慢性應(yīng)激對大鼠行為學(xué)及腦神經(jīng)顆粒素水平的影響及藥物防治

徐天勇，李仲銘，劉　銳,　張　祥,　范　艷,　胡月新

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慢性應(yīng)激對大鼠行為學(xué)及腦神經(jīng)顆粒素水平的影響及藥物防治

徐天勇1，李仲銘2，劉銳3,張祥2,范艷2,胡月新1

目的探討慢性應(yīng)激對大鼠外顯行為學(xué)變化的影響，檢測體內(nèi)兒茶酚胺類物質(zhì)及神經(jīng)顆粒素(Neurogranin，Ng)表達(dá)的變化及三七皂苷Rg1的防治效果。方法成年雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為對照組(CON)、模型組(CUS)、和治療組(CUS-G)，采用慢性不可預(yù)見性應(yīng)激方法建立慢性應(yīng)激動物模型；采用曠場試驗檢測行為學(xué)變化，運(yùn)用Morris水迷宮實驗進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶力測試，使用放射免疫法檢測血漿、腦組織兒茶酚胺類含量，Western blot法檢測皮質(zhì)、海馬、下丘腦Ng含量。結(jié)果6 w慢性應(yīng)激后，實驗組大鼠在水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動方面得分均明顯低于對照組與藥物組，均P<0.05；水迷宮實驗顯示慢性應(yīng)激后動物逃避潛伏期明顯延長，而治療組大鼠逃避潛伏期呈下降趨勢(P<0.05)；血漿、腦組織去甲腎上腺素與多巴胺在對照組、實驗組與藥物組間無明顯變化；慢性應(yīng)激大鼠皮質(zhì)、海馬、下丘腦Ng含量水平皆與模型大鼠有差異(P<0.05、P<0.01、P<0.05)，治療大鼠皮質(zhì)、海馬、下丘腦Ng含量亦皆與模型大鼠有差異(P<0.01、P<0.05、P<0.05)。結(jié)論慢性應(yīng)激研究領(lǐng)域，神經(jīng)顆粒素的敏感性優(yōu)于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，可作為敏感指標(biāo)加以觀察；100 mg/kg劑量的三七皂苷Rg1能夠抑制應(yīng)激所致學(xué)習(xí)記憶功能紊亂，對應(yīng)激所致外顯行為有積極的調(diào)節(jié)作用，對腦內(nèi)神經(jīng)顆粒素表達(dá)水平降低趨勢有較好抑制作用。

慢性不可預(yù)見性應(yīng)激；學(xué)習(xí)記憶；兒茶酚胺類物質(zhì)；神經(jīng)顆粒素；三七皂苷Rg1

傳統(tǒng)應(yīng)激理論認(rèn)為過度應(yīng)激使腦組織兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)耗損，進(jìn)而引起情緒、認(rèn)知行為異常表現(xiàn)[1],近些年研究發(fā)現(xiàn)腦認(rèn)知功能區(qū)域特異性蛋白-神經(jīng)顆粒素亦在學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)發(fā)育方面扮演重要角色[2,3]。本實驗擬探討慢性應(yīng)激對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響及在此過程中兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)、Ng表達(dá)的變化，觀察三七皂苷Rg1對應(yīng)激模型大鼠腦組織兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)、Ng表達(dá)的影響，為應(yīng)激綜合征的臨床防治及新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器Morris水迷宮(北京杰日歐公司提供)；三七皂苷Rg1：白色晶狀粉末物質(zhì)，昆明制藥廠提供，純度>98.57%；兒茶酚胺放射免疫測定盒(天津協(xié)和醫(yī)藥科技有限公司代理，美國DIASOURCE公司)；GC-2016γ放射免疫計數(shù)儀(美國PICKER公司)；兔抗大鼠Ng抗體(Abcam公司)，山羊抗兔IgG辣根酶標(biāo)記(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，β-actin 單克隆抗體(美國Sigma公司)；Ge1.Doc凝膠成像半定量分析系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.2實驗動物及分組

1.2.1實驗動物成年健康雄性SD大鼠36只(體重200±5 g，昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，符合GB/T14925-94標(biāo)準(zhǔn))。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后,按隨機(jī)數(shù)字表法分為以下3組：對照組(CON)、慢性不可預(yù)見性應(yīng)激試驗組(CUS)、藥物治療組(CUS-G)，每組12只。

