不同發酵時期酸馬奶細菌群落結構

布仁其其格，高雅罕，任秀娟，包艷青，魏睿元，趙一萍，韓海格，烏云達來，黃金龍，芒 來,*（.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區蒙古馬遺傳資源保護及馬產業工程實驗室，內蒙古 呼和浩特 0008；2.內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 000）

不同發酵時期酸馬奶細菌群落結構

布仁其其格1,2，高雅罕1，任秀娟1，包艷青1，魏睿元1，趙一萍1，韓海格1，烏云達來1，黃金龍1，芒 來1,*
（1.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區蒙古馬遺傳資源保護及馬產業工程實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110）

以聚合酶鏈式反應擴增16S rRNA基因序列采用454焦磷酸測序方法分析酸馬奶傳統發酵過程中細菌群落結構演替變化。結果表明：在發酵的初期細菌多樣性最高，而細菌豐度在72 h時最高；硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）為酸馬奶中的優勢細菌門；乳桿菌 屬（Lactobacillus）和乳球菌屬（Lactococcus）為其優勢細菌屬；隨著發酵時間的延長，各個細菌門與屬都存在上升或下降的趨勢變化。本研究可為其他乳制品發酵過程中細菌群落結構研究提供借鑒。

酸馬奶；傳統發酵；細菌群落結構；16S rRNA

布仁其其格, 高雅罕, 任秀娟, 等. 不同發酵時期酸馬奶細菌群落結構[J]. 食品科學, 2016, 37(11): 108-113. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611019. http://www.spkx.net.cn

Burenqiqige, GAO Yahan, REN Xiujuan, et al. Dynamic changes of bacteria community structure during koumiss fermentation[J]. Food Science, 2016, 37(11): 108-113. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611019. http://www.spkx.net.cn

傳統發酵酸馬奶是以馬奶為原材料與發酵劑混合，在平均20～23 ℃溫度下定時上下搗拌一定次數，發酵2～3 d即可成為略帶酸味、微噴酒香、沁人心脾、清爽適口的發酵乳飲品。發酵劑為上一個發酵周期保留的酸馬奶或上一年度酸馬奶通過直接冷凍保存或借助媒介（比如：蘸吸酸馬奶的干凈皮子、氈塊、米、野果等）干燥保留物，其中含有復雜的微生物群落結構，長期連續參與到酸馬奶發酵中對其品質起到及其重要的作用。

酸馬奶發酵微生物中細菌是重要組成部分。1985年，研究已發現酸馬奶中包含乳桿菌和乳球菌[1]。在新疆地區[2]、內蒙古錫林郭勒盟[3]以及蒙古國[4]采集的傳統發酵酸馬奶中分別分離培養出不同數量的乳桿菌菌株。Hao等[5]采用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術研究了酸馬奶中細菌生物多樣性，而劉芳等[6]采用16S rRNA基因測序技術分析了酸馬奶乳酸菌菌群多樣性。伴隨分子生物學研究手段的引入對于酸馬奶中細菌的研究已取得了一定成果。然而，基于某一固定時間點采樣研究自然發酵酸馬奶中細菌群落，不能全面、客觀了解酸馬奶發酵過程中細菌群落的真實存在狀態和動態變化過程。2001年，殷文政等[7]采用傳統方法對酸馬奶傳統發酵過程中細菌進行分類鑒定，初步了解群落結構動態變化情況。由于培養基方法的局限性[8]無法全面反映真實狀況，因此必須運用相對更加精確的技術研究酸馬奶發酵過程中細菌群落結構變化情況。

細菌群落結構及多樣性研究中應用越來越多的方法是對所提取到的環境微生物宏基因組DNA進行16S rRNA基因（rDNA）序列的分析。16S rRNA基因全長為 1 542 bp，由 9 個可變區（V1～V9）和10 個保守區組成，保守區反映物種間的親緣關系，而可變區則揭示物種間的差異，適用于各類細菌生物進化和系統分類學研究[9]。針對16S rRNA基因的保守區域設計引物，所得不同的序列代表不同的菌種，經測序分析便可確定群落結構和多樣性。

