補腎益髓方及其拆方對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦和脊髓中p-Tau和Beta-tubulin表達的影響

師一民　王永強　安　辰　趙　暉　齊　放　張秋霞　陳振振　樊永平　李　明　王　蕾

(1 首都醫科大學中醫藥學院中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京，100069； 2 首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京，100050)

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實驗研究

補腎益髓方及其拆方對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦和脊髓中p-Tau和Beta-tubulin表達的影響

師一民1王永強1安辰1趙暉1齊放1張秋霞1陳振振1樊永平2李明1王蕾1

(1 首都醫科大學中醫藥學院中醫絡病研究北京市重點實驗室，北京，100069； 2 首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京，100050)

目的：觀察補腎益髓(Bu Shen Yi Sui，BSYS)方及其拆方補腎(Bu Shen，BS)和化痰活血(Hua Tan Huo Xue，HTHX)方對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)小鼠腦和脊髓中p-Tau和Beta-tubulin的作用。方法：C57BL/6小鼠雌性隨機分為正常對照(NC)、模型(MO)、醋酸潑尼松(PA)、梓醇(CA)、BSYS、BS和HTHX組。造模當天與造模后第7天于小鼠背部兩側皮下注射抗原，即50 μg髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)35-55、完全弗氏佐劑(CFA)與結核分支桿菌(TB)混合，并在免疫當天和2 d后腹腔注射500 ng的百日咳毒素(PTX)。每天對小鼠進行灌胃，觀察其體重及神經功能評分，并于造模第20 d和第40 d分別取腦和脊髓進行病理檢測。采用免疫組化法檢測p-Tau和beta-tubulin的表達。結果：與MO組比較，BSYS、BS和HTHX組體重與神經功能評分均出現明顯上升，HE染色可觀察到炎細胞顯著減少，核固縮減輕，同時，BSYS、BS和HTHX方均可明顯下調p-Tau表達(P<0.05，P<0.01)，上調beta-tubulin蛋白表達(P<0.05，P<0.01)。結論：BSYS方及其拆方BS和HTHX均對EAE小鼠有神經保護作用，表現在減少體重丟失，降低神經功能評分，減輕炎炎性細胞浸潤，減輕軸突損傷及促進其修復，尤以BSYS全方更為顯著。

補腎益髓方及其拆方；多發性硬化；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；P-Tau；Beta-tubulin

多發性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一種中樞神經系統(Central Nervous System，CNS)自身免疫反應介導的炎性神經退行性病變[1]，病理學改變是以CNS內存在多處炎性反應、髓鞘脫失、軸突損傷、膠質增生和程度不一的髓鞘再生為特征[2]。其中軸突損傷與患者神經功能障礙密切相關[3]，患者還伴有認知功能障礙、感覺障礙、視力障礙、疲勞、共濟失調等相關癥狀[4-6]。因此，如何促進軸突損傷的修復對于臨床治療具有重要意義。但現代醫學對于MS患者的治療多為調節免疫反應，對于神經修復面臨諸多困難[7]。

中醫藥在促進軸突再生修復方面有潛在優勢，研究發現，中藥在改善MS癥狀、調節免疫功能、促進神經功能恢復、減緩疾病進程等都方面具有較好的療效[8]。中醫認為MS以正虛為本，邪實為標。本虛涉及脾、肝、腎三臟不足，標實有瘀血、痰濁、熱毒、水濕、腑實、痰蒙竅閉等差異[9]。經過大樣本臨床病例的統計分析，MS患者的基本病機概括為肝腎陰虛和痰瘀阻絡[10]。補腎益髓方(原稱二黃方)是天壇醫院樊永平教授在長期治療MS的臨床實踐中創立的有效方，具有補腎化痰活血的功效，對腎虛兼痰瘀互阻的MS患者效果明顯[11]。前期實驗研究也發現，BSYS方對MS動物模型EAE有明顯的防治作用。能夠有效減輕髓鞘脫失與軸突損傷，促進神經再生與修復[12-13]。

Tau蛋白是一種微管相關細胞骨架蛋白，可在神經元與軸突中高度表達，其異常磷酸化導致細胞內神經纖維纏結，造成相關神經遞質的運輸、儲存和釋放障礙，故可作為反映軸突損傷的指標蛋白[14]。Beta-tubulin是組成神經元微管的重要蛋白之一，能夠促進細胞的生長、分裂及維持細胞骨架的穩定，在促進突觸可塑性調節、突起形成、結構穩定和神經元發育中發揮重要作用[15]。故其可以作為軸突修復的指標蛋白。