1.2.2造模及給藥方法采用以下應(yīng)激源:行為限制(2 h)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、食物剝奪(12 h)、飲水剝奪(12 h)合并空瓶刺激、明暗顛倒(12 h)、濕籠(12 h)、傾斜(45 ℃,12 h)刺激動物。實驗持續(xù)6 w，每天隨機(jī)抽取兩種應(yīng)激源作用于大鼠，使之無法預(yù)知何種刺激將要發(fā)生[1]。對照組飼養(yǎng)于同一環(huán)境，合籠飼養(yǎng)且無應(yīng)激源刺激，每次復(fù)制模型前1 h給3組大鼠灌胃，對照組、慢性不可預(yù)見性應(yīng)激組予以生理鹽水，藥物治療組予以三七皂苷Rg1100 mg/kg，藥物溶于純化水，灌胃容積均為0.6 ml/只[4,5]。

1.3行為學(xué)檢測

1.3.1曠場試驗裝置為36 cm×36 cm×36 cm無頂紙箱，箱底用墨線分成9個等分方格，將大鼠置于中央方格內(nèi)，觀察30 s內(nèi)活動情況。統(tǒng)計方法：動物1/2以上身體從所在方格進(jìn)入相鄰方格計1分，大鼠后肢直立計1分[1]。

1.3.2Morris水迷宮實驗實驗前、模型期結(jié)束后分別對大鼠進(jìn)行用Morris水迷宮測定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的能力。在水池上標(biāo)定相同一點(diǎn)作為每次實驗入水點(diǎn)，站臺置于離入水點(diǎn)較遠(yuǎn)的象限的中間，實驗采用預(yù)先訓(xùn)練兩次，將動物從相同入水點(diǎn)放入，每次訓(xùn)練2 min的方案，若動物在2 min 內(nèi)找到平臺，并在其上停留3 s為合格者，記錄其找到平臺的時間作為逃避潛伏期，若動物2 min內(nèi)未找到平臺，將動物放到平臺上使之停留3 s，其逃避潛伏期記為120 s，記錄第3次的數(shù)據(jù)作為評價標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.4標(biāo)本制備模型期結(jié)束后用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于手術(shù)臺，剪開胸腔，暴露心臟，用5 ml注射器針頭插入左心室，采血5 ml放入抗凝管中,3000 r/min離心10 min,取血清-20 ℃保存,待測。采血后立即灌注生理鹽水，待右心耳膨起，剪開右心耳讓血液流出，至右心耳流出液為無色透明，冰浴環(huán)境下剖顱分離皮質(zhì)、海馬[5]。

1.5腦組織制備冰浴環(huán)境下剖顱分離的腦組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入2 ml PE管內(nèi)；用移液管量取9倍于組織塊重量預(yù)冷的0.86%冷生理鹽水(用0.9%生理鹽水進(jìn)行調(diào)配)于PE管中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊；超聲粉碎(振幅12.7 mm，30 s),將制備好的10%勻漿用低溫低速離心機(jī)3000 r/min左右，離心10 min，離心好的勻漿留上清棄沉淀[5]。

1.6血漿、腦組織兒茶酚胺類物質(zhì)檢測按放免診斷藥盒說明操作,用GC-1200γ計數(shù)放免儀檢測血液、腦組織兒茶酚胺含量。

1.7蛋白免疫印跡檢測Ng表達(dá)冰浴環(huán)境下剖顱分離的皮質(zhì)、海馬組織，液氮速凍后研磨成粉狀，分別取50 mg皮質(zhì)、海馬組織，加入750 μl RIPA buffer，冰浴下勻漿，4 ℃，12000 rpm離心30 min，取上清進(jìn)行BCA法蛋白濃度測定。取樣本加入上樣緩沖液后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，以封閉液封閉2 h后加入一抗(1∶800)，4 ℃搖晃孵育過夜，TPBS漂洗3次，每次15 min，加入羊抗兔IgG抗體(1∶3000)，室溫孵育2 h；TPBS漂洗3次/15 min。將PVDF膜上加入ECL發(fā)光液，待反應(yīng)1 min后，放入膠片、顯影、定影，膠片經(jīng)Bio-Rad膠片掃描系統(tǒng)掃描后，Ge1.Doc凝膠成像分析軟件分析，蛋白表達(dá)水平以Ng光密度值與對應(yīng)內(nèi)參β-actin光密度值比值表示，單位為光密度單位(Optical Density Unit，ODU)[6]。

