miR-34a改變自噬通路AMPK/mTOR的活性在心肌細胞肥大中的作用

黃炯華，林育輝，戴文軍，伍金雷，謝文杰，陳永權

miR-34a改變自噬通路AMPK/mTOR的活性在心肌細胞肥大中的作用

黃炯華△，林育輝，戴文軍，伍金雷，謝文杰，陳永權

目的研究miR-34a與自噬通路磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶點（mTOR）在血管緊張素（Ang）Ⅱ誘導的原代大鼠心肌細胞肥大中的作用。方法體外培養原代大鼠心肌細胞，分成3組:陰性對照慢病毒（NC）組、AngⅡ刺激+陰性對照慢病毒（AngⅡ+NC）組、AngⅡ刺激+miR-34a過表達慢病毒（AngⅡ+miR-34a）組。激光共聚焦檢測心肌細胞肥大變化；利用熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測miR-34a、心房鈉尿肽（ANP）和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）表達；利用蛋白印跡（Western blot）測定AMPK/mTOR信號通路的活性變化。結果與NC組比較，AngⅡ+NC組心肌細胞表面積明顯增大（P＜0.05）；與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組心肌細胞表面積減少（P＜0.05）。與NC組比較，AngⅡ+NC組的miR-34a表達下調，ANP和β-MHC表達上調（均P＜0.05）；而與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組的miR-34a表達上調，ANP和β-MHC表達下調（均P＜0.05）。與NC組比較，AngⅡ+NC組p-AMPK/AMPK增加，p-mTOR/mTOR減少（均P＜0.05）；與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組p-AMPK/AMPK減少，p-mTOR/mTOR增加（均P＜0.05）。結論miR-34a能抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，其作用部分是通過改變AMPK/mTOR的活性來實現的。

肌細胞，心臟；心肌病，肥厚性；血管緊張素Ⅱ；疾病模型，動物；自噬通路磷酸腺苷蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶點；miR-34a

心肌肥厚是心臟應對各種壓力負荷刺激的早期代償改變。在細胞水平上，主要表現為心肌細胞肥大和細胞基質重構；而在分子水平上，主要表現為肥厚基因的表達增加［1］。microRNA（miR）是生物體內的非編碼小分子RNA，常常參與不同疾病的發生和發展［2］。血管緊張素（Ang）Ⅱ是心肌肥厚的重要啟動因子，可促進心肌肥厚的發生和發展［3］。筆者前期實驗證實，肥厚的心肌組織存在miR-34a表達的異常改變；同時在進一步的AngⅡ誘導心肌細胞肥大模型中發現，miR-34a可通過誘導心肌細胞自噬的改變來調控心肌細胞的肥大［4］。既往實驗表明，磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶點（mTOR）是細胞自噬調控的重要信號通路，其活性的改變參與多種疾病的進展［5-7］。然而，在心肌細胞中，自噬信號通路AMPK/mTOR的活性改變是否參與了miR-34a調控心肌細胞肥大的作用仍不明確。因此，本研究以AngⅡ誘導的心肌細胞肥大原代大鼠為模型，初步探討miR-34a與AMPK/mTOR自噬信號通路的改變對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大的作用。

1 材料與方法

1.1 材料（1）動物。體質量5～8 g的SPF級SD乳鼠30只，出生1～3 d。（2）藥品與試劑。培養基、0.25%不含EDTA的胰酶、5-溴脫氧尿核苷、青霉素+鏈霉素及胎牛血清購自美國GIBCO公司；AngⅡ購自美國Sigma公司；miR-34a過表達慢病毒及陰性對照病毒載體購自上海吉瑪公司；激光共聚焦所用的Alexa Fluor555 Phalloidin染色劑、DAPI溶液及總RNA抽提試劑液Trizol購自美國Invitrogen公司；miR-34a引物序列由上海生物工程公司設計并合成；RNA逆轉錄及熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Western blot相關試劑購自上海索萊寶生物科技有限公司；細胞裂解液NP-40及Western發光試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；PVDF膜購自瑞士羅氏公司；辣根過氧化物二抗購自武漢博爾德科技發展有限公司；磷酸化的磷酸腺苷蛋白激酶（p-AMPK）、AMPK、磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶點（phosphop-mammalian target of rapamycinm，p-mTOR）和mTOR抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購自美國Epitomics公司。（3）主要儀器。生化培養箱（上海一恒科技有限公司）、超凈工作臺（蘇州凈化Sw-CJ-2FB型）、電熱恒溫水浴箱（上海躍進醫療器械一廠）、細胞CO2培養箱（美國Thermo Scientific）、恒溫空氣浴搖床（上海福瑪實驗設備有限公司）、激光共聚焦檢測儀Zeiss LSM 710 confocal microscope（德國Carl Zeiss）、熒光定量PCR儀（美國ABI7500）。

