P2X7R拮抗劑對小鼠慢性胰腺炎的作用及機制研究

張桂賢，劉大衛，聶衛，張一，劉韋鋆，劉洪斌△

P2X7R拮抗劑對小鼠慢性胰腺炎的作用及機制研究

張桂賢1，劉大衛1，聶衛1，張一2，劉韋鋆2，劉洪斌1△

目的探討嘌呤能P2X7受體（P2X7R）拮抗劑——氧化三磷酸腺苷（OxATP）和亮藍G（BBG）在抑制下游靶蛋白——核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（NLRP3）炎性體活化和慢性胰腺炎（CP）胰腺纖維化進程中的作用及可能機制。方法40只C57BL/6小鼠隨機均分為正常對照組、CP模型組、OxATP組和BBG組。除正常對照組腹腔注射與處理組等體積的生理鹽水外，其余組均通過腹腔注射雨蛙素法制作CP小鼠模型（6周）。造模結束后，CP模型組、OxATP組和BBG組分別予以腹腔注射生理鹽水、OxATP（20 μL，300 μmol/L）和BBG（20 μL，10 μmol/L）處理，連續注射2周。然后處死各組小鼠并取胰腺組織，行病理學檢查，以HE染色對胰腺病理組織學（炎性細胞浸潤、腺泡萎縮及纖維化程度）進行評分，天狼星紅染色和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）免疫組化染色分別對胰腺纖維化程度進行評估；免疫組化法檢測胰腺P2X7R、NLRP3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）中的累積光密度（IOD）值。結果與正常對照組比，CP模型組炎癥損傷組織學評分增加，胰腺纖維化程度顯著增加，P2X7R、NLRP3和Caspase-1免疫組化IOD值顯著升高（P＜0.05）；與CP模型組相比，OxATP和BBG組炎癥損傷組織學評分降低，HE染色纖維化評分、天狼星紅染色和α-SMA免疫組化染色均顯著減輕（P＜0.05），胰腺P2X7R、NLRP3和Caspase-1 IOD值均明顯降低（P＜0.05）。結論P2X7R拮抗劑OxATP和BBG能夠顯著減輕CP小鼠模型的慢性炎癥和纖維化程度，阻斷P2X7R-NLRP3炎性體信號通路，這有望成為治療CP及其纖維化進程的一種潛在新策略。

胰腺炎，慢性；纖維化；嘌呤能P2X7受體；核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3；氧化三磷酸腺苷；亮藍G；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是各種病因引起的胰腺組織功能呈不可逆性改變的慢性炎癥性疾病。CP基本病理特征包括胰腺實質慢性炎癥損害、間質纖維化、胰腺實質鈣化、胰管擴張及胰管結石等［1］。CP臨床上主要表現為反復發作的上腹部疼痛和胰腺內外分泌功能不全，極大地影響患者的工作和生活質量［2］。迄今，CP的發病機制尚未明確，也無理想治療方案。P2X7R-核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（NLRP3）是多種慢性炎癥反應的中心環節，與肺、腎等器官纖維化關系密切，但目前對其與CP胰腺纖維化的關系研究尚少。本研究采用反復注射雨蛙素的方法誘導CP小鼠模型［3］，通過分析氧化三磷酸腺苷（Oxidized ATP，OxATP）和亮藍G（Brilliant Blue G，BBG）對嘌呤能P2X7受體（Purinergic P2X7 receptor，P2X7R）的拮抗作用，探究NLRP3炎性體信號通路在CP纖維化過程中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6周齡SPF級健康雄性C57BL/6小鼠40只，體質量20～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（批號:11400700097218）。實驗前動物進行適應性喂養1周，于動物中心屏障級動物室內飼養，每籠5只，所用飼料由北京科澳協力飼料有限公司生產（批號:15063231）。墊料為普通級玉米芯墊料（批號:15019811）。飲用水為純凈水。實驗過程中動物自由攝食、飲水，12 h交替照明，室溫23℃± 2℃，相對濕度（55±5）%。

