芪參益氣滴丸對糖尿病大鼠視網膜谷氨酸轉運體及谷氨酰胺合成酶表達的影響

羅　鋼　蔡麗英

(黃石市中心醫院，黃石，435000)

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芪參益氣滴丸對糖尿病大鼠視網膜谷氨酸轉運體及谷氨酰胺合成酶表達的影響

羅鋼蔡麗英

(黃石市中心醫院，黃石，435000)

目的：探討芪參益氣滴丸對糖尿病大鼠視網膜谷氨酰胺合成酶及谷氨酸轉運體的表達水平的影響。方法：選擇維通利華實驗動物研究所提供的六周齡SPF級SD大鼠80只，體重180～220 g，雄性，根據隨機數字表法分為實驗組(例數=70)、正常組(例數=10)，進行鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，一次性注射腹腔對胰島β細胞進行選擇性破壞，誘發實驗性糖尿病；應用時由PH 4.4、0.1 mmol/L無菌的檸檬酸鈉緩沖液配制為1% STZ溶液，根據大鼠體重予以65 mg/kg左下腹腔一次性注射1% STZ，正常組注射相同體積的生理鹽水，72 h后應用快速血糖儀檢測血糖水平；血糖水平超過16.7 mmol/L者則為糖尿病大鼠模型；隨機分為對照組(多貝斯對照組)(20只)、治療組(芪參益氣滴丸組)(30只)、糖尿病模型組(模型組)(20只)、正常組(例數=10)，應用RT-PCR法檢測4組大鼠視網膜GFAP mRNA表達水平；應用免疫組織化學染色法(Labelled Streptavidin Biotin Method，LSAB法)檢測4組視網膜的谷氨酸轉運體(Glutamate/aspartate Transporter，GLAST)表達水平；應用免疫組織化學染色法(LSAB法)檢測視網膜上谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)的表達水平情況。結果：對照組、模型組、治療組的大鼠視網膜GFAP陽性表達IOD值顯著低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組、對照組的大鼠視網膜神經膠質原纖維酸性蛋白(Glialfibrillaryacidprotein，GFAP)陽性表達IOD值顯著高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組的大鼠視網膜GFAP陽性表達IOD值顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組、模型組、治療組的大鼠視網膜GS陽性表達IOD值顯著低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組、對照組的大鼠視網膜GS陽性表達IOD值顯著高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組的大鼠視網膜谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)陽性表達IOD值顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論：芪參益氣滴丸可促進視網膜GS和GLAST的表達，降低谷氨酸的高濃度興奮性毒性功能，保護視網膜神經細胞。

糖尿病；谷氨酸；芪參益氣滴丸；谷氨酰胺合成酶；谷氨酸轉運體

引發視網膜神經細胞嚴重受損的主要原因之一為谷氨酸的高濃度興奮性毒性。大量研究表明，糖尿病視網膜病變早期可出現谷氨酸循環緩慢，細胞外堆積大量的谷氨酸，濃度上升，導致視網膜神經節細胞凋亡[1-2]。傳統糖尿病性視網膜病變的主要研究重點為視網膜毛細血管微循環障礙，且設定為血管病變導致視覺的缺失及視網膜神經細胞的變性[3-4]；糖尿病患者發生眼底可見的微血管變化之前即發生視神經膠質細胞的存活力及細胞功能變化、視網膜神經纖維功能的降低；近年來研究發現，糖尿病視網膜病變除微血管受損外，糖尿病視網膜病變是一種慢性神經阻滯細胞的退行性病變，包括谷氨酰胺代謝病變、激活小膠質細胞、大膠質細胞反應性增生、神經細胞凋亡加速，視網膜血管病變的主要原因可能為神經膠質及神經元的變化[5-6]；血管內皮細胞、神經膠質細胞、神經元細胞是形成糖尿病視網膜病變的重要因素，神經膠質細胞、神經元細胞的功能變化、結構可改變血管的通透性，視網膜血管通透性變化導致谷氨酸由血液進入視網膜實質，引發視網膜神經退行性改變[7-8]；同時與缺乏神經營養因子密切相關，Müller細胞因是神經元與血-視網膜屏障的橋梁，其功能及結構具有獨特性，在導致視網膜血管病變的同時，可引發神經元功能障礙[9-10]。視網膜內的重要神經膠質細胞為Müller細胞，細胞突起由內界膜向外界膜伸展，內核層為細胞體，細胞突起可貫穿全層視網膜，將全部視網膜神經元突起及胞體均包繞及接觸[11-12]；與視網膜神經元的功能及結構密切相關；糖尿病狀態下Müller細胞的改變為表達GFAP水平升高，GFAP為膠質纖維酸性蛋白，是特征性神經膠質細胞標記，最早在大腦星形膠質細胞中的中間絲結構蛋白中發現，其表達水平升高是視網膜神經元受損的間接性指標[13-14]；糖尿病視網膜可表現為膠質反應性活躍性增生，糖尿病視網膜進展的病理性改變為視網膜組織內膠質細胞反應性增生，視網膜中表達GFAP水平顯著升高[15]。活血益氣類藥物可營養周圍神經、中樞神經因子功能，可促進變性受損的神經細胞修復功能，增強膠質細胞的代償功能，對視網膜神經組織細胞具有保護神經功能，促使神經細胞突起生長功能。探析活血益氣法對糖尿病視網膜病變大鼠的谷氨酰胺合成酶及谷氨酸轉運體的表達水平的影響具有重要的臨床價值，故本文建立糖尿病視網膜病變大鼠模型，檢測糖尿病視網膜病變大鼠的視神經膠質細胞的谷氨酰胺合成酶、谷氨酸轉運體的表達水平，現報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物維通利華實驗動物研究所提供的六周齡SD大鼠SPF級80只，體重180～220 g。

