光敏化姜黃素的細(xì)胞毒理學(xué)檢驗

武 娟，劉一鳴，李 夏，王靜鳳,*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.山東省青島市第二中學(xué)，山東 青島 266061）

光敏化姜黃素的細(xì)胞毒理學(xué)檢驗

武 娟1，劉一鳴2，李 夏2，王靜鳳1,*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.山東省青島市第二中學(xué)，山東 青島 266061）

探究基于小鼠成纖維L929細(xì)胞的光敏化姜黃素的細(xì)胞毒理學(xué)。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測L929細(xì)胞的相對增殖率，按通用標(biāo)準(zhǔn)評價細(xì)胞毒性；DNA片段化分析及Hoechst細(xì)胞核染色法檢測細(xì)胞凋亡狀況。結(jié)果表明：經(jīng)不同濃度的光敏化姜黃素（5、10、20 μmol/L）處理后，L929細(xì)胞生長良好，呈梭形或不規(guī)則形狀，與對照組相比均無明顯差異；毒性級別為“0”或“1”，即無細(xì)胞毒性；在瓊脂糖凝膠電泳圖上未見“階梯狀”的條帶出現(xiàn)，細(xì)胞核染色后也呈現(xiàn)正常的藍(lán)色，即光敏化姜黃素不會引起L929細(xì)胞凋亡，對L929細(xì)胞沒有毒性。

光敏化姜黃素；細(xì)胞毒性；四甲基偶氮唑藍(lán)實驗；細(xì)胞凋亡

姜黃素是從姜科姜黃屬（Curcuma longa）植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中提取的一種天然黃色酸性酚類物質(zhì)，是姜黃發(fā)揮藥理作用的最主要的活性成分[1-3]。根據(jù)GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定，姜黃素是允許在食品中使用的9 種天然色素之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素是一種新型光敏劑[4-5]，其成本低、無污染、具有光活性，能夠起到殺菌和治療腫瘤的功效[6-7]。相關(guān)文獻(xiàn)報道發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED）藍(lán)色光源波長為470 nm，可以激活姜黃素而發(fā)揮其光敏活性[8-9]。為了將該技術(shù)在日常生活中推廣應(yīng)用，需要對光敏化姜黃素進(jìn)行毒理學(xué)研究。

已有研究報道單純的姜黃素經(jīng)大鼠和小鼠急性毒性實驗確認(rèn)屬于實際無毒物質(zhì)，未見潛在的致突變、致微核及致畸作用，無明顯亞慢性毒性損害作用[10-11]。但是光敏化姜黃素是否無毒需要進(jìn)一步驗證。近年來，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)研究，而整體動物的中毒表現(xiàn)都繼發(fā)于機(jī)體細(xì)胞中出現(xiàn)的改變，所以直接觀察受試物對細(xì)胞的作用應(yīng)看作是對其毒理學(xué)本質(zhì)的研究[12]。雖然離體培養(yǎng)細(xì)胞沒有完整機(jī)體所存在的神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)作用的影響，但卻有利于準(zhǔn)確控制其外環(huán)境的理化因素，能夠在穩(wěn)定的條件下觀察離體培養(yǎng)細(xì)胞對化學(xué)物質(zhì)毒性作用的反應(yīng)，可以在其他體外毒性評價實驗系統(tǒng)和整體動物系統(tǒng)之間起到填補差距的橋梁作用[12]。小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系是研究細(xì)胞毒理學(xué)的常用細(xì)胞系[13-17]。在此基礎(chǔ)上，本實驗將光敏化姜黃素作用于L929細(xì)胞系，初步評價其細(xì)胞毒理學(xué)，為探究光敏化姜黃素的食用安全性以及姜黃素介導(dǎo)的光動力非熱力殺菌技術(shù)在日常生活中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素（食品級添加劑） 陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系由中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院贈予。

DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛血清 美國HyClone公司；青霉素-硫酸鏈霉素雙抗混合液（100×） 江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine]ethanesulfonic acid，HEPES）緩沖液 德國Sigma公司；DNA Marker DL2000 日本TaKaRa生物工程有限公司；組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）袋裝預(yù)混試劑 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；二甲基亞砜 上海偉進(jìn)生物科技有限公司；瓊脂糖 美國Lonza Rockland公司；6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國Corning公司；細(xì)胞培養(yǎng)基除菌過濾器 美國Millipore公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)安泰公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；Fluo ViewTM FV1000顯微鏡日本Olympus公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國NuAire公司；Tanon凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；激光共聚焦顯微鏡 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所；LED新型光源系統(tǒng)（470 nm的藍(lán)色光源，光功率密度60 mW/cm2）香港中文大學(xué)中醫(yī)學(xué)院。

