基于指紋圖譜的生物體系中藥內稟品質等級的數理理論判別

鄒　華　彬

(山東大學化學與化工學院，濟南，250100)

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中藥研究

基于指紋圖譜的生物體系中藥內稟品質等級的數理理論判別

鄒華彬

(山東大學化學與化工學院，濟南，250100)

品質等級理論；生物信息論；十全大補丸；指紋圖譜；模式識別；鑒別

多年來對中醫藥的持續深入思考及系統研究，作者認為中醫藥現代研究可初步歸結為以下幾大核心科學問題：1)中藥內稟品質及品質等級理論判別；2)中藥有效成分的精確判別；3)人體病證分子層次的系統精確診斷；4)人體疾病產生發展的分子層次機制；5)中藥藥性物質及其治療疾病的分子層次的系統機制。中藥品質精確判別又是其他幾個核心問題的基礎。

中藥治療疾病的最直接的物質基礎是其中所含有的各類化學成分。由于受到內在基因變異、環境條件變化及加工、保存技術方法等諸多因素的影響，其品質及療效都會顯著地發生變化。中藥復方由多味中藥材組成，這可能會導致不同廠家的同一配伍組成的中藥復方的品質具有比單味藥材更加顯著的變化范圍。

中藥的同一成分針對不同的疾病一般具有多效性，因此，目前法定采用一種或幾種成分的含量來評價中藥的質量[1]，無法得到準確的質量評價結果。

中藥存在著客觀的品質等級。為了保證中藥的品質及其臨床治療疾病的有效性、藥理研究的可靠性,建立生物體系品質及品質等級的數理理論對中藥品質進行準確定量分析判別，是中醫藥現代研究的核心課題之一，具有極其重要的理論意義及應用價值。

目前中藥品質等級研究可分為2個方面，1)中藥材品質等級，目前主要是依據品種、產地、尺寸、多種宏觀性狀及單位質量藥材所包含的個數來確定其品質等級[2-4]，這些外觀性狀不能準確反映中藥的內在品質。生物效價法亦用于研究不同產地的中藥材的品質[5-6]。2)中藥復方品質等級研究，利用液相色譜指紋圖譜及人為主觀確定的參數值標準對不同廠家的復方進行品質等級研究，難以保證準確反映其品質的實際差異[7]。無論是中藥材還是中藥復方，目前尚缺乏品質等級數理基礎理論的研究。

中藥品質評價研究的發展趨勢是發展符合中藥內稟生物學特性規律的數理方法，基于中藥自身可以反映內在品質的全成分含量及結構信息，獲取能夠無偏代表其品質特征的量化指標，擺脫主觀經驗，實現對中藥品質的無偏評價。關于十全大補丸的鑒別及質量評價研究主要采用HPLC[7-11]、TLC[12]法或毛細管電泳法[13]測定其中的一種或幾種成分含量。

生物代謝物及次生代謝物指紋圖譜反映了其品質信息，指紋峰的穩定性與其品質的穩定性直接相關。對中藥指紋圖譜的系統深入研究表明，紅外、色譜、磁共振成像及紫外指紋圖譜中的峰位信息較峰高度或峰面積信息，更能準確反映中藥的品種品質信息，可以基于此類信息構建生物體系內稟品質等級理論。

本研究提出并建立生物體系內稟品質等級理論。包括2個步驟，首先根據作者建立的相同品質中藥的系統理論判別方法[14]，在品種品質層次上實現對不同中藥品種的精確鑒別分類，再依據分子層次性狀穩定性與品質穩定性直接相關的生物基本性質，建立了以分子層次性狀頻率為自變量的生物體系品質描述函數及不同品質等級的數理標準。

補中益氣丸和十全大補丸皆由10種中藥組方，且2者有5種主要的藥材相同，這使其鑒別及質量控制較困難。本研究測試了不同中藥廠家生產的22個十全大補丸及9個補中益氣丸樣品的氯仿提取物的紅外指紋圖譜,對兩類組成非常相似的中藥復方品種進行了精確鑒別，正確識別率為100%，然后基于中藥品質等級數理理論分析了樣品的指紋圖譜數據并進行了品質等級理論判別。結果表明，不同廠家的22個樣品在理論上皆為優級品(脂溶性提取物)，但他們存在小的差異。

1　中藥品質等級數理理論的建立

根據指紋圖譜峰頻率建立中藥品質等級數理理論及標準。

1.1基于中藥內在品質對中藥進行精確鑒別分類根據作者博士期間獨立提出及建立的中藥質量控制多維指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法(簡稱雙指標序列分析)[15-16]，及后來建立的雙指標信息理論方程[17]。

I=PglnPg+PalnPva+PblnPvb

建立了相同品質中藥的系統理論判別方法[14]，在中藥的品種品質層次進行精確鑒別分類。

1.2建立中藥品質描述函數在基于生物體系內稟品質規律對中藥品種進行精確鑒別的基礎上，根據同品種樣品的指紋圖譜構建中藥品質描述函數，表示如下：q=q(f1,f2，f3,…，fi)，(1)，其中q是品質函數；f1，f2，f3,…，fi：同品種的不同中藥樣品中，每個指紋峰出現的頻率。fi的值越高，說明該指紋峰出現的機會越多，該指紋峰對應的分子或分子結構越能反映樣品的品質特性。反之，fi的值越低，說明該指紋峰出現的機會越少，越不能反映中藥的品質特性。頻率較高部分的指紋峰群可以反映并代表中藥的品質特性。