為了深入探討BSYS方的作用機制，我們依其治法將其拆分為BS和HTHX方進行研究。主要采用免疫組化法(Immunohistochemistry，IHC)觀察BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠的作用及對其腦與脊髓中p-Tau和beta-tubulin表達的影響。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物70只SPF級C57BL/6雌性小鼠，體質量控制在15～17 g。購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號為SCXK(京)2012-0001]。動物飼養于首都醫科大學實驗動物中心(許可證號SYXK(京)2010-0020)，具備獨立通氣籠(Individual Ventilated Cages，IVC)系統，單籠飼養，溫度18～22 ℃，相對濕度40%～60%，自由接觸飼料和飲水。每日上午添加飼料、更換水和墊料。所有實驗均經首都醫科大學倫理委員會批準。

1.1.2實驗藥物BSYS方由生地黃、熟地黃、浙貝母、水蛭、全蝎、益母草等組成；BS方由生地黃、熟地黃等組成；HTHX方由浙貝母、水蛭、全蝎、益母草等組成，均由北京亞東生物制藥有限公司制備。醋酸潑尼松片(Prednisone Acetate，PA)由天津力生制藥有限公司生產，梓醇(Catapol，CA)由杭州康木科技有限公司提供。

1.1.3主要試劑髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein，MOG)35-55由北京旭和源生物科技有限公司合成；完全弗氏佐劑(Complete Freund′s Adjuvant，CFA，貨號F5881)、百日咳毒素(Pertussis Toxin，PTX，貨號P7208)均由美國Sigma公司提供；滅活結核分支桿菌(Mycobacterium Tuberculosis，TB，貨號231141)由美國BD公司提供。p-Tau抗體(貨號ab131354)和Beta-tubulin(貨號ab6046)均由美國Abcam公司提供；Alexa Fluor594標記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號ZF0516)購于北京中杉金橋生物技術有限公司等。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備將小鼠隨機分為7組：正常(NC)、模型(MO)、PA、CA、BS、HTHX及BSYS組。每組10只。造模當天與造模后第7天于小鼠背部兩側皮下注射0.2 mL的免疫抗原，由50 μg MOG35-55、100 μLCFA、0.3 mg TB和100 μL生理鹽水混合而成。每只動物在免疫當天和兩天后腹腔注射500 ng的PTX。正常組注射同體積的生理鹽水[16]。

1.2.2給藥方法PA組小鼠給予PA 5 mg/kg體重灌胃；CA組給予CA 40 mg/kg體重灌胃；BS方組給予BS混懸液1.44生藥/kg體重；HTHX方組給予HTHX混懸液1.57 g生藥/kg體重灌胃；BSYS方組給予相應BSYS混懸液3.02生藥/kg體重灌胃。NC和MO組均灌服相同劑量的蒸餾水。1次/d，共計40 d。

1.2.3體重和神經功能評分每天測量記錄小鼠體重，并對其進行神經功能評分。神經功能評分標準按照Weaver′s的15分評分方法[17]對EAE小鼠的神經癥狀進行觀察評分。將小鼠尾巴活動分為3個等級，肢體活動分為4個等級，通過累積分數得出評分。若出現死亡則總分記為15分。

1.2.4標本采集造模第20 d(急性期)和第40 d(緩解期)取小鼠腦和脊髓，每組10只。常規灌流，4%多聚甲醛內、外固定。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，以2 μm厚度連續切片。

1.2.5HE染色取材組織塊固定后，常規石蠟包埋，2 μm切片。組織石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫至水，后用蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，再用自來水浸泡15 min。置于伊紅液2 min，最后常規脫水，透明，封片。

1.2.6IHC染色IHC法測定小鼠腦和脊髓中p-Tau、Beta-tubulin表達。組織石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫至水，PBS沖洗，放入檸檬酸緩沖液(pH6.0～6.1)，入微波爐進行抗原修復，室溫下自然冷卻至35 ℃以下，用3%H2O2室溫孵育10 min，滴加一抗稀釋液p-Tau(1∶200)/Beta-tubulin(腦1∶450，脊髓1∶500)等，放入4 ℃冰箱中孵育過夜(12 h)。取出后在室溫下復溫1 h，滴加生物素標記的二抗，并進行37 ℃孵育。DAB顯色1～5 min，脫水，透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察，每個切片選擇5個不重疊視野照相，并用NIS-Elements BR 3.2軟件測定積分光密度值(Integrated Optical Density，IOD)。

2　結果

2.1BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠體重的影響造模前各組小鼠體重差異無統計學意義(P>0.05)。造模后各小鼠體重緩慢上升，于第11天開始，與NC組比較，其他各造模組小鼠體重開始出現明顯下降(P<0.05)。于第19天降至最低，后緩慢回升。但第19天到第40天各造模組動物體重均較NC組顯著降低(P<0.01)。在第23天到40天，BSYS和BS組小鼠體重與PA組比較，回升明顯(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

圖1　各組小鼠體重變化

圖2　各組小鼠神經功能評分變化

圖3　各組小鼠腦組織病理學變化(HE×400)

