黃連成分與阿米卡星聯(lián)合用藥對多重耐藥大腸埃希菌的體外活性研究

帥麗華，姜登釗，劉懷，周小娟，潘斌，葉興文

黃連成分與阿米卡星聯(lián)合用藥對多重耐藥大腸埃希菌的體外活性研究

帥麗華1，姜登釗2△，劉懷1，周小娟1，潘斌1，葉興文3

目的研究硫酸阿米卡星與黃連中成分黃連提取物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀聯(lián)合用藥對多重耐藥大腸埃希菌的體外抑制作用。方法選擇2013—2014年間對頭孢噻肟耐藥的100株大腸埃希菌，篩選多重耐藥大腸埃希菌，并采用紙片擴(kuò)散確證法進(jìn)行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）檢測。采用微量肉湯稀釋法分別檢測黃連提取物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、硫酸阿米卡星對產(chǎn)ESBLs耐藥大腸埃希菌的最小抑菌濃度（MIC）值，再以ATCC 25922為質(zhì)控菌株，以棋盤式微量稀釋法檢測黃連提取物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀與硫酸阿米卡星聯(lián)合用藥對耐藥大腸埃希菌的抑菌效果，并計算聯(lián)合用藥的部分抑菌濃度（FIC）值。結(jié)果共篩選出10株產(chǎn)ESBLs耐藥大腸埃希菌，黃連提取物、鹽酸小檗堿與硫酸阿米卡星聯(lián)合用藥后對9株耐藥菌均表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用，而鹽酸巴馬汀與硫酸阿米卡星聯(lián)合用藥后對全部耐藥菌均表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用。結(jié)論鹽酸巴馬汀或鹽酸小檗堿或黃連提取物與硫酸阿米卡星聯(lián)合用于多重耐藥大腸埃希菌感染，具有較好的應(yīng)用價值，值得進(jìn)一步研究。

黃連屬；中草藥；小檗堿；大腸桿菌；微生物敏感性試驗；藥物療法，聯(lián)合；阿米卡星；鹽酸巴馬汀

大腸埃希菌是醫(yī)院病原菌檢測中最為常見的菌種，其檢出率較高，也是最常見的革蘭陰性桿菌。由于β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物廣泛應(yīng)用于臨床，細(xì)菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）菌株也逐年增多，特別是產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，其檢出率及耐藥率均逐年升高［1-3］。近年來隨著中藥抗菌工作的開展，從中發(fā)現(xiàn)了一些對大腸埃希菌有抑制作用的中藥，如甘草、石榴皮、黃芩、黃連、大黃、苦參、秦皮等［4］。也有報道精提和粗提的中藥復(fù)方制劑均能降低大腸埃希菌多重耐藥基因AcrA的mRNA表達(dá)水平［5］，以及聯(lián)合用藥方案如清開靈、雙黃連聯(lián)合頭孢哌酮-舒巴坦鈉提高產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對抗生素敏感性的報道［6］。本研究將黃連提取物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀這3種從黃連中提取的中藥成分分別與阿米卡星聯(lián)合，測定其對多重耐藥大腸埃希菌的體外抗菌活性，旨在為控制多重耐藥大腸埃希菌導(dǎo)致的臨床感染提供新的更有價值的臨床用藥方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器硫酸阿米卡星對照品（批號130335-200204）、鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201212）、鹽酸巴馬汀（批號110732-201510）均購自中國食品藥品檢定研究院。黃連藥材購自九江開心人大藥房，以95%乙醇超聲提取3次，每次15 min，合并3次提取液濃縮至浸膏，冷凍干燥得到黃連提取物。高頻數(shù)控超聲波提取儀KQ-500TDV（昆山市超聲儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（萊伯泰科EV341），真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司），實驗室超純水設(shè)備（重慶摩爾生物技術(shù)有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安），Phoenix-100全自動微生物鑒定/藥敏儀及配套鑒定藥敏板條、BACTEC FX全自動血培養(yǎng)儀（美國BD公司），Heal Force生物安全柜（B2級），－80℃冰箱（海爾DW-86L386）、哥倫比亞血平板（OXOID）、中國藍(lán)瓊脂及營養(yǎng)肉湯瓊脂（杭州濱和）。

