香葉醇對大鼠頸動脈球囊損傷后血管內膜增生的抑制作用

江金垚，徐西子

香葉醇對大鼠頸動脈球囊損傷后血管內膜增生的抑制作用

江金垚，徐西子

目的研究香葉醇對球囊損傷大鼠頸動脈損傷后血管內膜新生的影響及可能的機制。方法20只雄性成年SD大鼠，隨機均分為4組。（1）假手術組:不予以球囊損傷。（2）對照組:予以球囊損傷，不予以藥物干預。（3）低濃度組:球囊損傷后每日口服香葉醇50 mg/kg。（4）高濃度組:球囊損傷后每日口服香葉醇200 mg/kg。制作球囊損傷模型，2周后留取球囊損傷段血管制作病理切片，蘇木精-伊紅（HE）染色法測量內膜與中膜（I/M）比值，免疫組化法檢測增殖細胞核抗原（PCNA）的表達，用積分光密度（IOD）值表示，并測定組織中氧化應激標志物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）和脂質氧化產物丙二醛（MDA）的水平。結果與假手術組比較，對照組I/M比值、IOD值、8-OHdG及MDA水平均升高；與對照組比較，低濃度組I/M比值、IOD值、8-OHdG均降低，但MDA水平與對照組差異無統計學意義。高濃度組與對照組比較I/M比值、IOD值、8-OHdG及MDA水平均降低，且較低濃度降低更明顯（P＜O.05）。結論香葉醇抑制大鼠頸動脈球囊損傷后內膜增生，其機制可能與下調PCNA蛋白表達，抑制活性氧的產生有關。

頸動脈損傷；血管內膜；氧化性應激；大鼠，Sprague-Dawley；疾病模型，動物；香葉醇

經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）是當前治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要手段，但PCI治療易產生支架內再狹窄（in-stent restenosis，ISR）。盡管支架制作工藝的不斷改進使ISR發生率從最初裸金屬支架時代的40%～50%降至目前藥物涂層支架時代的5%～10%，但研究顯示ISR仍是PCI術后的主要并發癥［1］。因此，尋求新的方法預防PCI術后再狹窄具有重要意義。香葉醇是一種天然植物醇，具有抗增殖［2］、阻滯細胞周期［3］、抗氧化應激［4］、誘導凋亡［5］等作用。最近研究顯示，香葉醇能顯著降低血漿總膽固醇、三酰甘油水平［6］及脂肪代謝酶的表達［7］，表明其具有抗動脈粥樣硬化的心血管保護作用。但是，目前尚少見有關香葉醇是否有抗ISR作用的研究。本研究通過建立大鼠頸動脈球囊損傷模型，觀察香葉醇對球囊損傷之后血管新生內膜形成的影響，探討其可能的分子生物學機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料清潔級成年雄性SD大鼠20只，體質量（280±5）g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。Cordis 2F球囊導管、香葉醇（Sigma公司，美國），增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）免疫組化試劑盒（博士德生物工程，中國），丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程，中國），8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）檢測試劑盒（Biosouce公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 頸動脈球囊損傷模型制備大鼠腹腔注射體積分數3.6%的水合氯醛（1 mL/100 g）麻醉，備皮消毒，沿頸前正中切口切開頸部皮膚，游離左側頸動脈，結扎頸外動脈遠端，血管夾夾閉近心端頸總動脈及頸內動脈，切開頸外動脈，自切口處插入直徑2F球囊導管至頸總動脈，以1.3 kg/cm2壓力擴張球囊，并來回抽拉3～4次，使頸總動脈血管內皮損傷，退出球囊導管，結扎頸外動脈近端，移除頸總動脈及頸內動脈血管夾恢復血流，制備模型備用。

1.2.2 實驗分組和處理20只大鼠隨機數字表法均分為4組，每組5只。（1）假手術組:不予以球囊損傷。（2）對照組:予以球囊損傷，不予以藥物干預。（3）低濃度組:球囊損傷后每日口服香葉醇50 mg/kg。（4）高濃度組:球囊損傷后每日口服香葉醇200 mg/kg。通過對照組與假手術組比較觀察球囊損傷對血管內膜增生的刺激作用，通過低、高濃度組與對照組比較觀察不同濃度香葉醇對球囊損傷后血管內膜增生的抑制作用。各組大鼠喂養2周后腹腔注射苯巴比妥處死，留取球囊損傷血管段，部分保存于4%甲醛以備形態學及免疫組化檢測。部分保存于-80℃冰箱以備氧化應激等相關檢測。