2　結(jié)　果

2.1慢性不可預(yù)見性應(yīng)激對大鼠曠場作業(yè)的影響實驗前各組大鼠在單位時間內(nèi)在水平運(yùn)動、垂直運(yùn)動得分無差異，6 w慢性應(yīng)激后實驗組大鼠在水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動方面得分與對照組、藥物組呈現(xiàn)明顯差異，均P<0.05(見圖1、圖2)。

2.2學(xué)習(xí)記憶變化(水迷宮實驗)實驗前對大鼠進(jìn)行水迷宮測試，結(jié)果表明各組動物逃避潛伏期無明顯差異；實驗開始3 w后對照組、藥物組動物水迷宮測試逃避潛伏期呈現(xiàn)不同程度縮短并持續(xù)到第6周，實驗組逃避潛伏期在第3周已顯現(xiàn)延長趨勢并持續(xù)到第6周，并在第3周、第6周分別與對照組、藥物組形成較大差異(見表1)。

2.3血漿兒茶酚胺含量的變化及藥物干預(yù)作用6 w慢性應(yīng)激后，實驗組血漿多巴胺和去甲腎上腺素均有不同程度的升高，但與空白組、藥物組尚無明顯差異,均P>0.05(見表2)。

2.4腦組織兒茶酚胺含量的變化及藥物干預(yù)作用6 w慢性應(yīng)激后，實驗組大鼠腦組織多巴胺有升高趨勢，去甲腎上腺素則呈下降趨勢，但不同趨勢與空白組、實驗組均無統(tǒng)計學(xué)意義,均P>0.05(見表3)。

2.5慢性應(yīng)激對大鼠腦組織Ng蛋白質(zhì)表達(dá)的影響通過Western-blotting分析發(fā)現(xiàn)，6 w應(yīng)激后，大鼠皮質(zhì)、海馬、下丘腦神經(jīng)顆粒素蛋白帶的平均光密度值(IOD)均有不成程度改變：皮質(zhì)實驗組神經(jīng)顆粒素蛋白表達(dá)顯著降低，并與空白組、藥物組形成顯著性差異，均P<0.01；海馬實驗組神經(jīng)顆粒素蛋白表達(dá)顯著降低，并與空白組、藥物組形成明顯、顯著性差異，P<0.05/P<0.01；下丘腦實驗組神經(jīng)顆粒素蛋白表達(dá)亦降低，但與空白組尚未形成明顯差異，可能與時間點(diǎn)尚未到達(dá)有關(guān)，而實驗組與藥物組形成則明顯差異，P<0.05。上述結(jié)果表明慢性應(yīng)激使得神經(jīng)顆粒素蛋白在皮質(zhì)、海馬和下丘腦中的表達(dá)均成降低趨勢，使用三七皂甙后能改變蛋白表達(dá)降低趨勢(見表4)。

表1　各組小鼠4 w 5次水迷宮測試成績比較　(單位

與CON組比較#P<0.01；與CUS組比較*P<0.05,**P<0.01

組別例數(shù)DANECONCUSCUS?G12121251．47±2．3458．36±5．753．64±3．4392．06±6．12101．11±10．599．93±3．79

組別例數(shù)DANECONCUSCUS?G1212127．31±1．488．49±1．677．52±1．821．06±0．120．97±0．101．05±0．12

表4　Western blot法檢測各組大鼠腦組織Ng蛋白表達(dá)影響　(單位

與CON組比較#P<0.05,##P<0.01；與CUS組比較*P<0.05,**P<0.05

與CON組比較#P<0.05；與CUS組比較*P<0.05

3　討　論

本次研究采用諸多不可預(yù)見性刺激因子模擬日常持續(xù)性低強(qiáng)度生活事件以最大程度模擬由各種長時程、低強(qiáng)度、適應(yīng)不良等各類生活事件所引起的慢性應(yīng)激狀態(tài)，與高強(qiáng)度刺激因素相比,此模型軀體應(yīng)激因素較小，能更好地突出心理或情緒因素，是一種較好的負(fù)性心理應(yīng)激動物模型[1，7]。