1.2 主要試劑及儀器（1）樣品與試劑。雨蛙素、Ox-ATP及BBG均購自Sigma公司；天狼星紅及天青石藍液購自FLuka公司；羊多克隆抗體anti-P2X7R（稀釋至1∶400）、兔多克隆抗體anti-NLRP3（稀釋至1∶200）、山羊多克隆抗體半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1，稀釋至1∶400）均購自Santa Cruz公司。（2）實驗儀器。DM4000B型研究級顯微鏡、RM2235/2245型切片機、ASP300全自動組織脫水機及DM750P型偏振光顯微鏡均購自德國Leica公司。

1.3 模型制作與分組40只小鼠按隨機數字表法分為正常對照組、CP模型組、OxATP組和BBG組，每組10只。正常對照組在整個8周研究期間均腹腔注射與處理組動物等體積生理鹽水；其余各組動物均采用反復腹腔注射雨蛙素的方法制作小鼠CP模型，單次注射劑量為50 μg/kg，1次/h，6次/d，每周一、三、五注射，連續6周。在前期藥效學預實驗及急性毒性實驗基礎上，參考文獻［4-5］，在第7～8周，CP模型組改為腹腔注射等體積生理鹽水，2次/d，連續2周；OxATP組和BBG組則分別腹腔注射P2X7R拮抗劑OxATP（20 μL，300 μmol/L）和BBG（20 μL，10 μmol/L）2次/d，連續2周。實驗結束，頸椎脫臼處死所有動物，快速剪取胰腺組織，一部分迅速置于液氮中冷凍，剩余胰腺組織10%福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，供HE、免疫組化和苦味酸-天狼星紅染色。

1.4 HE染色及炎癥損傷程度評分將10%福爾馬林固定的胰腺組織按標準方法進行石蠟包埋，4 μm切片。CP損傷的嚴重程度確定:由病理醫師采用盲法在未知分組的情況下，隨機抽取每只小鼠胰腺的任意3個部位病理切片，每個組織切片讀取10個不同視野，對炎性細胞浸潤、腺泡萎縮及纖維化程度進行評分，評分標準參照文獻［6-7］。

1.5 胰腺膠原含量檢查及定量分析一部分組織切片采用苦味酸-天狼星紅染色，以評估胰腺組織膠原含量。每組10只動物各需制作一張切片。切片進行脫蠟處理后，用0.1%（W/V）天狼星紅-飽和苦味酸溶液在室溫下染色1 h，然后用蒸餾水沖洗、Mayer蘇木精復染和1%鹽酸分化，自來水堿化后脫水并封片。苦味酸-天狼星紅染色后的切片在偏振光顯微鏡200倍率下觀察，通過偏光顏色的差異對胰腺組織膠原類型及其表達程度進行分析，用Image-Pro Plus 6圖像分析軟件（Media Cybernetics，MD，USA）在同一個圖像中，通過量化不同的顏色、分布分析Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的含量（以視野中黃紅色及綠色膠原面積表示）和膠原容積分數（CVFS），CVFS=（綠色膠原面積+黃紅色膠原面積）/總面積（指照片視野面積）×100%。

1.6 胰腺組織α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）免疫組化染色各組取10只樣本，采用過氧化物酶ABC試劑盒（Vector aboratories）進行α-SMA免疫組化染色，光鏡下觀察并使用Leica DM4000B顯微鏡采集記錄200倍率下的圖像。以高倍鏡視野下陽性細胞數來評估胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cells，PSCs）的活化，觀察胰腺纖維化程度。

1.7 胰腺P2X7R、NLRP3和Caspase-1免疫組化（IHC）染色采用過氧化物酶ABC試劑盒（Vector aboratories）進行免疫組化染色，以檢測胰腺組織中P2X7R、NLRP3和Caspase-1表達水平。使用Leica LAS Extended Annotation模塊的軟件進行處理及定量分析。每組各10只動物樣本，每只動物各需3張切片，分別檢測3種蛋白。蛋白表達量以累積光密度（IOD）值表示。

