宮頸上皮內瘤變進展相關基因的生物信息學分析*

蔣燕明 李力

·基礎研究·

宮頸上皮內瘤變進展相關基因的生物信息學分析*

蔣燕明 李力

目的：基于芯片數據采用生物信息學方法，挖掘與宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）進展相關的信號通路和潛在差異表達基因。方法：在GEO數據庫中篩選CIN進展相關mRNA表達譜芯片數據，并通過生物信息學方法進行再次分析。結果：在GEO數據庫獲得GSE63514、GSE51993芯片數據，將共同差異表達基因信號通路富集獲得Wnt、Endocytosis、Vibrio cholerae infection與CIN進展顯著相關的3條信號通路，及調控這些信號通路的14個差異表達基因。通過生物學注釋與文本挖掘，發現3個基因與CIN進展相關，另有9個基因與腫瘤的進展和復發相關。通過GeneMania工具分析發現所有篩選的基因都與已知的CIN相關基因互作形成蛋白互作網絡。其中CCND2和TGFBR2與多個已知基因存在直接互作。結論：通過對芯片數據再次分析，篩選出3條信號通路及14個差異表達基因與CIN進展相關。

宮頸上皮內瘤變進展表達譜基因芯片生物信息學

宮頸癌的形成是由炎癥到宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）最后發展到浸潤癌的連續演變過程，演變時間需10～25年。由于開展細胞學檢查聯合乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）檢測，使CIN易早期發現，降低了宮頸癌的發病率。高危HPV感染是宮頸癌和CIN的主要病因［1］，但并非所有的HPV感染都會導致CIN和宮頸癌，也不是所有的CIN都會演變為宮頸癌。因此，研究CIN進展相關的標志物并逆轉CIN進展對宮頸癌的早診早治有著重要的臨床意義。

生物信息學是由生物學、化學、物理、數學、信息科學和計算機科學等多學科交叉產生的新興學科。近年來，生物信息學方法通過在分子水平上進行數據挖掘，為研究包括腫瘤在內的各種疾病的分子發病機制提供了新的思路。本研究通過收集GEO數據庫中已與CIN進展有關的芯片數據，分析mRNA表達譜，篩選差異表達基因，并通過生物學過程注釋、生物信號通路富集、文本挖掘及蛋白/基因互作等綜合生物信息學方法再次分析，以挖掘與CIN進展相關的信號通路和基因，進一步在分子水平上研究CIN進展，為宮頸癌的作用機制提供線索和思路。

1 材料與方法

1.1數據集的獲取和分析

在美國國立生物中心（NCBI）的GEO數據庫中檢索并下載與CIN進展相關的mRNA表達譜芯片數據。以“cervical intraepithelial neoplasia”為關鍵詞檢索，限制研究類型為expression profiling by array，限制種屬為homo sapiens，檢索2015年10月以前已報道的與CIN進展相關基因表達譜，下載符合納入條件的mRNA表達譜芯片數據集GSE63514［2］、GSE51993進行分析。

1.2差異表達基因的篩選

利用GEO數據庫的GEO2R工具進行差異表達基因的篩選。GEO2R［3］是2012年最新開放的一個基于R語言程序的數據集分析工具，能夠對相同實驗條件下的兩組樣品進行對比，從而篩選出差異表達基因。本研究以P＜0.05和2倍變化為閾值，以CIN組織標本和正常組織標本分別為實驗組和對照組進行有關CIN進展的差異表達基因的篩選，并進一步通過Venn作圖工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/Venn/）挑選出實驗組和對照組的兩組表達譜數據中共有的差異表達基因。

1.3差異表達基因的生物信息學分析

采用DAVID［4］（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）進行差異表達基因的信號通路富集；通過COREMINE進行生物學注釋（http：//www.coremine.com/medical/）；通過GeneMania［5］（http：//www.genemania.org/）進行蛋白/基因互作分析。