2.2BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠神經功能評分的影響各造模組小鼠至第12天陸續發病，其神經功能評分呈現不同程度升高，此前各治療組之間比較差異無統計學意義。第17天，各治療組評分明顯低于MO組(P均<0.05)。MO組小鼠評分于第22天達最高峰，峰值為6.5分，第22天PA與BSYS組評分明顯低于MO組(P<0.01)，HTHX組、BS組和CA組評分也低于MO組，但效果不如BSYS組明顯，尤其HTHX組與BSYS組組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。隨后評分逐漸下降，第25天、32天，各治療組與MO組比較，評分顯著降低，其中CA組和HTHX組評分高于其他治療組，與PA、BSYS組比較差異有統計學意義(P<0.05)。第35天各組小鼠病情趨于平穩，但未恢復正常，各治療組病情較MO組均明顯減輕，PA和BSYS組評分明顯低于MO組(P<0.01)，各治療組之間比較無統計學意義，第34天到40天，各治療組與MO組比較，評分顯著降低，其中BSYS組較PA組評分下降明顯(P<0.05)。見圖2。

2.3BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠腦與脊髓不同時間點病理學的影響NC組小鼠腦組織，著色均勻，結構有序完整。MO組腦白質血管周圍有炎細胞浸潤，核固縮明顯。PA、CA、BS、HTHX和BSYS組腦白質血管周圍有炎細胞浸潤，部分核固縮。病理程度較MO組低。脊髓病理變化與腦相似。見圖3、圖4。

圖4　各組小鼠脊髓組織病理學變化(HE×400)

分組N腦第25天第40天脊髓第25天第40天NC44323±3844227±3964412±4884368±378MO46559±514???6200±360???6616±927???6323±602???PA44633±434##4323±793##4712±595##4392±324##CA45679±574#5202±922#5715±264#5497±361#BS44928±390#4547±407#4935±591#4657±277#HTHX45657±635#5324±397#5665±928#5498±597#BSYS44780±420##4437±385##4815±291##4576±290##

注：與NC組比較，***P<0.001；與MO組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.4BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠腦和脊髓中p-Tau的影響各組小鼠發病第25天和第40天，MO組小鼠腦p-Tau表達較NC組顯著上調(P<0.001)，各治療組小鼠腦p-Tau表達與MO組相比不同程度下降(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。各組小鼠脊髓內p-Tau表達變化趨勢與腦相似。見表1，圖5-6。

圖5　各組小鼠腦中p-Tau蛋白的表達變化(IHC×400)

圖6　各組小鼠脊髓中P-Tau蛋白的表達變化(IHC×400)

組別N腦第25天第40天脊髓第25天第40天NC41157±1031184±0561164±0541209±054MO4853±070???887±032???866±049???906±053???PA41047±058##1089±048##1068±069##1104±060##CA4920±048#949±058#939±044#969±047#BS4973±048#990±040#983±054#1021±071#HTHX4940±049#956±056#947±057#962±052#BSYS41011±053##1033±049##1031±062##1070±052##

注：與NC組比較，**P<0.01，***P<0.001；與MO組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.5BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠腦和脊髓中beta-tubulin的影響造模第25天和第40天，MO組小鼠腦beta-tubulin表達較NC組明顯下調(P<0.01，P<0.001)，各治療組小鼠腦beta-tubulin表達與MO組相比不同程度上升(P<0.05，P<0.01)。各組小鼠脊髓內beta-tubulin表達變化趨勢與腦相似。見表2、圖7、圖8。

圖7　各組小鼠腦中beta-tubulin表達變化(IHC×400)

圖8　各組小鼠脊髓中beta-tubulin表達變化(IHC×400)

3　討論

MS在神經系統疾病中屬于疑難性疾病，對于MS的治療進展關注一直持續上升，西醫治療雖有進展嘗試以新的藥物及治療方法替代，但仍以糖皮質激素、β干擾素為常規治療藥物[18-21]，但存在反復發作、不良反應發生率較高、費用高等問題。中醫藥治療本病從理論文獻到臨床有自己的獨特的治療體系，并在近年的治療中取得較好的效果[8,22-27]。中醫無MS病名，可根據其臨床表現與病因病機歸為“骨痿”[28]，以肝腎陰虛與痰瘀阻絡為主要病機，樊永平教授以滋補肝腎培其本、化痰活血緩其標[29]，二法并用標本兼治，在長期的臨床中取得良好的治療效果，在近期的實驗研究中亦取得成果[30-31]。通過本次實驗的結果發現，BSYS方在升高EAE小鼠的體重與降低神經功能評分的同時，顯著降低炎細胞浸潤與減輕細胞核固縮，說明本方對EAE小鼠有較好的防治作用，這些結果和以前的實驗結果是一致的[12，32]，關于本方劑量的選擇，是參考以往實驗結果，BSYS方以3.02 g/kg為優，并根據此將劑量計算拆方BS和HTHX方的劑量。本實驗中以PA作為代表藥物，CA為本方君藥地黃的主要成分。在本次實驗中，PA、CA、BS和HTHX治療組對EAE小鼠也有一定的防治作用，但以BSYS方的效果最優。