曠場試驗結(jié)果表明實驗前各組大鼠在新異環(huán)境中的探究行為和對新環(huán)境的警覺性并未有差異，因而其水平運(yùn)動與垂直運(yùn)動得分并未有異常表現(xiàn)，隨著應(yīng)激時程延長，應(yīng)激大鼠水平、垂直活動次數(shù)減少，在原格停留時間延長，上述改變表明應(yīng)激大鼠的活動度降低，對新鮮環(huán)境的好奇程度降低，動物的絕望和行為退縮行為增強(qiáng)，行為表現(xiàn)由初始的興奮狀態(tài)過渡到抑制狀態(tài)。此外，應(yīng)激開始前預(yù)防性給予三七皂苷Rg1直至應(yīng)激結(jié)束，則能改善大鼠在曠場試驗中的表現(xiàn)，即水平運(yùn)動與垂直運(yùn)動得分比實驗組大鼠增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明三七皂苷Rg1能改善由慢性應(yīng)激引起的體力下降、興趣缺乏及活動遲滯，減輕了動物自身的疲勞感，使機(jī)體保持一定的興奮性，不同程度地逆轉(zhuǎn)模型大鼠的“軀體疲勞”和“心理疲勞”，使其體力恢復(fù)、活動增加。

較多研究資料證實，應(yīng)激因素作用于機(jī)體時，通過多種通路引起神經(jīng)遞質(zhì)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及突觸可塑性等方面的改變，從而影響機(jī)體學(xué)習(xí)記憶功能[8～10]。因此，對學(xué)習(xí)記憶力能力的評估亦為評價慢性應(yīng)激程度的主要檢測方法。本研究運(yùn)用Morris水迷宮實驗對大鼠空間覓向能力和空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激后大鼠空間記憶能力明顯受損，即應(yīng)激大鼠逃避潛伏期明顯延長，提示慢性束縛應(yīng)激可導(dǎo)致實驗動物對已儲存記憶的讀出或提取過程產(chǎn)生負(fù)面影響。應(yīng)激前預(yù)防性給予三七皂苷Rg1直至應(yīng)激結(jié)束，應(yīng)激期后水迷宮實驗結(jié)果顯示大鼠在Morris水迷宮測試中的成績有明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而認(rèn)知行為是腦力作用的表現(xiàn)形式之一，表明三七皂苷Rg1能改善應(yīng)激所致的學(xué)習(xí)記憶功能的損傷。

慢性應(yīng)激與學(xué)習(xí)記憶間關(guān)系的研究，既往研究主要集中在腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系方面。腦組織茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與機(jī)體覺醒、注意力和學(xué)習(xí)記憶功能的調(diào)節(jié)。先前本課題組研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激導(dǎo)致動物腦組織兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少，動物學(xué)習(xí)記憶能力降低的外顯行為學(xué)表現(xiàn)亦有明顯改變，上述變化與應(yīng)激致腦組織對兒茶酚胺類(Catecholamines,CA)神經(jīng)遞質(zhì)的消耗增加，而外周CA又因肝酪氨酸氨基轉(zhuǎn)化酶活性增高而分解加速，影響CA合成前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[11～13]。

在本次研究中，動物歷經(jīng)6 w慢性應(yīng)激后，實驗動物腦組織多巴胺和去甲腎上腺素等CA類神經(jīng)遞質(zhì)的消耗與非應(yīng)激動物相比并未有明顯變化，P>0.05，進(jìn)而又對血漿CA進(jìn)行檢測，實驗動物血漿多巴胺和去甲腎上腺素等CA類物質(zhì)的含量與非應(yīng)激動物相比并未有明顯變化，P>0.05，預(yù)防性給予三七皂苷Rg1并未使血漿、腦組織CA有明顯改變，P>0.05，上述實驗結(jié)果與之前研究結(jié)果有明顯差異(既往諸多研究結(jié)果提示慢性應(yīng)激致使動物血漿/腦組織多巴胺和去甲腎上腺素等CA類物質(zhì)含量發(fā)生變化)，提示學(xué)習(xí)記憶減退并非由單一因素決定，尚有其余神經(jīng)相關(guān)物質(zhì)參與應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)[1]。

皮質(zhì)、海馬、下丘腦作為學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知活動的重要腦區(qū)，其內(nèi)部必然有除DA、NE以外與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的功能性物質(zhì)和結(jié)構(gòu)存在；否則，學(xué)習(xí)記憶的電生理活動無法引起神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)學(xué)變化和功能新變化[14～16]。研究發(fā)現(xiàn)在皮質(zhì)、海馬、下丘腦的區(qū)域神經(jīng)元胞體、樹突和樹突棘間內(nèi)部存有由78個氨基酸組成的高密度神經(jīng)元突觸后膜蛋白-神經(jīng)顆粒素，深入研究表明神經(jīng)顆粒素作為蛋白激酶C的天然作用底物和鈣調(diào)蛋白CaM的結(jié)合蛋白，參與神經(jīng)元的突觸形成、分化，而后者在學(xué)習(xí)能力的高低及記憶持久性方面扮演重要角色[17～20]。