1.2 大腸埃希菌耐藥菌株的菌種鑒定與篩選大腸埃希菌耐藥菌株分離自九江學(xué)院附屬醫(yī)院臨床標(biāo)本，菌種的鑒定和常規(guī)藥物敏感性試驗由美國BD Phoenix-100全自動微生物鑒定/藥敏儀及配套鑒定藥敏板條完成。各項操作均嚴(yán)格按儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC25922）購自中國普通微生物菌種保藏中心（CGMCC），所有實驗菌種均于鑒定和藥敏試驗后保存于－80℃冰箱。除標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922外，選擇2013—2014年間100株頭孢噻肟最小抑菌濃度（MIC）＞32 μg/mL的大腸埃希菌，實驗前將這些菌株從冰箱取出、復(fù)蘇，轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血平板和中國藍(lán)平板，用于體外聯(lián)合用藥篩選研究。

1.3 ESBLs檢測方法及參考標(biāo)準(zhǔn)ESBLs檢測參照CLSI M100-S24文件推薦的紙片擴(kuò)散確證法進(jìn)行檢測。用每片含30 μg頭孢他啶、30 μg頭孢噻肟和頭孢他啶/克拉維酸（30 μg/10 μg）或頭孢噻肟/克拉維酸（30 μg/10 μg）的復(fù)合紙片進(jìn)行試驗，當(dāng)任何一種復(fù)合紙片抑菌圈直徑大于或等于其單獨藥敏紙片抑菌圈直徑5 mm時可確證該菌株產(chǎn)ESBLs。抗生素的敏感、中介、耐藥的判斷折點及試驗方法、質(zhì)量控制遵循CLSIM100-S24文件:阿米卡星對大腸埃希菌的MIC≥64μg/mL為耐藥，MIC=32μg/mL為中介，MIC≤16μg/mL為敏感。

1.4 體外抑菌試驗以ATCC25922為質(zhì)控菌株，采用微量肉湯稀釋法分別測定頭孢噻肟、硫酸阿米卡星、黃連提取物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀各藥物的MIC值，根據(jù)單藥抑菌試驗結(jié)果，按照棋盤稀釋法進(jìn)行聯(lián)合抑菌作用觀察，計算部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)。FIC=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/ MIC乙藥單用，F(xiàn)IC≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FIC≤1為相加作用，1＜FIC≤2為無關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 多重耐藥大腸埃希菌篩選結(jié)果從100株頭孢噻肟的MIC＞32 μg/mL的大腸埃希菌中，共篩選出10株頭孢噻肟MIC≥512 μg/mL，頭孢他啶MIC≥32 μg/mL，頭孢吡肟MIC≥16 μg/mL，氨曲南MIC≥8 μg/mL，同時對阿米卡星呈耐藥（4株）、中介（2株）、敏感（4株）的多重耐藥大腸埃希菌，編號:137649、137773、131180、137958、138126、131775、137531、138187、138314、142782。