2 結果

2.1芯片數據集

篩選出GSE63514和GSE51993兩組芯片數據，其中GSE63514由威斯康星大學莫格里奇研究所采用GPL570芯片平臺完成，數據樣本為24例正常宮頸組織、14例CIN1、22例CIN2、40例CIN3和28例宮頸癌組織；GSE51993由復旦大學采用GPL10558芯片平臺完成，數據樣本為7例正常宮頸組織、9例CIN1和8例CIN3。

2.2GSE63514和GSE51993芯片數據中共同差異表達基因篩選

對GSE63514和GSE51993數據集通過GEO2R進行差異表達基因篩選。本研究以P＜0.05、2倍變化閾值為條件進行嚴格篩選，在GSE63514芯片中共篩選出5 028個上調及4 303個下調差異表達基因；在GSE51993芯片中共篩選出858個上調及999個下調差異表達基因。將GSE63514和GSE51993芯片中的上調和下調基因分別采用Venn作圖工具繼續篩選，獲得144個共同上調和219個共同下調差異表達基因（圖1）。

圖1　GSE63514和GSE51993芯片數據的共同差異表達基因篩選Figure 1Analysis of the common differentially expressed genes in the two microarray datasets of GSE51993 and GSE63514

2.3CIN組與正常組Pathway分析

對于上述144個共同上調和219個共同下調差異表達基因，采用DAVID對KEGG數據庫進行生物信號通路（Pathway）富集分析，并統計每一條基因富集信號通路的P及FDR值。Pathway分析可尋找富集共同差異表達基因的信號通路，推斷出與不同的組織樣本差異表達基因相關的細胞信號通路，根據P＜0.05篩選出差異顯著的信號通路（表1）。

表1　共同差異表達基因的信號通路分析Table 1Pathway analysis of common differentially expressed genes

2.4共同差異表達基因與CIN進展相關性分析

為從整體水平上揭示GSE63514和GSE51993芯片中共同差異表達基因在CIN進展中的生物學意義，本研究對信號通路富集獲得的基因進行相關性分析。共同上調差異表達基因獲得Wnt信號通路和內吞作用信號通路，共同下調差異表達基因獲得霍亂弧菌感染信號通路，這3條信號通路的差異表達基因共14個。在GSE63514和GSE51993芯片中上述基因的表達趨勢完全一致，其中SH3KBP1已被證明在宮頸癌組織中高表達，其余基因未見相關報道（表2）。

通過COREMINE進行生物學注釋與文本挖掘，以進一步說明14個信號通路富集獲得的基因與CIN進展之間的關系。以基因名稱、CIN、進展（progression）、復發（recurrence）為關鍵詞進行文獻共現分析，發現除PPP2R5D和PIKFYVE外，其余12個基因存在于注釋網絡中，其中3個基因（CCND2、TGFBR2、MUC2）與CIN進展直接相關，另外9個基因雖未和CIN直接相關，但與腫瘤的進展和復發存在共現文獻。另外，除與CIN、進展、復發顯著相關外，這些基因相互之間也顯著相關，如TGFBR2和WNT2B等（圖2）。

2.5信號通路富集獲得基因與CIN進展相關蛋白基因互作分析

本研究通過PubMed以CIN和進展為進行文獻搜索，發現24個與CIN進展有關的已知基因，通過GeneMania工具分析14個信號通路富集獲得基因與CIN進展相關基因之間的關系（圖3）。結果發現所有篩選的基因都通過直接或間接的方式與24個已知的CIN相關基因互作形成蛋白互作網絡，說明這些基因可能在功能上相關，從而提示篩選的基因可能也與CIN相關。特別是CCND2和16個基因（CDKN2A［7］、CADM1、CCL2、CTNNB1、ERBB2、IMP3［8］、MYC、PHGDH、PIK3CA、PRKCI、PTGS2、TP53、TP53BP1、TP63、FOXO1和ITCH）存在直接互作，TGFBR2與12個已知基因（CADM1、CTNNB1、EGFR［9］、IMP3、MAPK1、MYC、PIK3CA、PRKCI、PTGS2、STK11、TP53、FOXO1）存在直接互作。另外，在蛋白網絡中，篩選出的14個基因之間也通過各種方式相互互作，如CCND2與PRKCB、SH3KBP1、TGFBR2、KDELR1直接互作，TGFBR2也與篩選的8個（CCND2、NFATC1、PPP2R5D、SH3KBP1、HSPA6、PIKFYVE、RABEP1、TJP2）差異表達基因存在直接互作關系。