1.2.3 形態學檢測取球囊損傷血管段制作石蠟切片，采用蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，并通過ImageJ 1.45計算內膜與中膜（intima to media，I/M）比值［8］。

1.2.4 免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法檢測PCNA表達石蠟切片常規脫蠟，修復，血清封閉。低、高濃度組及對照組加入1∶100稀釋的抗PCNA抗體，假手術組加入磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗，4℃保存，而后常規加入二抗、顯色劑，棕褐色顆粒狀產物為陽性標記。并通過ImageJ 1.45計算染色強度，用積分光密度（integrated optical density，IOD）值表示［8］。

1.2.5 香葉醇對球囊損傷血管氧化應激的影響（1）球囊損傷血管中氧化應激標志物8-OHdG的測定。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定，取保存于-80℃冰箱中的損傷血管段標本吸干稱質量，而后充分研磨，加入適量PBS混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清并定容。按試劑盒說明書所示操作并制作標準曲線，終止反應后于波長450 nm的酶標儀上讀取光密度（OD）值，根據OD值查找對應濃度，計算每克組織的8-OHdG含量（濃度×容積÷取樣量）。（2）MDA的測定。取保存于-80℃冰箱中的損傷血管段標本吸干稱質量，而后充分研磨，按試劑盒說明書設空白管、標準管、測試管及對照管，95℃水浴40 min，冷卻，經4 000 r/min，離心10 min，取上清液，分光光度計532 nm處測定OD值。測定樣本中蛋白含量，計算MDA含量:MDA=（測定管OD-測定空白管OD）÷（標準管OD-標準空白管OD）×標準品濃度÷取樣量。

1.3 統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學處理。符合正態分布的計量資料用xˉ±s表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 頸動脈球囊損傷后內膜變化對照組較假手術組I/M比值升高，血管內膜增生明顯；與對照組比較，低、高濃度組I/M比值降低，血管內膜增生受到抑制，且高濃度組較低濃度組抑制內膜增生的效應更明顯（P＜0.05），見表1、圖1。

Tab.1Comparison of I/M ratio，IOD，8-OHdG and MDA values between four groups表1 各組I/M比值、IOD值、8-OHdG及MDA比較

2.2 香葉醇對球囊損傷血管內膜PCNA表達的影響對照組IOD值較假手術組升高，PCNA陽性細胞表達明顯增加（P＜0.05）；與對照組比較，低、高濃度組IOD值降低，血管內膜增生受到抑制，且高濃度組較低濃度組抑制PCNA表達的效應更明顯（P＜0.05），見表1、圖2。

2.3 香葉醇對球囊損傷血管氧化應激的影響對照組8-OHdG和MDA較假手術組均增加（P＜0.05）；與對照組比較，低濃度組8-OHdG釋放受抑制，但MDA水平與對照組差異無統計學意義，高濃度組8-OHdG和MDA均受抑制，且其較低濃度組抑制效應更明顯（P＜0.05），見表1。

Fig.1Effects of GOH on balloon injury-induced neointimal hyperplasia in rat carotid arteries（HE，×100）圖1 香葉醇對大鼠頸動脈球囊損傷后新生內膜的影響（HE，×100）

Fig.2Effects of GOH on PCNA expression in rat carotid arteries（immunohistochemical staining，×100）圖2 香葉醇對血管壁PCNA表達的影響（免疫組化染色，×100）

3 討論

目前，對于PCI術后血管再狹窄的發生機制，一般認為是由于球囊擴張破壞粥樣硬化斑塊，致血小板黏附、聚集和激活造成。研究認為，活化的血小板可釋放多種細胞因子、趨化因子和生長因子，引起平滑肌細胞增生、白細胞募集和凝血瀑布激活，平滑肌細胞由收縮狀態轉變到合成狀態，從血管中膜開始增殖，并逐漸從中膜遷移至內膜，隨后形成新生內膜，各種炎性細胞如單核細胞、T細胞和少量的B細胞在這一過程中被募集，再加上透明質酸、膠原蛋白等細胞外基質的合成，最終導致血管再狹窄的發生［9］。PCI術后血管再狹窄實際是局部血管損傷后的再修復過程，這個過程中涉及血管彈性回縮，血栓形成，炎癥因子活化，以及血管平滑肌細胞增殖和凋亡［10］。

