急性腦卒中患者外周血單個核細胞來源的AChE相關的microRNAs的表達變化

韓濱，馬曉峰，張超

急性腦卒中患者外周血單個核細胞來源的AChE相關的microRNAs的表達變化

韓濱，馬曉峰，張超△

目的探討急性腦卒中患者外周血單個核細胞內乙酰膽堿酯酶（AChE）相關的microRNAs的表達變化。方法利用microRNAs的預測軟件并結合文獻，篩選靶向AChE的microRNAs。收集發病24 h以內的急性腦卒中患者和與之相匹配的對照組人群，留取靜脈血提取單個核細胞。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測microRNAs和AChE mRNA的表達，利用Western blot技術檢測AChE蛋白的表達。結果預測的靶向AChE的microRNAs包括microRNA（miR）-24、-28、-124、-132、-182*、-194、-484。與對照組相比，腦卒中患者外周血單個核細胞內miR-24、-124、-132和-194表達升高（P＜0.05），miR-28、-182*及-484無明顯變化，AChE mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.05）。結論腦卒中時miRNAs可能通過靶向AChE增強膽堿能抗炎通路。

卒中；乙酰膽堿酯酶；微RNAs；外周血單個核細胞；膽堿能抗炎通路

腦卒中是引起人類死亡的第二大原因和致殘的主要原因［1］。研究表明microRNAs（miRNAs）參與了缺血性血管事件后續的病情發展［2-4］。miRNAs是一類高度保守的短鏈非編碼RNAs，通過轉錄后調控發揮作用，其在免疫炎癥性疾病的發展中發揮著非常重要的作用［5］。在脂多糖誘導的小鼠體內炎癥中，miR-132可通過靶向乙酰膽堿酯酶（AChE）加強膽堿能抗炎信號，減輕炎癥水平［6］。在實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型中，升高miR-132的水平可以減輕小鼠的發病癥狀［7］。這種作用被用來治療應激誘發的認知缺陷［8］。膽堿能抗炎通路由迷走神經傳入纖維、中樞及迷走神經傳出纖維組成，在神經系統與免疫系統的交流中發揮著重要的橋梁作用［9］。AChE可以調節膽堿能狀態，其活性可以作為反映炎癥狀態的指標［10］。本研究旨在探討AChE相關的miRNAs對于腦卒中后炎癥的調節作用，為治療腦卒中提供新的治療策略。

Tab.1The stem-loop primers of different genes表1 各基因莖-環引物序列

1 對象與方法

1.1 研究對象于2015年10月—2016年4月在天津醫科大學總醫院住院的102例急性缺血性腦卒中患者中篩選出30例患者作為腦卒中組。入組標準:（1）發病時間＜24 h。（2）年齡＞18歲。（3）經頭顱CT或MRI診斷為前循環的腦梗死。排除標準:（1）合并感染。（2）合并腫瘤。（3）孕婦。（4）出血性腦卒中。（5）合并慢性炎癥或自身免疫性疾病。（6）合并認知障礙。收集于我院進行體檢的健康成人30例作為對照組。腦卒中組平均年齡（62.62±10.97）歲，男17例，女13例；對照組平均年齡（61.79±10.89）歲，男15例，女15例。2組之間年齡（t=0.294）、性別（χ2=0.268）差異無統計學意義。本研究經天津醫科大學倫理委員會批準。

1.2 試劑和儀器Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；RNA反轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；SYBR試劑（德國Roche公司）；AChE抗體（美國Santa Cruz公司）；實時熒光定量PCR儀CFX ConnectTM、Bio-Rad ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統、Bio-Rad MyCycler普通PCR儀（美國Bio-Rad公司）；NanoDrop 2000C超微量分光光度計、BiofugeStratos高速冷凍離心機（美國Thermo公司）；Sartorius analytic A 1205萬分之一分析天平（美國Sartorius公司）；QL-866-旋渦混合器（中國其林貝爾公司）。

1.3 方法

1.3.1 外周血單個核細胞（PBMCs）分離用含EDTA的抗凝管抽取患者靜脈血后立即置于冰上，以3 000 r/min的速度離心10 min，吸取上層血漿凍存于-80℃冰箱；下層的血沉淀加入等體積的PBS稀釋，隨后將稀釋后的血沉淀緩慢加入等體積人淋巴細胞分離液中，2 000 r/min，慢升、慢降，離心20 min。離心結束后，管底為紅細胞，中間層為分離液，上層為血漿層，血漿層與分離液層之間有一層較致密的白膜，小心吸取白膜即得到PBMCs。