2.2 ESBLs檢測結(jié)果上述篩選出的10株大腸埃希菌，經(jīng)紙片擴(kuò)散確證法檢測均為產(chǎn)ESBLs多重耐藥菌株。

2.3 聯(lián)合用藥試驗結(jié)果黃連提取物、鹽酸小檗堿與阿米卡星聯(lián)用后，10株多重耐藥大腸埃希菌中有9株的阿米卡星的MIC值出現(xiàn)大幅下降，降低了3～5個濃度梯度，有9株菌的鹽酸小檗堿的MIC值降低了3～8個濃度梯度，有8株菌的黃連提取物的MIC值降低了3～8個濃度梯度，見表1、2。而鹽酸巴馬汀與阿米卡星聯(lián)用后，所有受試菌株的阿米卡星的MIC都降低了2～5個濃度梯度，所有受試菌株的鹽酸巴馬汀的MIC都降低了2～7個濃度梯度，全部表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用，見表3。鹽酸巴馬汀與阿米卡星的聯(lián)用效果最佳。以棋盤式微量稀釋法檢測黃連提取物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀與頭孢噻肟聯(lián)合用藥對這10株耐藥大腸埃希菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)并不能降低頭孢噻肟和黃連各成分的MIC值，3種聯(lián)合用藥方式均表現(xiàn)為無關(guān)作用。

3 討論

2005—2014年中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)（CHINET）有關(guān)大腸埃希菌的耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示，10年來產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌檢出率總體呈上升趨勢，由7.2%持續(xù)上升至55.4%（2010年略下降，為39.5%）［7］，且對多種常見抗菌藥物耐藥率較高，其耐藥性現(xiàn)狀倍受關(guān)注［3，8］。從我院近2年的多重耐藥大腸埃希菌耐藥率統(tǒng)計中發(fā)現(xiàn)，ESBLs菌株均在80%以上，這就增加了碳青酶烯類藥物的使用壓力。而近年來的研究表明，某些中藥成分與抗生素產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，既可有效逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性，同時還可降低抗生素的用藥量，減低臨床用藥風(fēng)險，可能成為一種有效的臨床治療方案［9］。

Tab.2The antibacterial activities of amikacin and berberine hydrochloride individual and combination against multiple drug resistance of E.coli in vitro表2 鹽酸小檗堿與阿米卡星單用或聯(lián)用對多重耐藥大腸埃希菌的體外抗菌作用

Tab.3The antibacterial activities of amikacin and palmatine hydrochloride individual and combination against multiple drug resistance of E.coli in vitro表3 鹽酸巴馬汀與阿米卡星單用或聯(lián)用對多重耐藥大腸埃希菌的體外抗菌作用

傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，黃連作為一種常用的治療致病性大腸埃希菌導(dǎo)致的胃腸道感染用藥為人們所熟識，體外實驗也表明黃連對耐藥大腸埃希菌和非耐藥大腸埃希菌均有著一定的抑菌作用［4，10］，它主要含有小檗堿、黃連堿、藥根堿、巴馬汀等生物堿。阿米卡星為氨基糖苷類抗生素，對大腸埃希菌感染的臨床治療效果較好，但隨著耐藥大腸埃希菌的增加，其耐藥率也在逐漸升高。本次研究結(jié)果表明，黃連提取物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀3種中藥成分單獨使用時，對多重耐藥大腸埃希菌的MIC≥512 μg/mL，表明它們單獨使用時活性并不強(qiáng)。但黃連提取物、鹽酸小檗堿與阿米卡星聯(lián)合用藥后，10株多重耐藥大腸埃希菌中有9株均產(chǎn)生協(xié)同或相加作用，尤其是鹽酸巴馬汀與阿米卡星聯(lián)合用藥后，所有多重耐藥大腸埃希菌均產(chǎn)生協(xié)同或相加作用，表明鹽酸巴馬汀與阿米卡星聯(lián)用的作用效果最佳。4株已對阿米卡星（單藥）表現(xiàn)為耐藥的大腸埃希菌，在阿米卡星與鹽酸巴馬汀聯(lián)用后有3株對阿米卡星的MIC值降至16 μg/mL及以下，表現(xiàn)為敏感。更值得注意的是，從表1～3可以看到:鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和黃連提取物這3種中藥成分在分別與阿米卡星聯(lián)用后，MIC顯示了非常好的聯(lián)合用藥效果和臨床應(yīng)用前景，從而為進(jìn)一步降低碳青酶烯類藥物的使用壓力奠定了基礎(chǔ)。