天然香葉醇是一種抗癌劑，其作用包括抑制細胞遷移、下調PCNA表達、抑制ERK信號通路磷酸化、抑制活性氧生成等，從而抑制細胞增殖，抑制B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）家族蛋白等表達，進而誘導細胞凋亡［2，11］。相關研究認為，香葉醇具有抗動脈粥樣硬化的作用［6-7］。本研究結果顯示，與對照組比較，低、高濃度組I/M比值降低，表明血管內膜增生受到明顯抑制，且高濃度組較低濃度組抑制內膜增生的效應更明顯，提示香葉醇具有抗新生內膜形成的作用，香葉醇能對抗PCI術后的血管再狹窄。

PCNA又稱為細胞周期蛋白（Cyclin），是一種核內蛋白質，是DNA聚合酶δ的輔因子，集中分布在增殖細胞有絲分裂G1晚期和S早期的核仁，參與DNA合成與復制，其合成和細胞DNA的復制呈直接相關，對細胞增殖起重要調控作用［12］。本研究結果顯示，與對照組比較，低、高濃度組IOD值降低，血管內膜增生受到抑制，且高濃度組較低濃度組抑制PCNA表達的效應更明顯，表明香葉醇可抑制細胞PCNA蛋白的表達，這與香葉醇抑制頸動脈球囊損傷后新生內膜形成結果一致。

8-OHdG是敏感的DNA損害標志物，因一個羥基接在鳥嘌呤的第8個碳上而形成。DNA損害過程由氧化應激所產生的羥自由基所誘導，因而可將其可作為氧化應激的標志物。MDA是脂質氧化終產物，是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化作用而產生。由于介入性動脈內皮損傷后，局部血管平滑肌細胞和成纖維細胞可通過NADH/NADPH氧化酶途徑產生活性氧，活性氧作為第二信使可改變細胞內氧化還原反應平衡狀態，直接或間接激活細胞內多種信號蛋白激酶及轉錄因子，促進血管平滑肌細胞增殖，最終導致血管再狹窄的發生［13］，因此，活性氧的產生對血管再狹窄的發生起到了重要作用，本研究結果顯示，與假手術組比較，對照組8-OHdG和MDA均增加；與對照組比較，低濃度組8-OHdG釋放受抑制，但MDA水平與對照組差異無統計學意義，高濃度組與對照組比較，8-OHdG和MDA均受抑制，且較低濃度組抑制效應更明顯。

綜上所述，本實驗初步證實了香葉醇對血管新生內膜的抑制作用，其作用機制涉及香葉醇下調PCNA蛋白表達，抑制活性氧的產生，香葉醇對預防PCI后血管再狹窄能起到很好的作用。然而，本研究設計的濃度對照較少，尚不能明確揭示香葉醇抑制血管新生內膜形成及其相關機制的劑量依賴效應，后續有待進一步研究深入。

［1］Byrne RA，Joner M，Kastrati A.Stent thrombosis and restenosis: what have we learned and where are we going？The Andreas Grüntzig Lecture ESC 2014［J］.Eur Heart J，2015，36（47）:3320-3331.doi:10.1093/eurheartj/ehv511.

［2］Wittig C，Scheuer C，Parakenings J，et al.Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor（VEGF）/VEGFR-2 Signaling［J］.PLoS One，2015，10（7）: e0131946.doi:10.1371/journal.pone.0131946.

［3］Kim SH，Bae HC，Park EJ，et al.Geraniol inhibits prostate cancer growth by targeting cell cycle and apoptosis pathways［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，407（1）:129-134.doi:10.1016/j. bbrc.2011.02.124.

［4］Jayachandran M，Chandrasekaran B，Namasivayam N.Geraniol attenuates oxidative stress by Nrf2 activation in diet-induced experimental atherosclerosis［J］.J Basic Clin Physiol Pharmacol，2015，26（4）:335-346.doi:10.1515/jbcpp-2014-0057.

［5］Galle M，Crespo R，Kladniew BR，et al.Suppression by geraniol of the growth of A549 human lung adenocarcinoma cells and inhibition of the mevalonate pathway in culture and in vivo: Potential use in cancer chemotherapy［J］.Nutr Cancer，2014，66（5）:888-895.doi:10.1080/01635581.2014.916320.

