基于線粒體COI基因的雷州半島馬尾藻屬常見種DNA條形碼鑒定及系統進化分析

賀　亮，廖　健，全秋梅，梁　忠，謝恩義，劉　麗，劉楚吾

（廣東海洋大學水產學院 南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524025）

基于線粒體COI基因的雷州半島馬尾藻屬常見種DNA條形碼鑒定及系統進化分析

賀亮，廖健，全秋梅，梁忠，謝恩義，劉麗，劉楚吾

（廣東海洋大學水產學院 南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524025）

采用DNA條形碼技術輔以傳統形態分類方法，對雷州半島馬尾藻屬（Sargassum）6常見種進行物種鑒定和系統進化分析。測得6種馬尾藻線粒體COI基因序列，該序列與GenBank和BOLD數據庫中馬尾藻序列同源性均大于或等于99%，該結果與形態分類學鑒定結果一致。COI基因序列特征分析表明，6種馬尾藻保守位點421個，變異位點58個，簡約信息位點21個，單一突變位點37個，變異率7.7%，T、C、A、G平均含量分別為39.1%、18.9%、19.1%、22.9%，A+T含量（58.2%）高于C+G含量（41.8%），UUU所編碼的苯丙氨酸（F）使用頻率最高，達12.5%，最大似然法估算的轉換顛換比值為2.42，種間遺傳距離多在0.030±0.013～0.100±0.016之間。聚類分析結果與形態學鑒定、同源性分析結果一致。

馬尾藻屬；mtDNA-COI基因；物種鑒定；分子系統進化；DNA條形碼

馬尾藻屬（Sargassum C.Agardh）隸屬于褐藻門（Phaeophyta）無孢子綱（Phaeophyta）墨角藻目（Fucales）馬尾藻科（Sargassaceae），是熱帶及溫帶沿海常見的大型海藻，主要分布于印度-西太平洋和澳大利亞、加勒比海等沿海海域［1］，多數種類生活在低潮帶和潮下帶淺水區的巖石上，是重建海藻床和實施海洋生境修復的重要構成物種，具有重要的生態價值。該屬藻類株型較大，種類甚多，曾記錄的種、變種及變型共 878種，目前已證實有 340種，我國海域有130種［1］。目前，已有基于形態特征的馬尾藻系統學研究［2-7］，但分子生物學角度的相關研究相對欠缺。近年來，隨著分子生物學的快速發展，基于DNA條形碼技術廣泛應用于生物分類學、系統學以及種群遺傳學等方面研究，分子數據結合傳統形態學分類數據使難以界定的物種分類得以較好地解決［8］。每種生物特有的基因序列是進行分子生物學鑒定的基礎，核基因、質體基因、線粒體基因等可能成為分子標記的潛在對象。線粒體DNA （mitochondrial DNA，mtDNA） 作為真核生物的核外遺傳物質，具有基因組結構簡單、呈母性遺傳、編碼效率高、進化速率快且不發生重組等特性，應用線粒體DNA及其片段的測序分析技術對馬尾藻進行物種鑒定與分類分析將更加客觀、科學，其中，細胞色素C氧化酶亞基I （cytochrome c oxidase subunit I，COI） 基因序列是線粒體基因的重要部分，具有進化速度較快、易擴增等優點，可作為良好的分子標記用于種內、屬間系統進化研究［9］。目前，線粒體COI作為DNA條形碼已廣泛應用于動物分類鑒定與系統進化研究［10-12］，而有關海洋藻類的DNA條形碼研究多集中在硅藻以及紅藻上，但關于褐藻研究相對比較薄弱，有待進一步的發展，如Saunders［13］于2005年首次利用線粒體COI基因對紅藻3個群體的46個樣品進行分析，結果表明，線粒體COI基因可準確區分形態相似的紅藻，并發現一些新種；Evans等選取COI、18Sr DNA、rbc L、ITSrDNA等4個基因作為DNA條形碼對硅藻屬的34個體進行評價研究，認為線粒體COI比rbc L和18sr DNA的變異率均較高，ITSr DNA的種內變異率太高，且現有數據庫中硅藻的ITSr DNA序列信息極少，線粒體COI基因較適于作為硅藻的DNA條形碼進行研究［14］；Mattio和Payri在分析馬尾藻屬不同條形碼基因時也暗示了線粒體基因 mtsp（mitochondrial targeting signal peptide）、COI和COIII作為褐藻條形碼基因的可能性［15］。本研究獲取6種馬尾藻線粒體COI部分序列，從分子水平對其進行DNA條形碼鑒定，并探討其系統進化，為馬尾藻物種鑒定和分子系統學研究提供分子生物學依據，為雷州半島地方性馬尾藻的種質資源保護與可持續利用提供基礎數據。

