏海鱸魚分離出的優勢腐敗菌進行深入研究，探索各優勢腐敗菌的特征及抑制生長方法，為冷藏海鱸魚的保鮮作參考。

本研究從腐敗冷藏海鱸魚肉中獲得10 株形態各異的菌株，經過菌株致腐能力測定確定菌株P2、P3、P4、S1為冷藏海鱸魚的優勢腐敗菌。在4 ℃冷藏條件下，優勢腐敗菌P4的致腐能力最強，其次是優勢腐敗菌S1、P3，優勢腐敗菌P2的致腐能力最弱。對冷藏海鱸魚的優勢腐敗菌P2、P3、P4、S1進行16S rDNA分子鑒定、菌落形態觀察及部分生理生化實驗鑒別，得到4 株優勢腐敗菌，分別為2 株假單胞菌、1 株草莓假單胞菌和1 株腐敗希瓦氏菌。

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Isolation and Identification of Specific Spoilage Organisms in Chilled Sea Bass

TANG Wenjing, WANG Chuwen, LIU Yunlong, NING Xibin*
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 20 1306, China)

The specifi c spoilage organisms (SSOs) were isolated and identifi ed from chilled sea bass under 4 ℃ refrigerated condition. These SSOs were individually isolated using selective medium and their spoilage ability was analyzed. These isolates were identifi ed based on morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analyses. The results showed there were 4 SSOs present in chilled sea bass, including one Pseudomonas fragi, one Shewanella putrefaciens, and two Pseudomonas sp.. In refrigerated condition at 4 ℃, the spoilage ability of Pseudomonas fragi was the highest, followed by Shewanella putrefaciens and Pseudomonas sp..

sea bass; chilled; specifi c spoilage organism; isolation; identifi cation

10.7506/spkx1002-6630-201603031

TS254.4

A

1002-6630（2016）03-0170-05

唐文靜, 王楚文, 柳云龍, 等. 冷藏海鱸魚優勢腐敗菌的篩選和鑒定[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 170-174. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603031. http://www.spkx.net.cn

TANG Wenjing, WANG Chuwen, LIU Yunlong, et al. Isolation and identification of specific spoilage organisms in chilled sea bass[J]. Food Science, 2016, 37(3): 170-174. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603031. http://www.spkx.net.cn

2015-03-11

上海市科委工程中心建設項目（11DZ2280300）

唐文靜（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：wenjing_24@163.com

*通信作者：寧喜斌（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物、食品安全。E-mail：xbning@shou.edu.cn