1.2實驗藥物與試劑芪參益氣滴丸(天津天士力制藥集團股份有限公司生產，國藥準字Z20030139)，羥苯磺酸鈣膠囊(商品名：多貝斯，西安利君制藥有限責任公司生產，國藥準字H20000713)；Dako公司提供的LSAB通用試劑盒，Sigma公司生產的DAB顯色劑，Roche公司提供的細胞凋亡檢測盒，Sigma公司提供的STZ。

1.3實驗儀器Kodak公司提供的Image Plus Pro 6.0圖像分析系統；SAKURA CRM-440型病理切片機，SAKURA PS-53型展片器，日本SAKURA Tissue-Tek TECTM5 SM C1-042-SO型組織包埋機，日本OLYMPUS BH-2型顯微照相系統，日本日立H-600型電子顯微鏡，日本OLypus BH-2型光學顯微鏡，日本OLypus BX-51型數碼相機裝置，HANNA Instrumrnts-PH-200型酸度計，Mettler Toledo-AB54型精密電子天平，Roche GLUCOTREND型快速血糖儀。

1.4實驗方法1)六周齡SPF級SD大鼠80只，體重180～220 g，均為雄性，飼養室相對濕度55%～70%，室溫22～25 ℃；實驗期間大鼠可自由飲水及進食，適應性飼養7d后，隨機分為正常組(例數=10)、實驗組(例數=70)，進行STZ一次性腹腔注射，對胰島β細胞進行選擇性破壞，誘發實驗性糖尿病；臨時將pH 4.4、0.1 mmol/L無菌檸檬酸鈉緩沖液配制為1%的STZ溶液，根據大鼠體重，進行1%STZ一次性左下腹腔注射，65 mg/kg，正常組注射體積相同的0.9%氯化鈉注射液，建立模型前大鼠12 h禁食，72 h后尾靜脈取血，予以快速血糖儀檢測血糖；血糖超過16.7 mmol/L者則為糖尿病大鼠模型；隨機分為對照組(多貝斯對照組)(20只)、治療組(芪參益氣滴丸組)(30只)、糖尿病模型組(模型組)(20只)、正常組(例數=10)；成功建立大鼠模型后第二天對照組及治療組給藥，灌胃給藥1次/d，劑量均為0.5 g/kg，應用蒸餾水配制羥苯磺酸鈣膠囊、芪參益氣滴丸，配制藥物溶液為100 mg/mL，1次/周，于4 ℃冰箱內置存；正常組大鼠予以1 mL 0.9%氯化鈉溶液灌胃；實驗周期為10個月，期間予以大鼠血糖和體重定期檢測；視網膜切片制備：結束試驗后將大鼠處死，由頸動脈處放血，將眼球摘除，24 h內在4 ℃下應用4%多聚甲醛固定，順角膜邊緣將眼球壁剪開，將玻璃體、晶體、角膜除去，剩下的眼杯置入固定液內再次48 g固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，二甲苯透明，SAKURA CRM-440型病理切片機連續切片，3 μm切片厚度；進行標記鏈霉親合素-生物素過氧化物酶法(LSAB)進行GS、GLAST免疫組織化學染色：1)石蠟切片脫蠟，梯度乙醇水化；2)5 min流水漂洗，5 min磷酸鹽緩沖液，洗滌兩次；3)15 min3%雙氧水氧化，將內源性過氧化物酶消除，5 min流水漂洗，5 min PBS洗滌兩次；4)室溫下10%正常牛血清(BSA)滴加，20 min濕盒孵育；5)在不同的切片內滴加一抗：兔抗人GS多抗1:50和兔抗人GLAST多抗1:1800,24 h室溫下孵育濕盒，5 minPBS洗滌三次；6)LSAB二抗滴加，90 min室溫下濕盒孵育，5 minPBS洗滌三次；7)LSAB三抗滴加，90 min室溫下濕盒孵育，5 minPBS洗滌三次；8)0.5 min-1 min部分切片蘇木素復染，未復染部分3 min流水沖洗，進行圖像分析；梯度乙醇脫水，風干，二甲苯透明，樹脂中性封片；在光學顯微鏡下監測所得切片，予以Image Plus Pro6.0圖像分析系統定量分析未復染切片，每只大鼠取切片兩張，200倍下隨機選擇視野10處，計算陽性表達積分密度值(IOD)，IOD=平均光密度×面積。見圖1～圖8。

