欖香烯乳聯合人參皂苷對卵巢癌細胞耐藥株A2780/PTX的影響作用

王　煥

(河南省濟源市人民醫院藥劑科,濟源,454650)

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欖香烯乳聯合人參皂苷對卵巢癌細胞耐藥株A2780/PTX的影響作用

王煥

(河南省濟源市人民醫院藥劑科,濟源,454650)

目的:觀察欖香烯乳聯合人參皂苷方案對卵巢癌細胞耐藥株A2780/PTX的影響作用。方法:采用體外培養的卵巢癌細胞耐藥株A2780/PTX進行實驗,隨機分成4組,空白組:新鮮的全培養液;人參皂苷組:30 μg/mL人參皂苷培養液;欖香烯乳組:20 μg/mL欖香烯乳培養液;聯合組:30 μg/mL人參皂苷+20 μg/mL欖香烯乳培養液。通過流式細胞儀檢測細胞周期;通過MTT法檢測欖香烯乳及人參皂苷單用的細胞毒作用及2者聯合應用時的作用;采用Western-blot觀察A2780/PTX細胞內蛋白的表達;采用激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位的變化。結果:流式細胞術檢測結果顯示,與人參皂苷組、欖香烯乳組及空白組比較,聯合組在G0/G1期細胞有明顯增加,差異有統計學意義(P<0.05),A2780/PTX細胞被阻止在G1期;MTT法檢測結果顯示不同濃度的藥物劑量可以對卵巢癌細胞產生抑制作用,并呈一定的劑量依賴性;Western blotting結果顯示,A2780/PTX細胞中聯合組蛋白表達較空白組、人參皂苷組、欖香烯乳組顯著降低(P<0.05);聯合組A2780/PTX細胞株線粒體膜電位下降較人參皂苷組、欖香烯乳組及空白組更為明顯(P<0.05)。結論:欖香烯乳聯合人參皂苷方案能對卵巢癌細胞耐藥株A2780/PTX產生明顯的生長抑制作用。2者聯合應用可以提高有效率,降低不良反應。

卵巢腫瘤;欖香烯乳;人參皂苷;A2780/PTX

卵巢癌是嚴重威脅女性健康的較為常見的一種惡性腫瘤。目前臨床上的主要治療手段是化療,但化療一段時間后腫瘤細胞會對化療藥物產生耐藥性[1-3],進而降低化療效果,給患者的治療造成障礙。人參皂苷是從中藥人參中提取,能提高患者自身免疫力,具有抗腫瘤活性,因其具有潛在的抑癌作用已被研究者認為是理想的抗癌藥物[4-6]。另外從中藥莪術中提取的非細胞毒性抗癌藥欖香烯乳是一種新的化療藥物,其在卵巢癌的治療中發揮重要作用,此藥的有效成分是β-欖香烯,經研究發現β-欖香烯乳的不良反應較少,具有放射增敏效應,可逆轉腫瘤細胞的耐藥性[7-9]。本研究就人參皂苷與欖香烯乳聯合應用,探討此聯合方案對卵巢癌細胞耐藥株A2780/PTX的影響作用,現將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗材料人卵巢癌A2780/PTX細胞購于南京凱基生物科技有限公司;人參皂苷購自天津馬克生物技術有限公司(批號:41753-43-9);欖香烯乳劑注射液購自大連金港制藥有限公司(批號:081152);DMEM培養液購于美國Gibco;蛋白定量試劑盒為美國Klontech公司產品;四甲基氮唑藍(MTI7)為美國Sigma公司產品;小牛血清、DMEM培養液購于杭州四季青生物有限公司;細胞裂解液購自碧云天生物技術有限公司;HER-2兔抗人抗體及二抗均為Santa Cruz公司產品;蛋白酶抑制劑、磷酸化酶抑制劑購自南京凱基生物科技發展有限公司;紫外分光光度計、倒置顯微鏡購自日本TOYOBO公司;流式細胞儀購于美國Biorad公司。

1.2細胞培養用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養人卵巢癌A2780/PTX細胞,于37 ℃含5% CO2的空氣培養箱中培養,2 d傳代1次,取處于生長對數期的細胞用于實驗。