近年來，迅速發展并推廣應用的第2代高通量測序技術被應用到對16S rRNA基因的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物測序中，可以同時對數十萬甚至數百萬序列片段進行測序且互不干擾[10]。高通量測序平臺中Roche公司454焦磷酸測序儀測序單序列讀長長（目前升級后的GS FLX＋最長可達到1 000 bp）、可重復性和精確性高，已被廣泛應用于如海洋、湖泊、空氣、土壤、礦井、發酵食品[11]、反芻動物瘤胃、人類口腔及腸道等多種環境樣品的微生物群落結構多樣性研究。

為了探究傳統發酵過程中酸馬奶細菌群落結構的動態變化過程，在內蒙古錫林郭勒盟鑲黃旗選取當地釀制酸馬奶時間最久，品質最具有代 表性的牧戶，模擬其發酵酸馬奶過程進行樣品采集。后期對細菌16S rRNA基因序列進行454焦磷酸測序以及序列分析，從非培養水平上闡述酸馬奶發酵過程中細菌種群多樣性和群落結構動態變化規律，結果將對酸馬奶傳統發酵過程中微生物動態變化研究，酸馬奶發酵機理研究，產品質量監控等具有實際的參考意義。

1 材料與方法

1.1 試劑

E.Z.N.A Soil DNA提取試劑盒 美國Omega公司；DL2000 DNA分子質量標準、TransStart Fastpfu DNA Polymerase、Taq DNA聚合酶、10×Loading Buffer、6×Loading Buffer 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

Roche GS FLX 基因組測序儀 瑞士羅氏公司；UVP CDS-8000凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司；Eppendorf 5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；GeneAmp?9700型PCR儀 美國ABI公司；QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統 美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品

2013年7月，在內蒙古錫林郭勒盟鑲黃旗，參照牧戶家做法釀制酸馬奶。發酵劑采用牧民家中酸馬奶，鮮馬奶與發酵劑以體積比13∶1混勻，一個體系3.5 L，共有3 個平行發酵（編號A、B、C），溫度為（22±2） ℃。每隔2.5 h搗拌300 次，每日共5 次。收集0～96 h的樣品，采樣之前測定pH值，液氮保存樣品帶回實驗室。

1.3.2 宏基因組DNA提取與檢測

選取0、12、24、48、72、96 h等6 個時期樣品，采用E.Z.N.A Soil DNA提取試劑盒按說明提取酸馬奶宏基因組DNA。

1.3.3 PCR擴增16S rRNA 基因序列V1～V3區

20 μL反應體系：5×Fast Pfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer（5 μmol/L）0.8 μL、Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、Template DNA 10 ng，補ddH2O至20 μL。

引物序列為：27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’，533R 5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’，測序起始端為533R，引物中加入7 個核苷酸標簽（barcode）。PCR擴增條件為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27 個循環，最后72 ℃延伸5 min。

1.3.4 樣品平衡及測序

PCR產物檢測定量，按每個樣品100 nmol/L的濃度將DNA樣品（每個樣品的核苷酸標簽barcode不重復）混為一管，上機測序，由上海美吉生物公司完成。

1.3.5 高質量序列篩選

篩選原則：序列barcode和引物必須完整；序列的長度大于300 bp；整條序列上質量大于20的堿基所占比例須高于93%。

1.3.6 生物信息學處理

使用QIIME（v1.4.0）分析平臺開展序列的生物信息學分析[12-13]。PyNAST校準排齊[14]序列，以100%相似性進行UCLUST歸并從而建立無重復的533R→27F序列集。采用兩步UCLUST歸并，在100%相似性歸并的基礎上進一步進行97%相似性的歸并，從而建立分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）。ChimeraSlayer[15]去除可能存在嵌合體序列的OTU，繼而使用核糖體數據庫項目（Ribosomal Database Project，RDP）工具classifi er[16]貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學鑒定。FastTree軟件[17]生成OTU代表序列的系統發育進化樹，在此基礎上進行Alpha多樣性計算。Alpha多樣性包括超1指數（Chao1 index）和香農指數（Shannon index），分別對樣品菌群構成的豐度和多樣性進行評價。

香農指數計算公式為：

式中：Sobs為實際測量出的OUTs數目；ni為含有i 條序列的OTUs數目；N為所有的序列數。

超1指數計算公式為：

式中：SChao1為估計的OUTs數；Sobs為實際測量出的OUTs數；n1為只有一條序列的OTUs數目；n2為只有兩條序列的OTUs數目。用于指數評估的OTUs相似水平97%。