2　結果

2.14組視網膜表達GLAST表達IOD值情況對照組、模型組、治療組的大鼠視網膜GFAP陽性表達IOD值顯著低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組、對照組的大鼠視網膜GFAP陽性表達IOD值顯著高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組的大鼠視網膜GFAP陽性表達IOD值顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1　GLAST在正常組視網膜的表達，LSAB法×400，蘇木素復染。　　圖2　GLAST在模型組視網膜的表達，LSAB法×400，蘇木素復染。

圖3　GLAST在治療組視網膜的表達，LSAB法×400，蘇木素復染。　圖4　GLAST在對照組視網膜的表達，LSAB法×400，蘇木素復染。

圖5　GS在正常組大鼠視網膜的表達，LSAB法×400，未復染。　　圖6　GS在模型組大鼠視網膜的表達，LSAB法×400，未復染。

圖7　GS在治療組大鼠視網膜的表達，LSAB法×400，未復染。　　圖8　GS在對照組大鼠視網膜的表達，LSAB法×400，未復染。

2.24組視網膜表達GS表達IOD值變化情況對照組、模型組、治療組的大鼠視網膜GS陽性表達IOD值顯著低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組、對照組的大鼠視網膜GS陽性表達IOD值顯著高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療組的大鼠視網膜GS陽性表達IOD值顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1　4組視網膜表達GLAST陽性表達IOD值情況

注：t/P1為模型組與正常組比較，P<0.05；t/P2為治療組與正常組比較，P<0.05；t/P3為對照組與正常組比較，P<0.05；t/P4為治療組與模型組比較，P<0.05；t/P5為治療組與對照組比較，P<0.05；t/P6為對照組與模型組比較，P<0.05。

表2　4組視網膜表達GS表達IOD值變化情況

注：t/P1為模型組與正常組比較，P<0.05；t/P2為治療組與正常組比較，P<0.05；t/P3為對照組與正常組比較，P<0.05；t/P4為治療組與模型組比較，P<0.05；t/P5為治療組與對照組比較，P<0.05；t/P6為對照組與模型組比較，P<0.05。