1.3實驗方法

1.3.1藥物預處理及實驗分組藥物預處理:將卵巢癌A2780/PTX細胞以1×106個/mL的密度接種至6孔板中,于每孔加入DMEM 3 mL。人參皂苷、欖香烯乳先用DMSO溶解,然后用培養基稀釋至終濃度。培養體系中人參皂苷的濃度為30 μg/mL,此時DMSO的終濃度為0.1%;欖香烯乳20 μg/mL。6 h后收集細胞懸液以1 000 r/min離心5 min收集細胞并用PBS清洗滌1遍。實驗隨機分成4組,空白組:新鮮的全培養液;人參皂苷組:30 μg/mL人參皂苷培養液;欖香烯乳組:20 μg/mL欖香烯乳培養液;聯合組:30 μg/mL人參皂苷+20 μg/mL欖香烯乳培養液。

1.3.2流式細胞儀檢測細胞周期收集上述分組的A2780/PTX細胞,調整細胞濃度為1×106個/L,以冷PBS洗滌兩遍后,以70%的冷乙醇(4 ℃)將細胞沉淀并混勻備用,洗滌細胞后再調整細胞濃度為1×106個/L(用PBS)與含50 μg/mL RNA酶的Tris-HCL緩沖液(pH 7.4)共同孵育30 min。100 μg/mL(1 μg/mL)碘化丙啶(PI)進行細胞的DNA染色,放置暗室中1 h后,經流式細胞儀檢測細胞的DNA含量分布,并計算出各周期細胞所占的百分比。

1.3.3MTT法檢測欖香烯乳及人參皂苷單用及2者聯合應用時的細胞毒作用MTT法測定人參皂苷、欖香烯乳對A2780/PTX細胞的毒性:細胞貼壁后,于空白組加入新鮮的全培養液;人參皂苷組加入終質量濃度為分別為:10、20、30、40 μg/mL人參皂苷培養液;欖香烯乳組加入終質量濃度為分別為:10、20、30、40 μg/mL欖香烯乳培養液;聯合組分別聯合加入上述2組不同濃度的培養液(用含10%胎牛血清的DMEM培養基稀釋)。藥物作用72 h后于每孔加入5 mg/mL的MTT溶液繼續培養4 h,離心后棄上清,置搖床上低速振蕩10 min。采用全自動酶標儀(檢測490 nm處的吸光度值(A值),取平均值計算細胞生長率。規定生長率>95%的藥物濃度為該藥的非細胞毒性劑量,并作為最佳逆轉耐藥濃度。

1.3.4Westem blot觀察A2780/PTX細胞內蛋白的表達于每組收集生長狀態良好的卵巢癌A2780/PTX細胞1×106個,棄去培養液后用PBS沖洗3次,提取總蛋白,通過BCA法測定蛋白質濃度,吸取50 μg總蛋白,行10%SDSPAGE電泳,通過電轉移(40V 150 min的轉印條件)印跡到PVDF膜上,封閉5%脫脂奶粉FIBS液中,于37 ℃下孵育2 h。加入1∶1 000稀釋的一抗孵育,4 ℃過夜,用TBST洗膜5次,5 min/次;加入1∶5 000 HRP標記的二抗孵育,于37 ℃培育2 h,經PBS沖洗,采用ECL法檢測。于暗室曝光X線片,通過GDSS000凝膠自動成像系統攝像,漂洗并干燥后避光保存。Image-Pro Plus 8.0軟件分析條帶灰度值,以A2780/PTX/β-actin代表A2780/PTX的相對表達量。

1.3.5采用激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位的變化激光共聚焦熒光顯微鏡檢測2種藥物對A2780/PTX細胞線粒體膜電位(△Ψm)的影響,各組以不同濃度藥物作用72 h后,加入無血清培養基稀釋的線粒體熒光染料(JC-1)(終濃度為10 mg/L),于37 ℃下培養15 min,離心5 min后棄除多余染料,在各組均制片3張,放于激光共聚焦顯微鏡下進行掃描、拍照。JC-1單體在激發波長為488 nm,發射波長為530 nm處能檢測到綠色熒光,JC-1聚合物在激發波長為535 nm，發射波長為590 nm處檢測到紅色熒光。選擇5個不重復視野,并對其平均熒光密度進行計算,以紅色熒光/綠色熒光光密度比值表示線粒體△Ψm的高低,比值降低提示線粒體△Ψm下降。