1.3.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測miRNAs及AChE的表達利用Trizol試劑從新鮮的PBMCs中提取出總RNA，并利用超微量分光光度計測定濃度。取1 μg總RNA作為模板，miRNAs采用莖-環引物進行反轉錄，AChE采用Oligo（dT）引物進行反轉錄，根據RNA反轉錄試劑盒建立20 μL的反轉錄體系，進行逆轉錄得到cDNA，莖-環引物序列見表1。然后根據SYBR的說明書，取2 μL cDNA進行實時定量檢測，每個樣本基因重復3次，反應條件為:預變性95℃10 min，隨后變性95℃15 s，退火58～61℃30 s，延伸72℃20 s，39個循環。利用2-ΔΔCt法計算每個基因的相對表達量。U6作為miRNAs的內參，β-actin作為AChE的內參。引物序列見表2。

Tab.2The PCR primers of different genes表2 各基因實時定量引物序列

1.3.3 Western blot檢測AChE蛋白新鮮提取的PBMCs經裂解液裂解后，通過CBA試劑盒檢測蛋白的濃度，隨后加入上樣緩沖液煮沸10 min，使蛋白變性。然后用10%的SDSPAGE膠進行電泳分離，之后將蛋白轉膜至PVDF膜上。經5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入TBST稀釋的一抗，搖床置于4℃冰箱中，慢搖、孵育過夜。第2天用TBST洗滌一抗，隨后加入相應二抗室溫孵育1 h后，進行曝光，通過Image J軟件檢測灰度值。一抗的濃度為鼠抗-AChE（1∶100），內參蛋白為鼠抗-GAPDH（1∶1 000）。

1.4 統計學方法采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（xˉ±s）表示，2組間比較用獨立樣本t檢驗，計數資料2組間比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 預測靶向AChE的miRNAs利用Targetscan、Pictar、miRanda［11］并結合文獻，選取了高度保守的miRNAs，然后選取預測軟件及文獻的重疊部分，最終確定了7種miRNAs，包括:miR-24、-28、-124、-132、-182*、-194及-484。

2.2 PBMCs內相關miRNAs的變化與對照組相比，腦卒中組PBMCs內miR-24、-124、-132和-194的表達均升高（P＜0.05），miR-28、-182*和-484無明顯變化，見表3。

Tab.3The expression levels of 7 kinds of miRNAs in PBMCs detected by qRT-PCR表3 qRT-PCR檢測PBMCs內7種miRNAs的表達變化（n=30，）

Tab.3The expression levels of 7 kinds of miRNAs in PBMCs detected by qRT-PCR表3 qRT-PCR檢測PBMCs內7種miRNAs的表達變化（n=30，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對照組腦卒中組t miR-24 1.09±0.48 1.79±0.76 4.209＊＊miR-28 1.10±0.10 1.06±0.27 1.125 miR-124 1.07±0.43 1.87±1.30 3.214＊miR-132 1.02±0.19 1.49±0.43 5.480＊＊組別對照組腦卒中組t miR-182* 1.20±0.82 1.24±1.01 0.185 miR-194 1.03±0.26 1.38±0.83 2.304＊miR-484 1.14±0.54 1.17±0.59 0.170

2.3 PBMCs內AChE的變化與對照組相比，腦卒中組AChE mRNA表達降低，Western blot定量結果表明AChE蛋白表達水平亦降低（均P＜0.05），見表4、圖1。

Tab.4The changes of AChE mRNA and proteins表4 AChE mRNA及蛋白水平的變化（n=15，）

Tab.4The changes of AChE mRNA and proteins表4 AChE mRNA及蛋白水平的變化（n=15，）

＊＊P＜0.01

組別對照組腦卒中組t AChE mRNA 1.00±0.32 0.41±0.29 5.224＊＊AChE蛋白灰度比值1.00±0.12 0.53±0.14 9.880＊＊