1　材料與方法

1.1材料采集

馬尾藻樣品于2015年11月至2016年3月采自湛江硇洲島海域、徐聞四塘和海安灣。低溫條件下迅速帶回實驗室，選擇生長良好藻體，用抽濾海水洗凈藻體表面附著物后，暫養于1 000 mL燒杯內，暫養條件為：溫度（20±0.5）℃，鹽度為28，光照周期12L：12D，照度4 000～6 000 lx，翌日提取基因組DNA。

1.2形態學分類

［1］對藻樣鑒定至種。

1.3分子生物學鑒定

1.3.1基因組DNA提取每個樣本剪取幼嫩的葉片組織約100 mg，于研缽中與石英砂、碳酸鈣充分研磨后，采用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取DNA，提取步驟參照說明書。經10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳定性檢測和Nanodrop 2000定量分析后，合格樣品于4℃下保存備用。

1.3.2mtDNA-COI 序列PCR擴增與測序選取檢測合格的基因組DNA進行PCR擴增，擴增引物參考文獻［16］，正反向序列為：CNCOI-F，5′-TCA ACAAATCATAAAGATATTGG-3′； CNCOI-R，5′-ACT TCTGGATGTCCAAAAAAVCA-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應條件：94℃ 2min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1min，35個循環；72℃下再延伸10min，4℃下保存。反應體系采用25μL，含2.5 mmol/L dNTP 2μL、10×Buffer（含Mg2+） 2.5μL、2.5 mmol/L dNTPs 2μL、5μmol/L引物各1μL、模板DNA 1μL、500 u/L Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O補足體積。擴增產物用10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格產物送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.3.3數據分析

原始數據經人工校正，利用 Bio-Editor和DNAMAN軟件對所測序列進行峰圖人工校正和序列拼接后，與此同時，從GenBank中下載褐藻門9種馬尾藻的線粒體COI基因序列（GenBank序列號及詳細信息見表1），共16條序列，利用Mega 5.0進行多序列比對，并計算堿基組成及序列變異各項參數，其中包括保守位點（C）、變異位點（V）、簡約信息位點（Pi）和單一突變位點（S），利用Mega 5.0中Cumpute codon usage Bias程序分析密碼子使用頻率，計算Kimura 2-parameter遺傳距離；并以鄰位連接（Neighbor-Joining，NJ）構建系統進化樹，Bootstrap 置信值重復抽樣1 000次，以最大似然法（ML） 估算轉換顛換比R值。

表1　本研究所涉及線粒體COI基因序列基本信息Table 1　Information about mtDNA-COI gene sequences

2　結果與分析

2.1形態學分類與分子鑒定

藻樣形態學特征見表2，依據文獻［1］鑒定為果葉馬尾藻（Sargassum carpophyllum）、冬青葉馬尾藻（S.ilicifolium）、半葉馬尾藻中國變種（S.hemiphyllum var chinense）、瓦氏馬尾藻（S.vachellianum）、匍枝馬尾藻（S.polycystum）、全緣馬尾藻（S.integerrimum）。其線粒體COI基因序列經人工矯正和剪切后長度為479 bp，與GenBank、BOLD數據庫中已有數據比對發現，與其同源性最高的分別是果葉馬尾藻、冬青葉馬尾藻、半葉馬尾藻中國變種、瓦氏馬尾藻、匍枝馬尾藻以及全緣馬尾藻，相似度均大于或等于99%，與形態學鑒定結果一致。