1.3 方法

1.3.1 L929細(xì)胞培養(yǎng)

本實驗選用細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系，用含10%新生牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并消化傳代。

1.3.2 光敏化姜黃素的樣品制備

將姜黃素樣品分成實驗組和對照組，實驗組為光敏化姜黃素實驗組（添加LED光照的姜黃素，L＋S＋組），對照組包括單純LED光照組（添加LED光照的溶劑，L＋S－組）、單純姜黃素處理組（添加不光照的姜黃素，L－S＋組）和空白對照組（不加姜黃素，不光照，L－S－組）。其中L＋S＋組的光敏化姜黃素設(shè)置為5、10、20 μmol/L 3 個濃度組[18]。姜黃素由食品級乙醇溶解，儲備液濃度為20 mmol/L。用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋后，于波長為470 nm的LED藍(lán)色光源下（光功率密度60 mW/cm2）光照1 min，即光能量密度為3.6 J/cm2。光動力處理之后，0.22 μm無菌濾膜過濾，待用。

1.3.3 樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)

L929細(xì)胞復(fù)蘇傳代后，于對數(shù)生長期用0.25%胰酶消化后吹散，作細(xì)胞計數(shù)，用含10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至0.2×105個/mL[19]。用微量移液器以100 μL/孔置于96 孔板中復(fù)種6 孔，L－S－組只加含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下貼壁生長24 h。添加光敏化姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72、96 h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4 四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）實驗及毒性評分

分別于24、48、72、96 h后各取出一塊培養(yǎng)板，吸棄細(xì)胞上清液，每孔加200 μL MTT溶液（MTT溶于DMEM（1∶8，m/V）），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，每孔加入150 μL酸化異丙醇溶液，充分溶解細(xì)胞沉淀，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定吸光度。按照公式（1）計算L929細(xì)胞的相對增殖率（relative growth rate，RGR）[19]。

根據(jù)計算所得RGR值按表1所示的評分標(biāo)準(zhǔn)定出光敏化姜黃素的毒性級別。0 級和1 級被認(rèn)為沒有細(xì)胞毒性，2 級為具有輕度細(xì)胞毒性或結(jié)合細(xì)胞形態(tài)綜合評價，3 級和4 級為具有中度細(xì)胞毒性，5 級為具有明顯的細(xì)胞毒性，3～5 級為不合格材料。

表1 細(xì)胞毒性評分標(biāo)準(zhǔn)Table1 Cytotoxicity grades and corresponding relative growth rates

1.3.5 細(xì)胞DNA的提取及片段化分析[20]

以光敏化姜黃素處理L929細(xì)胞，培養(yǎng)96 h后收集細(xì)胞，按照組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取出的DNA用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠在100 V電泳1 h，紫外燈下拍照。

1.3.6 Hoechst細(xì)胞核染色

取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5 min，用無菌的PBS洗滌3 遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌1 遍。將蓋玻片置于6 孔板內(nèi)，L929細(xì)胞復(fù)蘇傳代后，于對數(shù)生長期用0.25%胰酶消化后吹散，作細(xì)胞計數(shù)，用含10%新生牛血清的DMEM高塘培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至0.2×105個/mL[19]。以2 mL/孔置于6 孔板中復(fù)種6 孔，在5% CO2、37 ℃標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下貼壁生長24 h。以光敏化姜黃素處理L929細(xì)胞，培養(yǎng)96 h后吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液固定10 min。去固定液，用PBS于搖床上洗兩遍，每次3 min。吸盡液體，加入0.5 mL Hoechst染色液，于搖床上染色5 min。去染色液，用PBS于搖床上洗兩遍，每次3 min。吸盡液體，將貼有細(xì)胞的蓋玻片用鑷子夾出，于熒光顯微鏡下觀察拍照，激發(fā)波長350 nm左右，發(fā)射波長460 nm左右。凋亡的細(xì)胞經(jīng)染色后，在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈致密濃染或碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白，而正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色。每個樣品隨機(jī)計數(shù)4 個視野，按照公式（2）計算細(xì)胞凋亡率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 光敏化姜黃素對L929細(xì)胞形態(tài)的影響