1.2 細胞培養和分組乳鼠心臟組織經胰酶逐級消化，獲取原代大鼠心肌細胞后參照文獻［8］進行培養。根據不同的處理分成3組。（1）陰性對照慢病毒（NC）組。心肌細胞以4× 105個心肌細胞數加入20 μL陰性病毒液和病毒感染增強劑凝聚胺，最終濃度為5 mg/L。（2）陰性對照慢病毒感染+AngⅡ刺激（AngⅡ+NC）組。心肌細胞以4×105個細胞數加入20 μL陰性病毒液和病毒感染增強劑凝聚胺，使得其終濃度為5 mg/L，同時加入1×10-6mol/L的AngⅡ刺激心肌細胞。（3）AngⅡ刺激+miR-34a過表達慢病毒感染（AngⅡ+miR-34a）組。心肌細胞以4×105個細胞數加入20 μL的miR-34a過表達病毒液和病毒感染增強劑凝聚胺，使得其終濃度為5 mg/L，同時加入1×10-6mol/L的AngⅡ刺激心肌細胞。其中，陰性慢病毒載體序列:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3′，miR-34a慢病毒過表達序列:5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3′。

1.3 激光共聚焦檢測心肌細胞表面積心肌細胞常規培養，3組分別處理心肌細胞72 h后，棄培養基，用PBS清洗細胞3次，在常溫下加入3.7%多聚乙醛進行孵育，并用PBS-T稀釋的1%Trion X進行孵育15 min破膜。心肌細胞用購自美國Invitrogen公司按1∶35稀釋的Alexa Fluor555 Phalloidin孵育25 min進行染色；加入濃度為300 nmol/L的DAPI溶液進行復染色5 min。心肌細胞圖像通過LSM 710的激光共聚焦儀獲取。每次獨立實驗中，每組各取3孔細胞進行處理，重復3次實驗。每孔細胞樣品隨機獲取5個不同視野的圖片，并通過Image-Pro Plus 6.0軟件測量3次實驗的細胞表面積，并計算其相對平均表面積。

1.4 熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測miR-34a、心房鈉尿肽（ANP）和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）的表達常規培養心肌細胞，各組處理心肌細胞24 h后，棄培養基，加入1 mL Trizol試劑混勻，置1.5 mL離心管中；加入0.2 mL氯仿，混勻，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液加入0.4 mL異丙醇混勻，靜置10 min，12 000 r/min離心20 min，棄盡上清液，75%乙醇1 mL洗滌3遍；7 500 r/min離心5 min，棄盡上清液；加入DEPC水完全溶解，紫外分光光度計計算其濃度及完整性。按試劑盒配成20 μL反轉錄體系，制成cDNA保存于-80℃；按試劑盒配成20 μL擴增體系。反應條件: 95℃30 s，95℃5 s，62℃20 s，40個循環。引物序列見表1。

1.5 Western blot檢測信號通路AMPK/mTOR的活性變化采用NP-40裂解液抽提心肌細胞蛋白并通過BCA法測定。取40 μg蛋白進行電泳分離和轉膜。將承載有目的蛋白膜用5%脫脂奶粉進行封閉1 h，加入購自Cell Signaling Technology公司的抗體p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR和單克隆抗體GAPDH于4℃孵育過夜。孵育過夜的蛋白膜用PBS-T液洗滌后加入免疫二抗體進行孵育免疫共沉淀反應。免疫復合物曝光獲取底片。各蛋白表達量用內對照蛋白GAPDH標準化后獲得。