2.2線粒體COI基因片段序列特征分析

多序列比對結果表明，6種馬尾藻線粒體COI基因序列保守位點421個，變異位點58個，簡約信息位點21個，單一突變位點37個，變異率7.7%。堿基組成分析揭示，T、C、A和G的平均含量分別為39.1%、18.9%、19.1%、22.9%，其中A+T含量（58.2%）明顯高于C+G（41.8%）。堿基在密碼子的第1、2、3位分布不均勻，具有明顯偏倚性，其中堿基C偏向于密碼子第1位（28.1%），其在第2、3位的含量顯著降低，分別為9.8%和18.8%。密碼子使用偏向性結果表明，UUU所編碼的苯丙氨酸（F）使用頻率最高，達12.5%。479 bp線粒體COI基因部分序列共編碼159個氨基酸，且無插入、缺失及終止密碼子。估算的轉換顛換R比值為2.42，表明序列中轉換明顯多于顛換。

2.3遺傳距離

11種馬尾藻Kimura雙參數進化模型的種間平均遺傳距離見表3。結果顯示，藻樣S001、張氏馬尾藻（S.zhangii）與銅藻（S.horneri）種間平均遺傳距離最大，均為 0.112±0.016，表明三者親緣關系最遠，而樣品S002和樣品S006種間平均遺傳距離最小（0.002±0.002），表明兩者親緣關系最近，多數種間平均遺傳距離在 0.030±0.013～0.100± 0.016之間。可見，11種馬尾藻種間遺傳距離較小，這與11種馬尾藻同屬馬尾藻屬存在一定聯系。

表2　6種馬尾藻主要部位形態特征描述Table 2　Morphological description of the main parts of 6 species of Sargassum

表3　基于線粒體COI基因序列11種馬尾藻的16條序列種間遺傳距離Table 3　Interspecific genetic distance based on 16 sequences of mtDNA-COI gene from 11 species of Sargassum

2.4聚類分析

采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），以海帶目海帶科的海帶（Saccharina japonica，AB775228.2）為外群，構建11種馬尾藻的系統發生樹（圖1）。由圖1可見，馬尾藻屬的11個物種與外群分開，其中，藻樣S004、S001、S003與GenBank數據庫下載瓦氏馬尾藻（S.vachellianum）、果葉馬尾藻（S.carpophyllum）、半葉馬尾藻中國變種（S.hemiphyllum var chinense）分別以高達99%、100%、100%置信值在發生樹上各聚為一支，表明藻樣S004、S001、S003與GenBank數據庫下載數據為同種，與形態學、同源性分析結果保持一致，證實此三藻樣分別為瓦氏馬尾藻（S.vachellianum）、果葉馬尾藻（S.carpophyllum）、半葉馬尾藻中國變種（S.hemiphyllum var chinense），而藻樣 S006與GenBank數據庫下載全緣馬尾藻（S.integerrimum）聚為一小支，且與冬青葉馬尾藻（S.ilicifolium）聚為一大枝，表明三者親緣關系較近，藻樣 S005在發生樹上單獨聚為一支，與其他藻類相對較遠。

圖1　11種馬尾藻線粒體COI基因片段聚類分析Fig.1　Phylogenetic analysis of mtDNA-COI gene fragments of 11 species of Sargassum