以不同濃度（5、10、20 μmol/L）的光敏化姜黃素處理L929細(xì)胞，經(jīng)過24、48、72、96 h孵育之后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。由圖1可知，在不同濃度的光敏化姜黃素處理下，L929細(xì)胞生長良好，呈梭形或不規(guī)則形狀，與3 個對照組相比均無明顯差異。參照形態(tài)分析標(biāo)準(zhǔn)，初步證實濃度低于20 μmol/L的光敏化姜黃素是沒有細(xì)胞毒性的。

圖1 倒置顯微鏡下L929細(xì)胞的形態(tài)觀察（×1100）Fig.1 Morphology of L929 cells under inverted microscope (× 10)

2.2 光敏化姜黃素對L929細(xì)胞增殖的影響及毒性評分

20 μmol/L以下的光敏化姜黃素對L929細(xì)胞形態(tài)沒有顯著影響，進(jìn)而以5、10、20 μmol/L光敏化姜黃素處理L929細(xì)胞一段時間（24、48、72、96 h）之后，評價其對L929細(xì)胞相對增殖率的影響及毒性評分。

圖2 MTT檢測光敏化姜黃素對L929細(xì)胞增殖率的影響Fig.2 Effect of photoactivated curcumin on L929 cell proliferation rate by MTT detection

由圖2可知，經(jīng)MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)，L＋S＋組的A570nm與3 個對照組相比均沒有顯著差異（孵育相同時間組內(nèi)相比）；由表2可知，L929細(xì)胞的相對增殖率雖有所降低，但與3 個對照組相比均無顯著差異，均屬RGR分級標(biāo)準(zhǔn)的“0”級或“1”級，再次證實了低于20 μmol/L的光敏化姜黃素?zé)o細(xì)胞毒性。

表2 L929細(xì)胞的相對增殖率及姜黃素毒性評分Table2 Relative growth rates of L929 cells and corresponding toxicity scoorreess

2.3 光敏化姜黃素對L929細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞核內(nèi)的內(nèi)切核酸酶被活化，將DNA鏈在核小體連接區(qū)域切斷，形成若干（180～200 bp）n寡聚核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)階梯狀圖譜，這被作為判斷細(xì)胞凋亡是否發(fā)生的客觀依據(jù)之一[20]。如圖3所示，以不同濃度（5、10、20 μmol/L）的光敏化姜黃素處理L929細(xì)胞96 h之后，沒有發(fā)現(xiàn)DNA的典型梯狀條帶出現(xiàn)，以上結(jié)果提示濃度低于20 μmol/L的光敏化姜黃素不會引起L929細(xì)胞凋亡。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳分析L929細(xì)胞DNA片段化Fig.3 DNA fragmentation analysis of L929 cells by agarose gel electrophoresis

Hoechst細(xì)胞核染料是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低。它是一種特異性DNA染料，在活細(xì)胞中DNA聚A-T序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)會固縮。細(xì)胞經(jīng)染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的顆粒塊狀熒光[21-22]。如圖4所示，以不同濃度（5、10、20 μmol/L）的光敏化姜黃素作用L929細(xì)胞96 h之后，經(jīng)細(xì)胞核染色發(fā)現(xiàn)光敏化姜黃素實驗組的細(xì)胞核染色狀況與3 個對照組相比沒有明顯的變化。每個樣品隨機(jī)計數(shù)4 個視野的細(xì)胞凋亡率，統(tǒng)計結(jié)果如圖5所示，空白對照組的細(xì)胞在培養(yǎng)96 h后存在一定凋亡，不同濃度的光敏化姜黃素實驗組的細(xì)胞凋亡率與空白對照組相比沒有顯著差異，再次驗證了濃度低于20 μmol/L的光敏化姜黃素不會引起L929細(xì)胞凋亡。

圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察L929細(xì)胞核染色Fig.4 L929 nuclear staining observed under CLSM

圖5 L929細(xì)胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rate of L929 cells