2　結果

2.1流式細胞儀檢測細胞A2780/PTX周期流式細胞術檢測結果顯示,空白組細胞主要分布在G0/G1期,人參皂苷組、欖香烯乳組在G0/G1期細胞較對照組增加,人參皂苷組、欖香烯乳組與空白組比較差異有統計學意義(P<0.05),人參皂苷組及欖香烯乳組之間差異無統計學意義(P>0.05);聯合組在G0/G1期細胞與人參皂苷組、欖香烯乳組及空白組比較有明顯增加,差異有統計學意義(P<0.05),提示A2780/PTX細胞被阻止在G1期。見表1。

表1　A2780/PTX細胞周期的檢測

注:與人參皂苷組、欖香烯乳組及空白組比較,*P<0.05。

2.2MTT法檢測細胞毒作用MTT法檢測結果顯示不同濃度的藥物劑量可以對卵巢癌細胞產生抑制作用,并呈一定的劑量依賴性。但隨著2種藥物濃度的提高,對A2780/PTX細胞生長的抑制情況明顯上升。2種藥物在中高濃度時,抑制腫瘤細胞生長的作用尤為顯著,并呈一定的劑量依賴性,且中高濃度時能產生更嚴重的對細胞形態結構破壞的損傷。根據本研究結果以及參考文獻[10]，我們選擇30 μg/mL濃度的人參皂苷及20 μg/mL濃度的欖香烯乳作用A2780/PTX細胞24 h為研究2種藥物逆轉A2780/PTX細胞耐藥性的最適濃度和時間。不同濃度藥物抑制A2780/PTX細胞生長情況見表2、圖1。

表2　人參皂苷及欖香烯乳對A2780/PTX細胞生長的抑制情況

注:*P<0.05。

2.3Westem blot檢測A2780/PTX蛋白的表達Western blotting結果顯示,A2780/PTX細胞中聯合組蛋白表達較空白組、人參皂苷組、欖香烯乳組顯著降低(P<0.05)。見表3。

圖1　不同濃度藥物的吸光度值

組別A2780/PTXprotein空白組098±023?人參皂苷組085±016?欖香烯乳組084±032聯合組073±012?

注:與人參皂苷組、欖香烯乳組及空白組比較,*P<0.05。

圖2　Western blot檢測A2780/PTX細胞的protein的表達

圖3　細胞內線粒體膜電位的熒光強度(×400)

2.4人參皂苷及欖香烯乳對A2780/PTX細胞株線粒體膜電位的影響結果顯示,在藥物最適濃度下作用24 h后,空白組細胞(圖3a)可見紅色熒光,胞膜完整,胞核清晰可見,表明線粒體△Ψm沒有明顯變化;人參皂苷組(圖3b)、欖香烯乳組(圖3c)可見部分細胞呈現紅色熒光,部分細胞呈現綠色熒光,還有部分細胞呈破裂狀,胞內可見內容物外流,提示線粒體△Ψm有所下降;聯合組(圖3 d)中顯示大量細胞呈現綠色熒光,部分細胞出現核固縮、部分細胞呈破裂狀,胞內可見內容物外流,表明線粒體△Ψm有顯著下降。

3　討論

卵巢癌是婦科較為常見的惡性腫瘤之一,嚴重影響著女性的生命健康。目前主要治療手段是以手術切除為主,輔助藥物化療的綜合治療。因其發病隱匿,多數患者發現時已屬中、晚期,而晚期卵巢癌患者的生存率較低,尤其是5年生存率僅為30%左右[10],對化療藥物產生耐藥性是導致化療失敗及影響5年生存率的主要原因。因此對卵巢癌細胞耐藥機制的研究是目前的熱門領域。

近年來隨著中藥及中醫技術的發展,中藥資源越來越豐富,且中藥作用靶點較多,具有針對多藥耐藥機制復雜的特點。我國自行研發的抗癌新藥欖香烯乳注射液就是一種可以逆轉多藥耐藥的中藥[11]。研究發現作為其主要成分的β-欖香烯,其具有抑制腫瘤細胞DNA的合成,降低腫瘤細胞的增殖能力,同時具有增強機體T淋巴細胞亞群的功能,發揮加強免疫作用等的優點[12-13]。其所具有的逆轉多藥耐藥途徑的作用已被多項研究所證實。此外多項研究均表明,人參皂苷可以通過不同途徑抑制腫瘤細胞的生長[14-15]。人參皂苷可通過調節凋亡相關基因的表達及活性,誘導腫瘤細胞的凋亡;可通過抑制藥物向細胞外流動而逆轉腫瘤細胞的耐藥性;還可通過抑制腫瘤血管生成、減低細胞黏附性及調節細胞內鈣離子濃度等途徑抑制腫瘤的侵襲及轉移。有研究表明,人參皂苷可加速外周淋巴細胞增殖,增強體液和細胞免疫[16]。