同時使用稀疏曲線（rarefaction curve）和香農指數曲線評估每個樣本測序的多樣性以及在不同的OTUs劃分水平下的多樣性，以評價測序量是否能夠代表原始群落的多樣性?；赨niFrac[18]距離對樣品之間進行加權（weighted）和非加權（unweighted）的主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA），同時采用基于UniFrac的非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）進行樣品聚類。

1.3.7 數據的統計分析及圖表繪制

基于Matlab R2011b（The MathWorks, Natick, MA, USA）軟件，使用多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對不同時間點的酸馬奶細菌菌群群落結構的差異進行顯著性分析，作圖采用Origin 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 樣品16S rRNA基因序列質量評估

通過454焦磷酸高通量測序，18 個樣品共產生67 514 條高質量16S rRNA基因序列，每個樣品平均產生3 750 條。經過PyNAST alignment和100%序列鑒定聚類分析后，共得到11 456 條代表性序列。繼而根據序列的97%相似性進行OTU劃分及嵌合體檢查，得到477 個OTUs進行下一步分析。

圖1 稀疏曲線Fig. 1 Sparse curve

圖2 香農指數圖Fig. 2 Shannon index map

依據當前的測序量每個樣品的稀疏曲線不能進入平臺期（圖1），但是Shannon多樣性曲線已經飽和（圖2），表明即使隨著測序量的增加新的種系型可能會被發現，但是細菌多樣性已經不再隨之發生變化，現有測序量可以反映樣品中絕大多數的細菌物種信息。

2.2 序列豐度和多樣性分析

圖3 酸馬奶發酵過程中Chao1指數、Shannon指數和pH值變化Fig. 3 Changes in Chao1 index, Shannon index and pH level during the fermentation process of koumiss

以Chao1指數對不同發酵時間點酸馬奶中細菌菌群豐度進行評價，如圖3所示，顯示出發酵過程中細菌的豐度具有明顯的起伏變化。發酵起始12 h后細菌開始大量繁殖直至24 h，此后繁殖速率下降在48 h時細菌豐度最低，而72 h時轉為豐度最高。由圖3中Shannon指數變化情況可知，在酸馬奶發酵過程中細菌多樣性存在上下波動。0 h時樣品中細菌的多樣性較高，主要來源于發酵劑，隨著發酵時間的延長多樣性逐漸下降，而在72 h時其豐度會增至最高。

Chao1指數與Shannon指數變化規律表明在酸馬奶發酵24 h之內細菌群落內部存在激烈的生存競爭，部分菌群取得生存優勢而大量繁殖。而24 h之后的生存環境更加惡化，直至48 h之后pH值變化緩慢趨于穩定期，細菌豐度與多樣性都在增高，細菌群落結構與營養供給[19]和環境酸度[20]有關。

2.3 基于門屬水平的不同發酵時間點酸馬奶細菌構成的研究

采用RDP數據庫同源性序列比對與聚類相結合的方法對序列進行鑒定，產生了17 個門，其中含量最多的2 個細菌門占到了測序序列總數的98.91%，分別為硬壁菌門（Firmicutes，85.55%）和變形菌門（Proteobacteria，13.36%）。此外檢測到擬桿菌門（Bacteroidetes，0.59%）、放線菌門（Actinobacteria，0.36%）、氰基細菌（Cyanobacteria，0.05%）和棲熱菌門（Deinococcus-Thermus，0.001%）所占比例較低。新疆地區酸馬奶研究[21]顯示優勢細菌門同樣是硬壁菌門（95%以上），其次為變形菌門（低于5%），兩個地區酸馬奶發酵的優勢細菌門相同，比例上存在差異。

圖4 基于門水平的不同發酵時間點酸馬奶細菌豐度變化Fig. 4 Changes in bacterial abundance at phylum level during the fermentation process of koumiss

由圖4可知，酸馬奶發酵至48 h硬壁菌門含量呈現出上升的趨勢，而后開始下降至72 h，隨后趨于穩定。細菌群落結構中硬壁菌門在酸馬奶發酵過程中一直占據主導地位，是酸馬奶發酵的優勢細菌門。變形菌門是酸馬奶發酵的次優勢細菌門，其序列數量變化呈現出與硬壁菌門相反的趨勢，表明在發酵過程中兩者之間存在相互作用。