Fig.1The expression levels of AChE proteins圖1 AChE蛋白水平的變化

3 討論

研究表明人體內AChE直接或間接地參與調節炎癥反應，已經證實其在多種疾病中可作為體內炎癥的一個指標，如腦卒中［10］和炎癥性腸病［11］。AChE通過調節ACh水平參與調節炎癥反應。本研究預測了靶向AChE的miRNAs，包括miR-24、-28、-124、-132、-182*、-194和-484。一種miRNA可以靶向多種mRNA，并且一種mRNA也可有多種miRNAs靶向相應的3′端非編碼區（3′-UTR）［12］，為預測靶向AChE的多種miRNAs提供了理論基礎，本研究預測結果符合這一基本原則。研究進一步探討了上述miRNAs在急性腦卒中患者和健康人群中的變化，結果顯示，與對照組相比，腦卒中組miR-24、-124、-132和-194的表達出現了升高，而miR-28、-182*和-484沒有明顯變化。有研究顯示，青年卒中患者外周血miR-24和-194水平升高，而miR-28、-182*和-484也沒有明顯變化［3］，與本研究不同的是，沒有檢測到miR-124和-132水平的變化，考慮原因可能為研究對象之間年齡存在較大差異。miR-132可通過靶向AChE加強膽堿能抗炎通路的強度［6］，在炎癥狀態下，miR-132表達升高，本研究與之相符。同時，膽堿能系統參與調節miR-124的表達，減少了白細胞介素（IL）-6及腫瘤壞死因子（TNF）-α的產生，減輕了炎癥反應［13］，提示miR-124在炎癥調節中發揮著一定的作用。本研究證實miR-124發生了明顯的變化，提示miR-124參與了腦卒中炎癥的調節。

與對照組相比，腦卒中患者PBMCs內AChE mRNA及蛋白表達出現下降，提示這些miRNAs可能參與了AChE的轉錄后調控，加強了膽堿能抗炎信號，從而參與了卒中后炎癥的調節。有研究顯示，腦卒中患者AChE的活性下降［10］，與本研究結果一致。卒中患者PBMCs內乙酰膽堿的分解酶AChE發生了劇烈的變化，提示在腦卒中患者體內AChE扮演著非常重要的角色。本研究有一些局限性:（1）未證實異常變化的miRNAs直接靶向AChE，從而發揮轉錄后調控的作用。（2）影響膽堿能系統的因素較多，如年齡、情緒等，需更好地控制混雜因素的影響。

綜上所述，靶向AChE的miR-24、-124、-132和-194在腦卒中組的表達水平高于健康對照組，且AChE的水平與炎癥有關，這些miRNAs可能具有調節腦卒中患者體內炎癥的功能。因此對這些miRNAs的研究可能為以后腦卒中的診斷、治療及研究提供一種新的方向和策略。

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（2016-06-06收稿2016-07-07修回）

（本文編輯李國琪）

The change of AChE related microRNAs derived from peripheral blood mononuclear cells in acute ischemic stroke

HAN Bin，MA Xiaofeng，ZHANG Chao△
Department of Neurology，Tianjin Neurological Institute，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China△

ObjectiveTo investigate the expression changes of acetylcholinesterase（AChE）related microRNAs derived from peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in patients with stroke.MethodsThe microRNAs for targeting AChE mRNA were selected via prediction software and previous studies.PBMCs were extracted from venous blood samples of acute ischemic stroke patients（onset＜24 h）and healthy controls.The expressions of microRNAs and AChE mRNA were quantified using real-time PCR（RT-PCR）.The protein level of AChE was detected by Western blot assay.ResultsThepredicted microRNAs included microRNA（miR）-24，-28，-124，-132，-182*，-194 and-484.The expression levels of miR-24，-124，-132 and-194 were significantly elevated in stroke patients compared with those of controls（P＜0.05）.There were no significant changes in expression levels of miR-28，-182*and-484.Additionally，the relative expression levels of intracellular AChE mRNA and protein decreased significantly in stroke patients（P＜0.05）.ConclusionMiRNAs can enhance cholinergic anti-inflammatory pathway by targeting AChE in patients with acute ischemic stroke.

stroke；acetylcholinesterase；microRNAs；peripheral blood mononuclear cells；cholinergic antiinflammatory pathway

R741

A

10.11958/20160518

國家自然科學基金資助項目（81401361）

天津醫科大學總醫院神經內科（郵編300052）

韓濱（1988），男，碩士，主要從事神經免疫性疾病的基礎與臨床研究

△通訊作者E-mail:bjyb254@163.com