本次研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激致使皮質(zhì)、海馬、下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞Ng蛋白含量下降，進(jìn)而致使神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少伴突棘數(shù)量減少，突觸可塑性的損害造成大鼠水迷宮實驗潛伏期延長，外顯為學(xué)習(xí)記憶能力的降低。使用三七皂苷Rg1后Ng蛋白含量明顯升高，甚至略高于對照組，提示三七皂苷Rg1具有對抗慢性應(yīng)激所致Ng蛋白含量下降之積極作用，而Ng蛋白含量的升高促使皮質(zhì)、海馬、下丘腦細(xì)胞和/或樹突棘結(jié)構(gòu)的數(shù)量隨之上升，進(jìn)而促進(jìn)突觸可塑性及突觸傳遞效能增強(qiáng)，使得學(xué)習(xí)記憶功能得以提高。但三七皂苷Rg1如何上調(diào)Ng蛋白含量的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可致動物出現(xiàn)不同程度的行為學(xué)變化，而應(yīng)激動物血液和腦組織中兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)并未出現(xiàn)大幅度變化，甚至變化趨勢亦未有之，提示傳統(tǒng)兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)理論并非影響學(xué)習(xí)記憶之唯一因素；而定位于皮質(zhì)、海馬、下丘腦內(nèi)部的神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì)NG卻產(chǎn)生明顯變化，故而在學(xué)習(xí)記憶的研究領(lǐng)域，神經(jīng)顆粒素的敏感性優(yōu)于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，在今后的研究中可將其作為敏感指標(biāo)加以觀察。此外，本研究尚發(fā)現(xiàn)100 mg/kg劑量的三七皂苷Rg1能夠抑制應(yīng)激所致學(xué)習(xí)記憶功能紊亂，對應(yīng)激所致外顯行為有積極的調(diào)節(jié)作用，對腦內(nèi)神經(jīng)顆粒素表達(dá)水平降低趨勢有較好的上調(diào)作用。

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Research of ginsensode Rg1 on the expression of neurogranin in chronic unpredictable stress model rats

XUTianyong,LIZhongming,LIURui,etal.

(ExperimentCenterforMedicalScienceResearch,KunmingMedicalCollege,Kunming650031,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Ginsensode Rg1 on the expression of Neurogranin (Ng) in cortex,hippocampus and hypothalamus of rats with chronic stress model.Methods36 adult male SD rats were randomly divided into control group (CON),model group (CUS),and treatment group (CUS-G).The chronic stress model was established by chronic unpredictable stress.The morris water maze was used to study the memory test.The expressions of DA and NE were detected by using radioimmunoassay.The content of Ng in cortex,hippocampus and hypothalamus was detected by Western blot.ResultsThe water maze test showed that animal learning and memory ability decreased significantly after chronic stress,while the treatment group rats escape latency was significantly reduced,P<0.05；compared with control group，the content of DA and NE did not decrease significantly in model group (P>0.05).After 6 weeks of stress,rat cerebral cortex,hippocampus,hypothalamus Ng levels with chronic stress were significantly decreased compared with the model rats (P<0.05,P<0.01,P<0.05 respectively),the content of Ng content in cerebral cortex,hippocampus,hypothalamus were significantly increased with the model rat (P<0.01,P<0.05,P<0.05 respectively).ConclusionsIn chronic stress field,Ng is more sensitive than the monoamine neurotransmitters,it can be used as sensitive indicators to be observed.Chronic stress could change the behaviors of mice observably and the contents of Ng,the supplement of Ginsensode Rg1(100 mg/kg)could come into being some interference effects.

Chronic stress;Learning/memory；Atecholamines：Neurogranin；Ginsensode Rg1

1003-2754(2016)04-0311-05

2015-12-15；

2016-01-29

2012年云南省教育廳科學(xué)研究基金(2012C005);2014年國家自然科學(xué)基金(81460192)

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)科研實驗中心,云南 昆明 650031;2.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系,云南 昆明 650031;3.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗中心，云南 昆明 650031)

胡月新,E-mail:hyxjx@sina.cn

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