我們又進一步研究了本方對EAE軸突損傷及其修復作用。Tau過度磷酸化積累是多種神經退行性病變的重要特征之一。研究報道p-Tau蛋白在MS患者中大量增加，尤其是疾病早期[33-34]。已有從MS患者腦脊液中提取Tau蛋白作為MS患者的生物標記物，用于疾病的診斷[35]。在本次實驗中我們發現，急性期和緩解期EAE小鼠腦和脊髓中p-Tau有顯著的升高，各治療組均有明顯降低p-Tau的作用，說明可以減少EAE小鼠的軸突損傷。各治療組之間無明顯差異。

Beta-tubulin在支持神經元細胞骨架和沿神經突起和突觸釋放神經遞質轉運中發揮著重要的作用。研究發現，MS患者腦脊液中tubulin的含量遠低于其他神經系統疾病患者與正常對照組腦脊液中tubulin的含量，認為腦脊液中tubulin的含量可以作為軸突修復的指標之一[36]。我們的實驗發現，EAE小鼠腦和脊髓中beta-tubulin的表達在急性期和緩解期均有顯著下降，各治療藥物顯著上升beta-tubulin的表達，可以促進EAE小鼠軸突的修復。其中以BSYS方效果最為明顯。說明補腎配伍化痰活血法對于MS治療的有效性。

綜上所述，BSYS方及其拆方BS和HTHX均能EAE小鼠有防治作用，并能減輕軸突損傷及促進其修復，尤以BSYS全方更為顯著，為臨床應用補腎化痰活血法治療MS提供科學內涵。

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(2016-03-09收稿責任編輯：張文婷)

Effects of Bushen Yisui Decoction and Its Decomposed Decoctions on Expressions of p-Tau and Beta-tubulin in Brain and Spinal Cord of Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Shi Yimin1, Wang Yongqiang1, An Chen1, Zhao Hui1, Qi Fang1, Zhang Qiuxia1, Chen Zhenzhen1,Fan Yongping2, Li Ming1, Wang Lei1

(1 Beijing Key Lab of TCM Collateral Disease Theory Research, School of Chinese Medicine, Capital Medical University,Beijing100069,China; 2BeijingTiantanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China)

Objective: To observe effect of the Bushen Yisui Dection (BYD) and its decomposed Bushen Decoctions (BD) and Huatan Huoxue Decoction (HHD) on the expressions of p-Tau and beta-tubulin in the brain and spinal cord of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Methods: C57BL/6 female mice were randomly divided into normal control (NC), model (MO) and prednisone acetate (PA), catalpol (CA), BYD, BD and HHD groups. The mice were injected subcutaneously with the antigens mixture, including 50 μg OG35-55, CFA and TB at two sites on the back on the 1st day and 7 days later, and then were injected intraperitoneally with 500 ng PTX on days 1st and 2 day later. The mice in each group were administered intragastrically once a day. Meanwhile, the body weight and neurological function of mice were observed. The brain and spinal cord of mice were removed for pathological examination on 20th and 40th day. The expressions of p-Tau and beta-tubulin were detected by immunohistochemistry analysis. Results: Compared with the MO group, the body weight and scores of mice were significantly increased in BYD, BD and HHD groups. HE staining showed a significant reduction in inflammatory cells and nuclear condensation. The expression of p-Tau was significantly reduced, while beta-tubulin was markedly increased in BYD, BD and HHD groups as well (P<0.05,P<0.01). Conclusion: BYD and its decomposed decoctions BD and HHD have neuroprotective effects on reducing weight loss and scores, inflammatory cell infiltration, axonal injury and enhancing the repair of axon in EAE mice. The effect of Bushen Yisui Decoction is more significant particularly.

Bushen Yisui Decoction and its decomposed decoctions; Multiple sclerosis; Experimental autoimmune encephalomyelitis; p-Tau; Beta-tubulin

國家自然科學基金項目(編號：81273742、81573898)；北京市教委重點項目(編號：KZ201310025023)；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養計劃-長城學者項目(編號：CIT&TCD20140329)

師一民(1990—)，男，在讀碩士，首都醫科大學中醫藥學院，研究方向：主要從事中醫藥防治腦病的基礎研究

李明，博士，教授，首都醫科大學中醫藥學院，Tel：(010)83911630，E-mail：13611386113@163.com；王蕾，博士，教授，首都醫科大學中醫藥學院，Tel：(010)83911626，E-mail：tmwangl@ccmu.edu.cn

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.047