大腸埃希菌的耐藥機(jī)制很多［11-12］，產(chǎn)ESBLs是其耐藥機(jī)制之一，而產(chǎn)生鈍化酶是其對氨基糖苷類抗生素耐藥的主要原因［13］，大腸埃希菌對阿米卡星耐藥主要為產(chǎn)生氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶和氨基糖苷類核苷轉(zhuǎn)移酶［14］，并主要產(chǎn)生16S rRNA甲基化酶基因rmtB［15］。本研究中3種黃連成分與頭孢噻肟聯(lián)合用藥，并不能降低頭孢噻肟和黃連各成分的MIC值，說明這3種黃連成分并不能抑制多重耐藥大腸埃希菌所產(chǎn)生的ESBLs，但黃連提取物、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀與阿米卡星能產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究確證。

本研究中3種藥物聯(lián)合對其他產(chǎn)ESBLs或Ampc酶的腸桿菌科細(xì)菌是否有效果，或者這些藥物的聯(lián)合對產(chǎn)KPC酶的大腸埃希菌是否有效果，還有待進(jìn)一步研究。

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（2016-06-13收稿2016-08-08修回）

（本文編輯李國琪）

In vitro activity of amikacin combined with the ingredient of coptis chinensis against multiple drug resistance of Escherichia coli

SHUAI Lihua1，JIANG Dengzhao2△，LIU Huai1，ZHOU Xiaojuan1，PAN Bin1，YE Xingwen3
1 Department of Clinical Laboratory，Jiujiang University Hospital，Jiangxi 332000，China；2 Key Laboratory of Provincial Experiment Center，Institute of Medicine and Life Science of Jiujiang University；3 Department of Intensive Care Unit，Jiujiang University Hospital△

ObjectiveTo observe the antibacterial effects of amikacin sulfate combined with the ingredient of coptis chinensis:the extract of coptis chinensis，berberine hydrochloride and palmatine hydrochloride on multiple drug resistance（MDR）of Escherichia coli（E.coli）in vitro.MethodsOne hundred strains of E.coli checked out from 2013 to 2014 that showed resistence to cefotaxime were selected，and in which MDR to bacteria were determined.The extended-spectrum βlactamases（ESBLs）-producing by Kirby-Bauer test.The minimum inhibitory concentrations（MIC）of the extract of coptis chinensis，berberine hydrochloride，palmatine hydrochloride and amikacin sulfate on ESBLs-producing E.coli were determined firstly，and then the sterilization effects of amikacin sulfate combined with the other three medicines were observed by broth microdilution checkerboard method together with their fractional inhibitory concentrations（FIC），with ATCC 25922 for quality control strains.ResultsTen MDR E.coli were screened and proved to be ESBLs-producing.The inhibitory effects were enhanced in a synergistic or additive pattern when amikacin sulfate combined with the extract of coptis chinensis，berberine hydrochloride on nine of the ten MDR E.coli in vitro，where the inhibitory effects were a synergistic or additive pattern when amikacin sulfate combined with palmatine hydrochloride on all of the MDR E.coli in vitro.ConclusionPalmatine hydrochloride or berberine hydrochloride or the extract of coptis chinensis combined with the amikacin sulfate has significant value in treatment of MDR E.coli，which is worthy of further study.

coptis；drugs，Chinese herbal；berberine；Escherichia coli；microbial sensitivity tests；drug therapy，combination；amikacin；palmatine hydrochloride

R378.21

A

10.11958/20160547

江西省衛(wèi)生廳2014年度科技計劃項目（20143244）

1江西九江，九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科（郵編332000）；2九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院省級重點實驗中心；3九江學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

帥麗華（1972），女，學(xué)士，副主任技師，講師，主要從事細(xì)菌耐藥性監(jiān)測和抗感染治療研究

△通訊作者E-mail:jiangdengzhao@126.com