本研究采用低細胞毒濃度的人參皂苷和非細胞毒性抗癌藥欖香烯乳聯合干預卵巢癌細胞耐藥株A2780/PTX。通過比較在總劑量不變的前提下,人參皂苷和欖香烯乳單獨用藥和2者聯合用藥后,卵巢癌細胞耐藥株A2780/PTX的生長情況,通過流式細胞術檢測結果顯示,聯合組在G0/G1期細胞與人參皂苷組、欖香烯乳組及空白組比較有明顯增加,A2780/PTX細胞被阻止在G1期,表明2者聯合應用可以增強抑制腫瘤細胞生長的效應;通過MTT法檢測結果顯示在不同濃度的藥物劑量時,對卵巢癌細胞產生抑制作用,并呈一定的劑量依賴性,且聯合組的抑制作用大于單獨用藥組,提示2者聯合應用促進腫瘤細胞的逆轉耐藥作用會增強;Western blotting結果顯示,A2780/PTX細胞中聯合組蛋白表達較空白組、人參皂苷組、欖香烯乳組顯著降低,提示聯合應用可進一步使癌細胞增殖能力下降;不同濃度的人參皂苷及欖香烯乳聯合能使A2780/PTX細胞株線粒體膜電位下降,表明細胞線粒體膜受到損傷,從而誘導了細胞的凋亡。

綜上所述,人參皂苷和欖香烯乳聯合干預具有明確的抗腫瘤作用。但是本實驗結果尚缺乏相關機制的研究,此外還需通過大量臨床病例資料進行深入研究與佐證。

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(2015-09-04收稿責任編輯：王明)

Elemi olefinic emulsion joint ginseng saponin on ovarian cancer cell A2780/PTX impact resistant strains

Wang Huan

(Jiyuan city of henan province people′s hospital pharmacy department，Jiyuan 454650,China)

Objective:To observe the elemi olefinic emulsion combined ginseng saponin scheme on ovarian cancer cell A2780/PTX impact resistant strains.Methods:Using vitro cultured ovarian cancer cell A2780/resistant strains PTX experiment，randomly divided into 4 groups：blank group：just add fresh whole culture; Ginseng saponin groups：30 mu g/mL culture ginsenosides; Elemi ene group：20 mu g/mL olive incense ene milk culture medium; Joint group：30 mu g/mL + 20 mu g/mL ginsenosides elemi milk culture medium.By flow cytometry instrument to detect cell cycle; Lam incense ene milk by determined by MTT method and use the cytotoxic effect of ginsenosides and their joint application; Using Western blot observation A2780/PTX protein expression in the cell; With laser confocal microscope detection of mitochondrial membrane potential changes.Results:Flow cytometry detection，according to the results and ginseng saponin，lam incense ene milk group and the blank group comparison，the joint group of cells in G0/G1 phase increased markedly，and the statistical significant difference(P<0.05)，A2780/PTX cells in G1 phase is blocked; Determined by MTT method to detect the result shows that different concentrations of doses can inhibitory effect on ovarian cancer cells，and a certain dose dependent;，according to the results of Western blotting A2780/zhonglian PTX cells to form protein expression than blank group，ginseng saponin，lam incense ene group significantly reduced(P<0.05); Joint group A2780/PTX cell lines of mitochondrial membrane potential decreased the ginseng saponins group，lam incense ene group and blank group is more obvious(P<0.05).Conclusion:Lam incense ene milk can joint scheme ginsenosides on ovarian cancer cell A2780/PTX resistant strains produce obvious growth inhibition.The joint application can improve the efficient，reduce the adverse reaction.

Ovarian cancer; Elemi olefinic emulsion; Ginseng saponin; A2780/PTX

王煥(1972.01—),女,本科,主管藥師,研究方向:藥學,E-mail:wanghuanjyyy@163.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.049