1.8 統計學方法采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。符合正態分布的計量資料用表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果及胰腺慢性炎癥損傷組織學評分與正常對照組相比，CP模型組小鼠胰腺可見明顯的慢性炎癥及纖維化，表現為結構異常、腺泡萎縮、纖維化和炎性細胞浸潤；而OxATP和BBG兩組炎細胞浸潤、腺泡萎縮及纖維化程度評分較CP模型組均明顯降低（均P＜0.05），見圖1、表1。與正常對照組比較，CP模型小鼠胰腺出現了廣泛纖維化，且主要集中在胰腺的導管和血管的周圍（箭頭所示），而OxATP和BBG組小鼠胰腺纖維化則明顯減輕（P＜0.05），見圖1。

Tab.1Histopathological scores of pancreas in three groups表1 各組小鼠胰腺病理組織學評分（n=10，分）

Tab.1Histopathological scores of pancreas in three groups表1 各組小鼠胰腺病理組織學評分（n=10，分）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與CP模型組比較，P＜0.05

組別CP模型組OxATP組BBG組F炎細胞浸潤3.49±0.31 2.34±0.28a 2.52±0.29a 341.731＊＊腺泡萎縮2.84±0.36 1.81±0.34a 1.90±0.33a 156.860＊纖維化3.27±0.42 2.19±0.36a 2.03±0.37a 168.770＊

2.2 胰腺纖維化改變

2.2.1 各組膠原含量變化比較在偏振光照射下，Ⅰ型膠原蛋白顯示為黃紅色，Ⅲ型膠原顯示為綠色。CP模型組、OxATP組和BBG組膠原含量和CVFS較正常對照組均明顯增加（均P＜0.05），并且3組均以Ⅰ型膠原蛋白為主，Ⅲ型膠原蛋白含量相對較少；OxATP組和BBG組膠原含量和CVFS均低于CP模型組（均P＜0.05），見圖2、表2。

Tab.2Changes of CVFS in the pancreas in four groups表2 各組小鼠胰腺組織纖維化CVFS及膠原含量的變化（n=10）

Tab.2Changes of CVFS in the pancreas in four groups表2 各組小鼠胰腺組織纖維化CVFS及膠原含量的變化（n=10）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與CP模型組比較，P＜0.05

組別CVFS（%）正常對照組CP模型組OxATP組BBG組FⅠ型膠原蛋白面積（像素點/ 200倍視野）74.23±3.22 968.62±56.70a 494.34±34.34ab 282.96±17.57ab 1 120.021＊＊Ⅲ型膠原蛋白面積（像素點/ 200倍視野）72.55±3.16 144.55±12.09a 96.54±8.38ab 88.63±6.68ab 127.452＊＊2.05±0.19 48.96±3.38a 23.65±1.41ab 18.48±0.86ab 957.290＊＊

2.2.2 各組α-SMA免疫組化檢測結果比較在CP誘導下，PSCs明顯增多。正常對照組、CP模型組、OxATP組和BBG組高倍鏡視野下PSCs陽性細胞數（個）分別為3.00±1.00，28.30±4.93，9.70±1.53， 16.00±1.73，組間差異有統計學意義（F=45.518，P＜0.05）。CP模型組α-SMA水平明顯高于正常對照組、OxATP組和BBG組，見圖3。

Fig.3The expressions of α-SMA in pancreatic tissues detected by IHC method（IHC，×200）圖3 各組胰腺組織中α-SMA的表達情況（IHC，×200）

2.3 各組P2X7R、NLRP3和Caspase-1檢測結果比較與正常對照組相比，CP模型組胰腺組織中P2X7R、NLRP3和Caspase-1的表達明顯升高；而OxATP和BBG組胰腺組織中P2X7R、NLRP3和Caspase-1表達較CP模型組降低（均P＜0.05），見表3、圖4。