表214　個共同差異表達基因的表達趨勢Table 2Fourteen differentially expressed genes exhibiting exactly the same expression pattern trends

?圖2共同差異表達基因與進展、復發之間的文獻共現圖Figure 2Literature co-occurrence of the differentially expressed genes related to progression and recurrence

?圖3已知基因與篩選基因互作關系圖Figure 3Diagram of the reported genes and the screened gene interactions

3 討論

CIN是介于宮頸炎癥到宮頸癌之間的可治愈的一種癌前病變，然而并不是所有的CIN都會演變為宮頸癌，CIN如何進展為宮頸癌的機制一直未能較好闡明，可預警進展的標志物也一直未確定。因此，進一步在分子水平上探討CIN進展的調控機制，鑒定CIN調控相關的信號通路和關鍵基因對于CIN的治療具有非常重要的意義。本研究基于GEO芯片數據挖掘，綜合生物信息學研究，篩選出與CIN進展顯著相關的Wnt、內吞作用和霍亂弧菌感染3條信號通路，及3條信號通路上的14個差異表達基因，而存在于Wnt信號通路上的CCND2和TGFBR2可能是CIN進展相關的潛在關鍵基因。

GEO數據庫的GEO2R是一種常用的源于R語言程序的差異表達基因分析工具。Zou等［10］基于該數據庫分析，篩選出在卵巢癌耐藥中的38個差異表達基因和9個miRNAs。目前國內外使用該工具綜合性分析與CIN進展有關的基因和作用機制以及與臨床因素的關系鮮有報道。本研究通過廣泛搜索，查尋來源于正常和CIN的GSE63514和GSE51993兩組mRNA基因芯片表達譜，經GEO2R和Venn作圖工具選擇兩組芯片共有的差異表達基因，為篩選與CIN進展有關的基因提供理論基礎。經DAVID對KEGG數據庫進行富集分析，所選擇的基因富集的3條信號通路均具有顯著性差異，因此說明這些富集信號通路可能在CIN的進展中起一定作用，在富集信號通路上查找差異表達基因成為可能。

在具有顯著性差異的3條信號通路中，Wnt研究最多也最徹底。研究表明Wnt可能抑制細胞凋亡、加速細胞周期以及提高細胞增殖能力，進而影響腫瘤的發生，并在多種腫瘤的侵襲和轉移中發揮重要作用［11］。最新研究也提示其參與了宮頸病變的致癌機制［12］。由此推測Wnt可能是CIN發生發展中的重要信號通路，而基于這條信號通路的CIN進展研究可能為阻斷CIN進展提供新的解決方法。內吞信號通路參與了細胞多種生理活動的信號轉導，包括細胞生長和分化、細胞趨化以及免疫反應等。研究發現SH3KBP1［6］在宮頸癌組織中高表達，而該信號通路中的核心蛋白Dynamin 2為有價值的CIN病變分級標志物，是檢測高敏感低級別CIN的候選標志物［13］，并提示在CIN進展中也可能起著一定的作用。雖然目前鮮有關于霍亂弧菌感染信號通路與宮頸癌、CIN關系的報道，但研究發現霍亂毒素（CT）作為載體在使用樹突狀細胞（DC）作為抗原呈遞細胞時能增強體外HPV病毒的人類T細胞應答［14］，而基于高危HPV感染是宮頸癌和CIN的主要病因，由此表明霍亂弧菌感染信號通路參與宮頸病變發生的可能性。