［6］Galle M，Kladniew BR，Castro MA，et al.Modulation by geraniol of gene expression involved in lipid metabolism leading to a reduction of serum-cholesterol and triglyceride levels［J］.Phytomedicine，2015，22（7/8）:696-704.doi:10.1016/j.phymed.2015.04.005.

［7］Jayachandran M，Chandrasekaran B，Namasivayam N.Effect of geraniol，aplantderivedmonoterpeneonlipidsandlipid metabolizing enzymes in experimental hyperlipidemic hamsters［J］. Mol Cell Biochem，2015，398（1/2）:39-53.doi:10.1007/s11010-014-2203-3.

［8］Dong LH，Wen JK，Liu G，et al.Blockade of the Ras-extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway is involved in smooth muscle 22 alpha-mediated suppression of vascular smooth muscle cell proliferation and neointima hyperplasia［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（4）:683-691.doi:10.1161/ATVBAHA.109. 200501.

［9］Yin RX，Yang DZ，Wu JZ.Nanoparticle drug-and gene-eluting stents for the prevention and treatment of coronary restenosis［J］. Theranostics，2014，4（2）:175-200.doi:10.7150/thno.7210.

［10］Guildford AL，Stewart HJ，Morris C，et al.Substrate-induced phenotypic switches of human smooth muscle cells:an in vitro study of in-stent restenosis activation pathways［J］.J R Soc Interface，2011，8（58）:641-649.doi:10.1098/rsif.2010.0532.

［11］Chaudhary SC，Siddiqui MS，Athar M，et al.Geraniol inhibits murine skin tumorigenesis by modulating COX-2 expression，Ras-ERK1/2 signaling pathway and apoptosis［J］.J Appl Toxicol，2013，33（8）:828-837.doi:10.1002/jat.2739.

［12］Prosperi E.Multiple roles of the proliferating cell nuclear antigen: DNA replication，repair and cell cycle control［J］.Prog Cell Cycle Res，1997，3:193-210.

［13］Sheng L，Liu YJ，Pan QX.The redox mechanism of reactive oxygen in the vascular smooth muscle cell proliferation after interventional injury［J］.Chin J Arterioscler，2000，8（1）:83-87.［盛林，劉亞軍，潘其興.活性氧的氧化還原機制在介入性損傷后血管平滑肌細胞增殖中的作用［J］.中國動脈硬化雜志，2000，8（1）:83-87］. doi:10.3969/j.issn.1007-3949.2000.01.025.

（2016-04-11收稿2016-06-01修回）

（本文編輯陸榮展）

Geraniol attenuates vascular smooth muscle cell proliferation in rat carotid artery balloon injury model

JIANG Jinyao△，XU Xizi
Department of Cardiology，the Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China

ObjectiveTo evaluate the effects of geraniol（GOH）on neointima hyperplasia in rat carotid artery balloon injury model，and explore the potential molecular mechanisms associated with this effect.MethodsTotally 20 male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into sham operation group（without balloon injury），control group（with balloon injury），low concentration group（with 50 mg/kg GOH intervention after balloon injury）and high concentration group（with 200 mg/kg GOH intervention after balloon injury）.The intima to media（I/M）area ratio of neointima was measured by hematoxylin-eosin（HE）staining.The expression of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）was measured by immunohistochemical staining at 14thday after operation.As the marker of oxidative stress，the levels of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine（8-OHdG）and malondialdehyde（MDA）were measured by enzyme linked inmmnosorbent assay（ELISA）. ResultsThe I/M ratio，IOD，8-OHdG and MDA values were increased in control group compared with those of sham group. The I/M ratio，IOD and 8-OHdG values were reduced in low concentration group compared with those of control group.But there was no significant difference in MDA level between low concentration group and control group.The I/M ratio，IOD，8-OHdG and MDA values were significantly reduced in high concentration group compared with those of control group，which showed a more significant inhibitory effect than that of low concentration group（P＜0.05）.ConclusionGOH could attenuate balloon iniury induced neointima hyperplasia，which might be related to its effect on inhibiting expression of PCNA and decreasing oxidative stress.

carotid artery injuries；tunica intima；oxidative stress；rats，Sprague-Dawley；disease models，animal；Geraniol

R543.5

A

10.11958/20160290

天津醫科大學第二醫院心臟科（郵編300211）

江金垚（1987），男，碩士，主要從事冠心病基礎研究