3 討 論

大量研究表明，姜黃素具有廣譜的生理以及藥理作用，具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化和抗癌效應(yīng)，而且對正常細(xì)胞的殺傷作用不敏感。由于姜黃素具有抗癌譜廣、毒副作用小的優(yōu)點，已成為目前抗癌藥物的研究熱點。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)光敏化姜黃素能更加有效地殺滅惡性腫瘤細(xì)胞。例如，曾霞波等[8]研究證實，光敏化姜黃素能有效殺傷和抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長。王杜娟等[23]證實光敏化姜黃素可顯著誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。田斌強(qiáng)等[24]研究表明，姜黃素能明顯抑制膀胱癌細(xì)胞系UMUC2的生長并誘導(dǎo)其凋亡。近些年，研究者們又逐漸將光敏化姜黃素應(yīng)用于殺滅致病性微生物[25-27]。本課題組前期的研究證實，濃度為5、10、20 μmol/L的光敏化姜黃素對食品中的微生物有較好的滅活效果[28]。為了將光敏化姜黃素在日常生活中推廣應(yīng)用，需驗證其具有食用安全性。然而，迄今為止，光敏化姜黃素的毒理學(xué)評價尚未見報道。

細(xì)胞毒理學(xué)是研究外源性物質(zhì)對細(xì)胞損傷作用規(guī)律及其機(jī)制的毒理學(xué)分支學(xué)科，它可以用于食品安全毒理學(xué)的評價、食品中有害物質(zhì)的毒作用機(jī)理研究、食品加工生產(chǎn)中有毒有害物質(zhì)的檢測、功能性食品中功效成分的活性研究等[29-30]。細(xì)胞毒理學(xué)的研究方法有多種，包括對細(xì)胞的活 性影響和遺傳學(xué)影響、造成細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化以及細(xì)胞凋亡檢測。目前在食品領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛的細(xì)胞毒理學(xué)方法有MTT比色實驗、細(xì)胞DNA合成測定法、Western blotting法、流式細(xì)胞術(shù)測定法等[29]。Pi oletti等[31]認(rèn)為，當(dāng)受試物與細(xì)胞共培養(yǎng)時，一旦受試物有毒，細(xì)胞的增殖情況和形態(tài)就 會發(fā)生改變。本研究結(jié)果表明，以濃度為5、10、20 μmol/L的光敏化姜黃素孵育L92 9細(xì)胞一段時間后，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，與對照組相比無明顯差異，即光敏化姜黃素?zé)o細(xì)胞毒性。上述結(jié)果將為開展光敏化姜黃素在食品、餐具和桌面等消毒中的應(yīng)用提供了依據(jù)。但本研究只是對光敏化姜黃素的細(xì)胞毒性進(jìn)行了初探，其食用安全性尚有待于通過開展動物及人體毒理學(xué)實驗進(jìn)一步驗證。

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Cytotoxicological Test of Photoactivated Curcumin

WU Juan1, LIU Yiming2, LI Xia2, WANG Jingfeng1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Qingdao No.2 Middle School of Shandong Province, Qingdao 266061, China)

The main purpose of this research was to explore the cytotoxicity of photoactivated curcumin based on fibroblast cell line L929. The cell morphology was examined by an inverted microscope, relative growth rate (RGR, %) was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method, cytotoxicity was evaluated according to the general standard, and cell apoptosis was detected by DNA ladder analysis and Hoechst nuclear staining, respectively. Results showed that photoactivated curcumin did not affect cell morphology, which was fusiform or irregular in shape and had no significant difference when compared with the control group. It had no cytotoxicity with the toxicity grade “0” or “1”, and did not cause apoptosis according to DNA ladder analysis and Hoechst nuclear staining. This study confirmed that photoactivated curcumin had no toxicity to L929 cells at the concentrations of 5, 10 and 20 μmol/L. These results will lay a foundation for exploring the safety of consumption of photoactivated curcumin and provide the theory basis for the popularization and application of curcumin-mediated photodynamic non-thermal sterilization technology in daily life.

photoactivated curcumin; cytotoxicity; methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay; apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201603037

TS201.6

A

1002-6630（2016）03-0205-06

武娟, 劉一鳴, 李夏, 等. 光敏化姜黃素的細(xì)胞毒理學(xué)檢驗[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 205-210. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603037. http://www.spkx.net.cn

WU Juan, LIU Yiming, LI Xia, et al. Cytotoxicological test of photoactivated curcumin[J]. Food Science, 2016, 37(3): 205-210. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603037. http://www.spkx.net.cn

2015-04-24

海洋公益性行業(yè)科研專項（201105029）

武娟（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與營養(yǎng)。E-mail：932837429@qq.com

*通信作者：王靜鳳（1964—），女，教授，博士，研究方向為海洋食品功效成分的分子營養(yǎng)學(xué)。E-mail：jfwang@ouc.edu.cn