3條信號通路上的14個差異表達基因，經文獻搜索發現，有12個基因在宮頸癌和CIN中鮮有相關報道，但發現SH3KBP1［6］和CCND2［15］在宮頸癌組織中高表達。另外，本研究通過生物學注釋過程發現部分差異表達基因（CCND2、TGFBR2、MUC2）與CIN進展直接相關，大部分基因雖與CIN無直接相關，但與腫瘤的進展和復發相關，基因相互之間也顯著相關。結果提示在CIN組織中挖掘的14個差異表達基因可能在CIN的進展中起到一定的作用，而與CIN進展直接相關的CCND2、TGFBR2、MUC2基因則可能直接參與了CIN進展的調控。

本研究基于GeneMania進行了14個基因和24個已知與CIN進展相關基因的蛋白互作分析，結果發現所有篩選的基因不僅與已知基因互作形成蛋白互作網絡，而且這些基因之間也通過各種方式互作，進一步支持說明篩選的基因可能在功能上相關，且作為一個整體參與CIN進展調控。在14個基因中，CCND2和TGFBR2與CIN進展的相關性可能更為顯著，因此可能是CIN進展調控相關的重要候選基因，但結果有待進一步的深入研究證實。Du等［16］發現CCND2下調表達后調節細胞周期G1/S轉換，進而抑制HeLa細胞的增殖，而其參與CIN進展的機制至今尚未有報道，在此基礎上明確該機制對治療CIN有著重要意義。

綜上所述，本研究通過已報道的GEO芯片數據進行生物信息學分析，篩選出3條信號通路中Wnt信號通路可能是CIN進展中的重要信號通路；篩選出14個基因，其中CCND2和TGFBR2可能是CIN進展調控相關的重要候選基因。本研究也說明利用生物信息學方法能有效地篩選和再次分析基因芯片數據，從而大規模、高效地獲取生物內在信息，為確定CIN進展的標志物及CIN治療開辟了新的思路，同時還為3個未知基因（CCND2、TGFBR2、MUC2）的功能研究提供了新方向。由于可查找的芯片數據僅兩組（GSE63514和GSE51993），一定程度上限制了差異表達基因的篩選，追蹤更新的芯片數據進行生物信息學分析，并將進一步對篩選的基因進行功能驗證。

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（2016-05-26收稿）

（2016-09-22修回）

蔣燕明專業方向為婦科腫瘤臨床及基礎治療等。

E-mail：yanmingj@126.com

Bioinformatics analysis of genes related to the progress of cervical intraepithelial neoplasia

Yanming JIANG，Li LI
Correspondence to:Li LI；E-mail:lili@gxmu.edu.cn

Department of Gynecology Oncology，Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Laboratory of Early Prevention and Treatment for Regional High Frequency Tumor Ministry of Education Key Laboratory，Nanning 530021，China

This work was supported by the Public Welfare Special Research Fund of National Health and Family Planning Commission（No.201402010）AbstractObjective:To investigate the potential genes associated with cervical intraepithelial neoplasia（CIN）progression through microarray expression profiling data analysis and bioinformatics approaches.Methods:mRNA expression microarray data related to CIN progression were screened from GEO database for the first time.They were re-analyzed by bioinformatics analysis.Results:Two mRNA expression microarray datasets were obtained from the GEO database.Pathway enrichment analysis of the common differentially expressed genes identified 3 signaling pathways associated with CIN progression，including Wnt，Endocytosis，and Vibrio cholerae infection.Fourteen differentially expressed genes were also identified.Biological annotation and text mining showed that 3 genes were directly related to CIN progression，and 9 other genes were associated with tumor progression and recurrence.GeneMania tool analysis demonstrated the protein interaction network formed between all the differentially expressed genes and the 24 reported genes.CCND2 and TGFBR2 formed direct interaction with many reported genes.Conclusion:Three signaling pathways and 14 differentially expressed genes were associated with CIN progression，as indicated by microarray data analysis results.

cervical intraepithelial neoplasia，progress，expression profiling，microarray gene，bioinformatics

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.19.614

廣西醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科，區域性高發腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室（南寧市530021）

*本文課題受國家衛生和計劃生育委員會公益性行業科研專項項目（編號：201402010）資助

李力lili@gxmu.edu.cn