Tab.3Quantitative analysis of cumulative light density（IOD）changes in P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 in four groups表3 各組P2X7R、NLRP3和Caspase-1的IOD值變化（n=10）

Tab.3Quantitative analysis of cumulative light density（IOD）changes in P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 in four groups表3 各組P2X7R、NLRP3和Caspase-1的IOD值變化（n=10）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，b與CP模型組比較，P＜0.05

組別正常對照組CP模型組OxATP組BBG組F P2X7R 0.51±0.07 28.03±2.71a 10.01±1.26ab 16.02±1.94ab 418.712＊＊NLRP3 2.04±0.33 23.01±2.52a 8.52±0.75ab 12.03±1.47ab 335.628＊＊Caspase-1 4.53±0.46 20.01±2.05a 6.02±0.54ab 14.01±1.74ab 270.089＊

3 討論

P2X7R作為一個關鍵調控元件，參與了許多重要的生理和病理過程，包括胚胎發育［8］、免疫系統的成熟、神經退行性疾病［9］、炎癥［10］和癌癥［11］等。作為一種危險信號傳感器，P2X7R在炎癥部位充當了監測三磷酸腺苷（ATP）釋放的報警信號，廣泛參與了NLRP3炎性體的活化，在炎癥級聯反應中發揮著至關重要的作用［12-13］。

纖維化通常被定義為組織中細胞外基質蛋白的過量積累［14-15］。胰腺纖維化是CP的共同病理特點，現在多認為其主要由PSCs激活引起［16-17］。α-SMA是PSCs活化的標志物，其活化與多個信號轉導通路的激活有關。新近研究發現，P2X7R在器官纖維化疾病中具有重要作用，如肺纖維化［18-19］、腎間質纖維化和肝纖維化［20-21］。CP是一種慢性非可控性炎癥過程，其發生多認為起源于胰腺腺泡細胞。傳統觀點認為，酶原顆粒通常是觸發這種慢性炎癥的關鍵［22-23］。然而，P2X7R在CP及其纖維化進程中的作用研究尚少見。

Fig.4The expressions of P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 in pancreatic tissues（IHC，×200）圖4 各組胰腺組織中P2X7R、NLRP3和Caspase-1表達（IHC法，×200）

本研究顯示，雨蛙素反復刺激后，HE染色、天狼星紅染色及α-SMA免疫組化染色結果均顯示，除正常對照組外的小鼠胰腺均發生了明顯的慢性炎癥及纖維化，CP模型組膠原含量較正常對照組明顯增加，α-SMA水平、P2X7R、NLRP3和Caspase-1的表達明顯升高，表明小鼠纖維化變化與P2X7RNLRP3信號途徑中的P2X7R、NLRP3及Caspase-1蛋白表達變化趨勢一致；而在使用P2X7R拮抗劑OxATP和BBG治療后，與CP模型組比較，HE染色病理及纖維化評分顯示OxATP和BBG組胰腺慢性炎癥和纖維化均明顯減輕；天狼星紅染色和α-SMA免疫組化染色也顯示OxATP和BBG組胰腺慢性炎癥和纖維化明顯改善，表明兩種拮抗劑對P2X7RNLRP3炎性體信號通路均有拮抗作用，提示P2X7R在CP及其纖維化進程中發揮了重要作用。筆者推測其可能作用機制為CP慢性炎癥引起胰腺慢性損傷時，腺泡細胞釋放的細胞外ATP可通過結合P2X7R而發揮啟動炎癥級聯反應的作用:P2X7R的激活啟動了NLRP3炎性體的裝配，一旦組裝成炎性體，NLRP3則可介導Caspase-1的激活，后者能夠切割白細胞介素-1β前體（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）和白細胞介素-18前體（pro-interleukin-18，pro-IL-18），使其成為具有活性的成熟形式；這些細胞因子能夠通過自分泌或旁分泌信號上調多種信號通路，導致轉化生長因子（TGF）-β1這一纖維化反應中重要介質的增加，同時促進了胰腺PSCs的活化，而PSCs是慢性胰腺炎關鍵的促纖維化細胞。