1.6 統計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 過表達miR-34a對AngⅡ誘導心肌細胞肥大的作用NC組、AngⅡ+NC組、AngⅡ+miR-34a組的相對心肌細胞表面積分別為0.99±0.10、1.74± 0.06及1.15±0.19，組間差異有統計學意義（F= 23.21，P＜0.01），其中AngⅡ+NC組較NC組的相對心肌表面積明顯增加，AngⅡ+miR-34a組較AngⅡ+ NC組的相對心肌表面積明顯減少（均P＜0.05），見圖1。

2.2 各組心肌細胞miR-34a表達情況比較NC組、AngⅡ+NC組、AngⅡ+miR-34a組的miR-34a的相對表達量分別為（1.00±0.05）、（0.49±0.08）及（1.22±0.12），組間差異有統計學意義（F=32.3，P＜0.01），其中AngⅡ+NC組較NC組的miR-34a表達受到明顯抑制，AngⅡ+miR-34a組較AngⅡ+NC組miR-34a表達上調（均P＜0.05）。

2.3 過表達miR-34a對AngⅡ介導的肥厚相關基因表達的影響與NC組比較，AngⅡ+NC組ANP和β-MHC表達增加（P＜0.05）；與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組ANP和β-MHC的表達減少（P＜0.05），見表2。

Tab.2Comparison of the effect of over-expressed miR-34a on ANP and β-MHC expression between different groups表2 過表達miR-34a對ANP和β-MHC表達的影響

2.4 各組miR-34a改變對信號通路AMPK/mTOR活性的作用比較與NC組比較，AngⅡ+NC組AMPK、mTOR表達無變化，而p-AMPK表達上調，p-mTOR表達下調（P＜0.05）；與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組AMPK、mTOR表達無變化，但可減少p-AMPK表達，增加p-mTOR表達（P＜0.05），見圖2。

Fig.2The effect of altered miR-34a on the activity of AMPK/mTOR signal pathway in different groups圖2 miR-34a改變對AMPK/mTOR信號通路活性的影響

3 討論

通常情況下，誘導miR-34a表達變化，在不同細胞中的病理作用是不一樣的。在氚水介導內皮細胞毒性研究中表明，過表達miR-34a可促進內皮細胞損傷［9］。既往實驗證實，在食管癌細胞中，過表達miR-34a可抑制癌細胞的遷移和增殖［10］。然而，在彌漫性大B淋巴瘤中，miR-34a的表達抑制可消弱阿奇霉素的療效性［11］。此外，在前列腺癌細胞耐藥性研究中顯示，抑制miR-34a表達會增加前列腺癌細胞對化學藥物的耐受性［12］。本研究結果顯示，AngⅡ+NC組較NC組的相對心肌細胞表面積明顯增加，AngⅡ+miR-34a組較AngⅡ+NC組的相對心肌細胞表面積明顯減少；AngⅡ+NC組較NC組的miR-34a表達受到明顯抑制，AngⅡ+miR-34a組較AngⅡ+NC組miR-34a表達上調，表明AngⅡ可刺激心肌細胞表面積增加和肥厚基因表達增多，同時抑制miR-34a表達，提示miR-34a表達的減少可能是促進AngⅡ刺激心肌細胞肥大的重要因素，誘導miR-34a的表達，可以抑制AngⅡ刺激的心肌細胞肥大。