經序列比對法對序列進行鑒定共得到54 個屬，有0.25%的序列不能鑒定到屬水平，表明酸馬奶發酵過程中細菌具有豐富的多樣性，還有發現新的菌種的可能性。分類結果顯示在酸馬奶傳統制作過程中乳桿菌屬（Lactobacillus）為優勢細菌屬，乳球菌屬（Lactococcus）為次優勢細菌屬。殷文正等[7]在其研究中也發現酸馬奶發酵過程中乳桿菌屬為優勢細菌屬。酸馬奶發酵過程中細菌在屬水平上的多樣性動態變化如圖5所示，在發酵起始12 h后乳桿菌屬的繁殖速率加快，此時環境中酸度值能夠滿足其啟動生長，24 h后其含量又呈現出下降的趨勢，可能是菌群大量繁殖后出現了養分競爭而抑制了繁殖速率。與此相比，發酵起始后酸馬奶中乳球菌屬繁殖速率較快，至12 h后隨著乳桿菌屬數量增多其繁殖速率開始下降，當乳桿菌屬自24 h開始數量下降時其繁殖速率又升高。72 h后乳桿菌屬數量增加，而乳球菌屬數量減少，在發酵過程中似乎兩者之間存在某種相互作用；酸馬奶發酵起始所含醋酸菌屬（Acetobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）等多個細菌屬數量在發酵過程中減少，只有醋酸菌屬在48 h后其數量明顯增多；酸馬奶發酵過程中檢測到埃希菌屬（Escherichia）和志賀菌屬（Shigella）等致病菌，其平均含量為0.5%，發酵過程中受到抑菌活性物質[22]以及酸度變高[23]等影響數量越來越少。

圖5 基于屬水平的不同發酵時間點酸馬奶細菌豐度變化Fig. 5 Changes in bacterial abundance at genus level during the fermentation process of koumiss

2.4 基于多元統計方法的不同時間點酸馬奶細菌群落結構的比較分析

基于UniFrac的加權和非加權主坐標分析，其第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的貢獻率分別為65.23%和17.80%、25.97%和10.32%?；赨niFrac的加權（圖6）和非加權主坐標分析圖（圖7）結果基本一致，即0 h時3 組樣品的細菌群落結構是相似的，隨著發酵時間的延長，A、B兩組樣品呈現出一定的交疊現象，說明A、B兩組樣品的細菌群落結構呈現出一定的相似性。而C組樣品呈現出一定的聚類趨勢，說明C組樣品相對于A、B兩組樣品來講具有自己特殊的細菌群落結構。結果表明酸馬奶傳統發酵過程中，除了溫度與搗拌次數以外還有其他因素容易影響到細菌群落結構而使其發生改變。

MANOVA基于Weighted Unifrac PCoA前85%主成分分析基礎上的馬斯距離聚類結果顯示（圖8），0 h酸馬奶的細菌菌群群落結構與其他時間具有極顯著差異（P＜0.001）。12、72 h與96 h之間酸馬奶細菌群落結構差異不顯著（P＞0.05），24 h與48 h之間細菌群落結構差異不顯著（P＞0.05），然而12、72、96 h與24、48 h之間酸馬奶細菌群落結構差異極顯著（P＜0.001）。經過不同時間點酸馬奶細菌群落結構的比較分析發現酸馬奶發酵過程中細菌群落結構存在顯著動態變化。細菌群落結構變化差異性將發酵過程大體劃分為3 個階段，即0～12、24～48、72～96 h。

圖6 基于操作分類單元（9977%相似水平）相對含量的不同發酵時間點酸馬奶細菌菌群結構Unifrac加權PCoA分析分布圖Fig. 6 Principal coordinate analysis (PCoA) score plot based on the relative abundance of OTUs (97% similarity level) at different time points during the fermentation process of koumiss

圖7 基于操作分類單元（9977%相似水平）相對含量的不同發酵時間點酸馬奶細菌菌群結構Unifrac非加權PCoA分析分布圖Fig. 7 Principal coordinate analysis (PCoA) score plot based on the relative abundance of OTUs (97% similarity level) of bacterial community structure atdifferent time points during the fermentation process of koumiss