綜上所述，P2X7R-NLRP3炎性體信號通路活化在CP慢性炎癥及纖維化過程中有重要作用。P2X7R、NLRP3和Caspase-1等關鍵蛋白分子的級聯活化，伴隨著胰腺由慢性炎癥、腺泡細胞破壞、炎性滲出增加，以及腺泡萎縮、膠原物質增加，從而逐步誘導PSCs活化，最終形成了胰腺纖維化的發展過程，而使用拮抗劑阻斷P2X7R-NLRP3炎性體信號通路，可顯著抑制胰腺的慢性炎癥及纖維化進程，這可能成為治療CP及其纖維化的一種潛在方法。

（圖1、2見插頁）

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（2016-07-13收稿2016-08-30修回）

（本文編輯陸榮展）

Protective effects of P2X7R antagonist on chronic pancreatitis in mice

ZHANG Guixian1，LIU Dawei1，NIE Wei1，ZHANG Yi2，LIU Weiyun2，LIU Hongbin1△
1 Tianjin Institute of Medical and Pharmacological Sciences，Tianjin 300020，China；2 State Administration of Traditional Chinese Medicine，Chinese Medicine Scientific Research Three Level Laboratory，Tianjin Nankai Hospital△

ObjectiveTo investigate the role of purinergic 2X7 receptor（P2X7R）and its downstream target-NLRP3 inflammasome activation in the process of pancreatic fibrosis in a mouse model of chronic pancreatitis（CP）.MethodsForty C57BL/6 mice were randomly divided into normal control group，CP group，P2X7R antagonist oxidized ATP（OxATP）group and brilliant blue G（BBG）group.The chronic pancreatitis model was induced by repeated intraperitoneal injection of the cholecystokinin analogue caerulein with the dose of 50 μg/kg for six weeks.Normal saline，OxATP（20 μL，300 μmol/L）or BBG（20 μL，10 μmol/L）were administered for CP group，OxATP group and BBG group for two weeks after the last caerulein injection.Then all mice were sacrificed and the histopathological changes of the pancreas，especially the fibrotic degrees were evaluated by HE stain，fibrosis score，Sirius red staining and α-SMA immunohistochemical stain.The pancreatic P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 expressions were detected by immunohistochemistry respectively to compare the changes between the groups，and explore the role of P2X7R-NLRP3 signaling pathway in pancreatic fibrosis.ResultsCompared with the normal control group，the scores of pancreatic fibrosis and the expressions of P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 in pancreas were significantly increased in CP model group（P＜0.05）.Compare to CP group，the pancreatic chronic inflammation and the fibrosis indices such as HE fibrosis score，Sirius red staining and α-SMA immunohistochemical stain were ameliorated obviously in OxATP and BBG groups（P＜0.05）.And expressions of P2X7R，NLRP3 and Caspase-1 in the pancreas were allreduced greatly in both OxATP and BBG groups（P＜0.05）.ConclusionP2X7R antagonist OxATP and BBG can significantly decrease pancreatic chronic inflammation and fibrosis in the mouse model of CP，which suggests that the blockade of P2X7RNLRP3 inflammasome signaling pathway may represent a novel therapeutic strategy for CP and its fibrotic process.

pancreatitis，chronic；fibrosis；purinergic P2X7 receptor；nucleotide-binding oligomerization domain like receptor 3；oxidized adenosine triphosphate；brilliant blue G；Caspase-1

R576.2

A

10.11958/20160679

天津市衛生計生委科技基金項目（2014KY39）

1天津市醫藥科學研究所（郵編300020）；2天津市南開醫院，國家中醫藥管理局中醫藥科研三級實驗室

張桂賢（1981），女，助理研究員，主要從事藥理學研究

△通訊作者E-mail:jtss@sina.com