3　討　論

長期以來，復雜多樣的海洋藻類分類問題一直都是困擾國內外藻類學家的一項重大難題，而其復雜的系統進化關系也成為學者們常關注的焦點。目前，對于馬尾藻分類鑒定主要依據藻體顏色、固著器、主干、初次生分枝、藻葉、氣囊和生殖托的形態以及毛窩是否存在等形態學特征，但這些性狀受外界環境、物種性別以及發育階段等因素影響變化較大，僅依靠形態特征對某些外觀較為相似的馬尾藻，很難對其進行準確區分，因此在進行藻類分類鑒定時利用DNA條形碼技術輔助研究顯得尤為重要［17-18］。線粒體COI基因是線粒體內13種氨基酸編碼基因之一，在種間變異適宜，可提供比較豐富的變異位點，已漸漸被應用于馬尾藻屬等樣品的物種鑒定及系統進化等研究［19-21］。本研究通過對馬尾藻樣品線粒體 COI基因中 479 bp片段并結合GenBank和BOLD數據庫中已有數據進行同源性分析，利用 Kimura雙參數進化模型的種間平均遺傳距離，并以NJ法構建系統發生樹，鑒定出所獲取馬尾藻樣品分別為果葉馬尾藻（S.carpophyllum）、冬青葉馬尾藻（S.ilicifolium）、半葉馬尾藻中國變種（S.hemiphyllum var chinense）、瓦氏馬尾藻（S.vachellianum）、匍枝馬尾藻（S.polycystum）以及全緣馬尾藻（S.integerrimum），與形態結果一致。說明線粒體 COI基因用于馬尾藻物種鑒定具有較高的可行性與高效性，通過傳統形態學與DNA條形碼技術相結合，可較好實現對馬尾藻樣本的準確鑒定。

經過十幾年的發展，海藻分子系統學研究已建立了基本方法，在分類、系統進化和生物地理學研究方面取得了一定的研究成果。但是到目前為止，多數工作仍限于積累信息、利用孤立的分子證據構建局部的分子系統樹，分子方法在藻類方面尚無統一的研究標準，而整體的系統發生關系研究仍然很模糊，僅是對一些物種的傳統分類地位提出質疑和分類修訂建議，此外，NCBI數據庫里藻類的基因序列并不全面，缺乏很多藻類的基因數據，準確完整的基因序列還有待補充［23］。因此，藻類物種鑒定目前仍以形態學鑒定為主，相信隨著對馬尾藻分子標記研究的深入以及分子數據的補充與完善，將有助于促進馬尾藻DNA條形碼的建立，進而使物種繁多、形態多變的馬尾藻物種鑒定和種間系統發生關系研究更加科學。

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（責任編輯：劉慶穎）

DNA Barcoding and Phylogenetic Analysis of Common Species of Sargassum from Leizhou Peninsula Based on mtDNA-COI Gene Sequences

HE Liang，LIAO Jian，QUAN Qiu-mei，LIANG Zhong，XIE En-yi，LIU Li，LIU Chu-wu
（Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal of Guangdong Higher Education Institutes，Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China）

Species identification and phylogenetic relationship in 6 common species of Sargassum collected from Leizhou Peninsula were analyzed by appling DNA barcoding technology assisted traditional morphological classification method.Mt-DNA COI gene sequences of 6 species of Sargassum and existing data in GenBank and BOLD database for homology analysis showed that the similarity is 99% or more，the molecular data were consistent with the morphological identification results.In addition，the analyses on characteristics of COI gene sequence shows that COI gene sequence in 6 species Sargassum including 421 conserved sites，58 variable sites，21 Parsim-Informative sites，and 37 Singleton sites，accounted for 7.7%.Nucleartides composition results showed：T，C，A，G average contents were 39.1%，18.9%，19.1%，22.9%，respectively，and A+T content （58.2%） was significantly higher than C+G content （41.8%）.The highest frequency of amino acid was Phenylalanine（F） which coded by UUU（12.5%）.The rate of transition and transversion based on maximum likelihoodwas 2.42.Interspecific genetic distances were from 0.001 ± 0.001 to 0.113 ± 0.016.The result of cluster analysis was consistent with that of morphological identification and homology analysis.

Sargassum； mtDNA-COI； species identification； molecular phylogenetic； DNA barcoding

Q78；Q949

A

1673-9159（2016）04-0017-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.004

2016-06-07

2016年度廣東大學生科技創新培育專項資金立項項目（pdjh2016b0236）；中央分成海域使用金支出項目（2011-2-2-09-3）；廣東省海洋漁業科技推廣專項（A201308E02）；廣東省科技計劃項目（2012B020307006）

賀亮（1990－），男，碩士研究生，從事海洋生境修復與生物資源保護研究。E-mail：gdhydxhl1990@foxmail.com

劉麗（1974－），女，教授，主要從事海洋生物保護及遺傳多樣性研究。E-mail：zjouliuli@163.com