同時，筆者既往實驗表明，miR-34a可通過誘導心肌自噬變化調控心肌細胞肥大［4］。但是，其作用機制是否存在自噬活性通路的參與尚未明確。

其實，新近研究表明，在不同的細胞中，AMPK/ mTOR信號通路的活性改變可參與不同疾病的調控作用。譬如，在4-O-甲基-殼二孢氯素誘導人白血病細胞凋亡中的研究表明，細胞凋亡的發生依賴AMPK/mTOR信號通路的活性改變［13］。另外，乳腺癌細胞能在低氧狀態下存活，有賴于AMPK/mTOR信號蛋白的活性變化來維持［14］。此外，一項關于順鉑治療腺細胞肺癌的研究中發現，其對順鉑化療耐藥的重要機制是AMPK/mTOR信號的激活［15］。本研究結果顯示，與NC組比較，AngⅡ+NC組AMPK、mTOR表達無變化，而p-AMPK表達上調，p-mTOR表達減少；與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組AMPK、mTOR表達無變化，但可減少p-AMPK表達，增加p-mTOR表達，表明在AngⅡ刺激心肌細胞肥大中，AMPK和mTOR表達無差異，而AMPK磷酸化加劇，mTOR磷酸化減弱，推測AMPK/mTOR信號通路活性的變化參與了心肌肥大的調控作用，這與既往實驗結果一致［16］。因此，筆者認為，通過慢病毒過表達miR-34a，可抑制AngⅡ誘導AMPK和mTOR磷酸化的改變，miR-34a可調控AngⅡ誘導AMPK/mTOR的活性變化。

綜上所述，AngⅡ刺激的心肌細胞肥大中，存在miR-34a的表達及AMPK/mTOR信號通路活性的改變；過表達miR-34a可抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，其作用是通過改變AMPK/mTOR信號通路的活性來實現的。

（圖1見插頁）

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（2016-05-17收稿2016-06-16修回）

（本文編輯陸榮展）

The role of miR-34a in AngⅡinduced myocardial hypertrophy via alteration of AMPK/mTOR signal pathway

HUANG Jionghua△，LIN Yuhui，DAI Wenjun，WU Jinlei，XIE Wenjie，CHEN Yongquan
Department of Cardiology，the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510150，China△

ObjectiveTo explore the effects of miR-34a and the alteration of AMPK/mTOR signal pathway on angiotensin（Ang）Ⅱ-stimulated cardiomyocytes hypertrophy.MethodsNeonatal rat cardiomyocytes were cultrued in vitro and were divided into 3 groups:negative control for lentivirus carrying miR-34a group（NC），AngⅡplus lentivirus carrying negative control group（AngⅡ+NC）and AngⅡplus lentivirus carrying miR-34a group（AngⅡ+miR-34a）.The relative cell area was detected by confocal microscopy.The expression of miR-34a and hypertrophy-related genes（ANP and β-MHC）were analyzed by real time PCR.The AMPK/mTOR signal pathway was measured by Western blot assay.Results Compared to NC group，the relative cell area was increased in AngⅡ+NC group（P＜0.05）.But compared with AngⅡ+NC group，the relative cell area was decreased in AngII+miR-34a group（P＜0.05）.Moreover，compared with NC group，the expression of miR-34a was decreased，and the expression of hyperthophy-related genes（ANP and β-MHC）was upregulated in AngⅡ+NC group.However，the expression of miR-34a was decreased，and the expression of hyperthophyrelated genes（ANP and β-MHC）was down-regulated（P＜0.05）.Finally，compared to NC group，the ratio of phosphop-AMPK/AMPK was significantly induced in AngII+NC group，but the ratio of phosphop-mTOR/mTOR was significantly decreased（P＜0.05）.However，compared to AngⅡ+NC group，the ratio of phosphop-AMPK/AMPK was significantly decreased in AngII+miR-34a group，but the ratio of phosphop-mTOR/mTOR was significantly increased（P＜0.05）. ConclusionmiR-34a is able to inhibit myocardial hypertrophy of neonatal rat cardiomyocytes，and its mechanism is partly carried out by the alteration of the signal pathway of AMPK/mTOR.

myocytes，cardiac；cardiomyopathy，hypertrophic；angiotensinⅡ；disease models，animal；AMPK/mTOR；miR-34a

R541

A

10.11958/20160435

廣東省自然科學基金項目（2015A030310068）；廣州醫科大學博士啟動基金項目（2014C37）

廣州醫科大學附屬第三醫院心血管內科（郵編510150）

黃炯華（1984），男，博士，主要從事心肌肥厚的作用機制及臨床相關研究

△通訊作者E-mail:mdhjh2014@126.com