圖8 基于MANOVA分析的不同發酵時間點酸馬奶細菌群落結構馬斯距離聚類分析Fig. 8 Mahalanobis distance cluster analysis based on MANOVA analysis of bacterial community structure at different time points during the fermentation process of koumiss

2.5 核心細菌群分析

研究發現不同的發酵時間點酸馬奶中細菌菌群構成差異較大，但經過進一步分析發現它們具有相同的核心菌群。由18 個樣品所得477 個OTUs中，有24 個OTUs存在于所有的樣品，其中1 個OTU為巨型球菌屬，9 個OTUs為乳球菌屬，13 個OTUs為乳桿菌屬，1個OTU為醋酸菌屬，即在酸馬奶發酵96 h過程中有4 個菌屬一直存在，對于酸馬奶品質具有決定性作用，其分別為乳桿菌屬（51.06%）、乳球菌屬（30.29%）、醋酸菌屬（7.13%）和巨型球菌屬（0.70%）。

3 結 論

通過454焦磷酸高通量測序技術，得到了足夠的細菌16S rRNA基因高質量序列，經分析揭示了酸馬奶傳統發酵過程中細菌多樣性變化情況。酸馬奶發酵過程中存在豐富的細菌多樣性，其中硬壁菌門和變形菌門為優勢細菌門，乳桿菌屬為優勢細菌屬。

在酸馬奶發酵過程中，細菌群落結構存在顯著的演替變化。發酵初期細菌多樣性最高，主要來源于發酵劑。在發酵過程中不同菌群之間存在激烈的生存競爭和互生關系。酸馬奶發酵微生物中酵母菌[24]也是重要組成部分，將酵母菌等真核微生物一同進行分析是今后研究的重點。

基于非培養方法的分子生物學手段研究細菌多樣性雖然有著諸多優點，但是基因測序只能知道相對物種豐度，只能得到數據庫里已知物種無法確定新物種，無法得到菌體。因此在研究中應結合分離培養、形態觀察、生理生化特征鑒定等傳統方法，互相取長補短，才能更深入地揭示酸馬奶中微生物世界的奧秘。

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Dynamic Changes of Bacteria Community Structure during Koumiss Fermentation

Burenqiqige1,2, GAO Yahan1, REN Xiujuan1, BAO Yanqing1, WEI Ruiyuan1, ZHAO Yiping1, HAN Haige1, Wuyundalai1, HUANG Jinlong1, Dugarjaviin Manglai1,*
(1. Inner Mongolia Mongolian Horse Genetic Resources Protection and Industrial Engineering Laboratory, College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. Department of Basic Medical, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China)

Samples of koumiss during the fermentation period were taken for the extraction of metagenomic DNA. PCR amplifi cation of the 16S rRNA gene sequence was conducted followed by 454 pyrosequencing to analyze the succession of bacterial community structure. The main fi ndings were as follows: 1) The highest diversity of bacteria occurred at the early stage of fermentation, while bacterial abundance showed the maximum value at 72 h. 2) Firmicutes and Proteobacteria were the dominant phyla in koumiss fermentation. Lactobacillus and Lactococcus were the dominant bacterial genera. 3) With the extension of fermentation time, there were rising or falling trends in bacterial counts at phylum and genus levels. This study has provided a new understanding of dynamic changes in bacterial community structure during koumiss fermentation, which may offer some

for exploring bacterial community structure in other fermented dairy products.

koumiss; traditional fermentation; bacterial community structure; 16S rRNA

10.7506/spkx1002-6630-201611019

TS252.56

A

2015-11-24

國家科學技術部對俄科技合作專項（2011DFR30860）；內蒙古自治區科技廳重點實驗室建設項目（20130902）；內蒙古自治區科技廳應用技術研究與開發項目（20140172）；呼和浩特市科技計劃項目（2014-農-16）

布仁其其格（1982—），女，講師，博士研究生，研究方向為分子數量遺傳學。E-mail：qiqigejin@163.com

*通信作者：芒來（1962—），男，教授，博士，研究方向為分子數量遺傳學與馬的育種。E-mail：dmanglai@163.com