3　討論

本研究探析糖尿病大鼠予以芪參益氣滴丸對大鼠視網膜谷氨酰胺合成酶及谷氨酸轉運體的表達影響，研究結果與馬棟等[16]的研究結果大體一致，谷氨酸為視網膜的最重要的興奮性神經遞質，神經節細胞、雙極細胞、光感受器的遞質均為谷氨酸，谷氨酸的濃度不同，其傳遞的信號也具有一定的差異，而谷氨酸高濃度具有興奮性毒性，谷氨酸的清除降低或生成增加是導致神經細胞凋亡的主要病理機制，視網膜中的雙極細胞及神經節細胞中谷氨酸的唯一源頭為Müller細胞，同時可清除視網膜內外過量的谷氨酸，其細胞內的谷氨酰胺合成酶及包膜的谷氨酸轉運體是谷氨酸降解、轉運的重要過程[17]；谷氨酰胺合成酶只在Müller細胞內存在，Müller細胞對RGCs避免谷氨酸度毒性侵害的作用與GLAST的數量及功能密切相關；在谷氨酰胺合成酶的作用下，谷氨酸可轉化為谷氨酸胺，由Müller細胞向細胞外釋放，同時神經細胞攝取Gln；傳統醫學認為，糖尿病屬于“消渴”范疇，素體燥熱偏盛，陰津虧損，傷陰耗氣，引發陰陽兩虛、氣陰兩虛，瘀阻絡脈，血行不暢；燥熱陰虛、氣弱脾虛，陰損及陽，目失所養是糖尿病視網膜病變的基礎病機；糖尿病視網膜病變的進展病機為氣弱脾虛，因虛致瘀，閉塞目竅，其證候特征為虛實夾雜，本虛標實；糖尿病視網膜病變的增殖前期及單純期均為氣陰兩虛證，增殖期為血瘀氣滯、陰陽兩虛；對糖尿病進行活血益氣療法可防止病變向陰陽兩虛狀態轉變；芪參益氣滴丸有降香、三七、丹參、黃芪組成，方中降香辛散氣香，行滯溫通；三七和丹參可通絡祛瘀活血，同為臣藥；黃芪為君藥，可補氣，祛瘀不傷正，氣旺則血行，促進津液運行；現代藥理研究表明，黃芪的主要有效成分為微量元素、氨基酸、黃酮、皂苷、多糖；其中黃芪多糖可提高機體的缺氧耐受能力，通過抗氧化功能，促使抗氧化酶的GSH-Px、SOD的活性增強，促使細胞膜穩定，促使凋亡抑制基因bcl-2的表達水平提高，p53促凋亡基因的表達下降，降低損傷神經細胞，延緩神經細胞凋亡進程；可促進受損后恢復神經功能，對神經膠質細胞急性腦缺血期的過量表達水平進行抑制；丹參酮及丹參素可緩解微循環障礙，全血粘度下降，對血小板集聚功能進行抑制；避免脂質的過氧化，阻斷生成羥自由基。綜上所述，芪參益氣滴丸可促進視網膜GS和GLAST的表達，降低谷氨酸的高濃度興奮性毒性功能，保護視網膜神經細胞。

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(2015-12-02收稿責任編輯：張文婷)

Effect of Qishen Yiqi Dripping Pills on the Expression of Glutamate Transporter and Glutamine Synthetase in Diabetic Rats

Luo Gang,Cai Liying

(Huangshi Central Hospital,Hubei Institute of Science and Technology,Hubei 435000,China)

Objective:To investigate the effect of Shenqi Yiqi dripping pills on the expression of glutamine synthetase and glutamate transporters in the retina of diabetic rats.Methods:SD male rats 80,weight 180～220 g were randomly divided into experimental group (n=70) and normal group (n=10).The rats were modeled by STZ injection to induce experimental diabetes.The 1% STZ sterile solution was prepared by sodium citrate buffer PH4.4,0.1 mmol/L,and it was given according to the body weight of rats (65 mg/kg) through left lower abdominal cavity.Common saline were injected of the same volume on the normal group,and blood glucose level was examined by fast blood glucose meter examination after 72 h; mice whose blood glucose level over 16.7 mmol/L were categorized as the model diabetes group,and were randomly divided into the control group (calciumdobesilate control group) (n=20),treatment group (Qishen Yiqi group) (n=30),and diabetic model group (model group) (20 rats).RT-PCR method was used to detect the expression level of mRNA GFAP in four groups of rats.The expression level of glutamate transporter (GLAST) was detected by immunohistochemical staining (LSAB method) and the expression level of glutamine synthetase (GS) was detected by LSAB in four groups.Results:The positive expression of GFAP (Glial fibrillary acid protein) IOD value of the control group,model group,and treatment group were higher than the normal group with statistical difference (P<0.05).The GFAP IOD value in the treatment group and control group were higher than that of the model group (P<0.05).The GFPA IOD value in the treatment group was higher than that of the control group (P<0.05).The positive expression of GS (Glutamine synthetase) IOD value of the control group,model group,and treatment group were higher than the normal group with statistical difference (P<0.05).The GS IOD value in the treatment group and control group were higher than that of the model group (P<0.05).The GS value in the treatment group was higher than that of the control group (P<0.05).Conclusion:The expression of and GS and GLAST can be promoted by Qishen Yiqi dripping pills,which can low the toxin of high concentration of glutamate,and thus protecting retinal nerve cells.

Diabetes mellitus; Glutamic acid; Qishen Yiqi dripping pill; Glutamine synthetase; Glutamate transporter

湖北省黃石市醫藥衛生科研項目(編號：2010-04)

羅鋼(1975.09—)，男，嘉魚人，碩士研究生，湖北省黃石市中心醫院主治醫師，研究方向：眼科視神經損傷修復、青光眼、眼外傷、白內障等，E-mail：178536802@qq.com

蔡麗英(1977.12—)，女，漢族，大學本科，黃石市中心醫院眼科，研究方向：眼底病、角膜病眼底病、青光眼白內障，E-mail：3326884804@qq.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.054