以此建立的理論分析方法，對品質描述函數q=q(f1,f2，f3,…，fi)進行分析。對于使中藥品質描述函數q(f1,f2，f3,…，fi)發生顯著變化的fk，說明在該頻率前后，中藥品質發生顯著地變化且品質不同。根據不同的中藥品質突變頻率，建立不同中藥品質等級的頻率邊界值及頻率范圍，如下所示：Fj，j=1，2，…，F1>F2>F3，…(3)j代表中藥品質等級，F1，F2，…，分別對應于第一、第二、…，品質等級的頻率邊界值。作者的理論分析表明(另有專文待發表該理論)，不同品質等級的指紋峰頻率參數。見表1。

表1　生物體系不同品質等級的頻率分布

1.4建立中藥品質等級的理論判別標準根據(1.3)中建立的不同品質等級的頻率邊界值：Fj，j=1，2，…，在相同品種中藥的指紋圖譜中，確定fj≥F1的指紋峰組，作為該中藥的優級品質特征峰群，fj≥F2的指紋峰組，作為該中藥的良級品質特征峰群，j越大，說明品質越低。

另外,由于生物生長過程中及加工過程的隨機波動性，同屬于一個等級的不同樣品所具有的該等級品質的指紋峰數也會發生一定的變化，在何種變化范圍內的樣品屬于同一等級。根據反映生物內在本質特性的雙指標信息理論方程[17]，依據其得到的相同品質生物體系的理論標準是它們的指紋圖譜相似度Pg≥61%[14]，該指標可以作為生物體系相同品質等級的理論判別標準。不同品質等級個體樣品的理論判別規則建立如下。

在各品質等級中，判別標準Pg=61%～100%，顯示出同一理論品質等級中的樣品還是存在品質的較寬分布范圍。若將各品質等級的范圍細分為2個區間，Pg=61%～80%，Pg=81%～100%，可以合理精細地表征每個樣品的品質等級，不同品質等級細化標準表示。見表2。

表2　細化品質等級標準

品質等級判別的順序是：依次進行優級、良級、中級、合格級判別。這些品質等級具有排它等級性。

2　材料與方法

2.1儀器美國NICOLET-5700-FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀,光譜范圍：4 000 cm-1～ 400 cm-1，分辨率4 cm-1。高速粉碎機，紫外分光光度計(UV-240,日本島津)，分析天平(精確度0.001 g)。

2.2中藥樣品及試劑三氯甲烷(天津科密歐化學試劑有限公司，A.R.)。十全大補丸樣品：蘭州太寶制藥有限公司S1,S2(生產日期2007.07.24，批號59071123)；北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠S3，S4(2006.12.04，6034209);S5～S9(2008.01.09，8030955)；河南宛西制藥股份有限公司S10～S12(2003.09.22，030901)；S13,S14(2006.04.29，060402);S15,S16(2007.07.14，070701);S17,S18(2007.07.31，070702);S19,S20(2007.08.23，070801);S21，S22(2008.03.15，080301)。補中益氣丸樣品：湖北瑞藥藥業有限公司S23，S24(2006.10.07，061001)，馬鞍山神鹿科瑞有限公司S25(2007.05.28，20070545),S26(2008.01.05，20080108);蘭州太寶制藥有限公司S27(2007.05.28，83071462)，S28(2007.06.14，83071463);湖北清達藥業科技有限公司S29(2005.03.19，050302)，S30(2006.03.16，060301);北京同仁堂科技發展股份有限公司S31(2007.04.10，7080264)。

2.3最佳提取條件采用索氏提取器加60 mL氯仿回流提取十全大補丸0.5 g粉末中脂溶性成分，最佳提取時間為1.5 h。

2.4測試樣品的制備及測試條件每個樣品平行稱取3份粉末，2.00 g/份，得3份提取物，每份提取物平行測量3次，共得9個指紋圖譜，取其中每組共有峰的平均波數構成各個樣品的組合指紋圖譜，作為十全大補丸品質等級分析的基礎數據。方法同文獻[21]。

2.5重復性及穩定性試驗十全大補丸樣品氯仿提的紅外指紋圖譜具有良好的重復性及穩定性。

3　紅外指紋圖譜及十全大補丸品質等級分析

3.1十全大補丸及補中益氣丸氯仿提取物紅外指紋圖譜十全大補丸及補中益氣丸氯仿提取物紅外指紋圖譜見圖1。

圖1　十全大補丸及補中益氣丸氯仿提取物紅外指紋圖譜疊加圖

注：3 400 cm-1處，由下到上依次為十全大補丸S1，S3，S5，S10,S15,S21，補中益氣丸S31，S29，S27,S25,S23。

由圖1可知，十全大補丸與補中益氣丸氯仿提取物的紅外指紋圖譜具有高度的相似性及復雜性，難以直觀區分它們，需要采用數理理論來加以精細分析。根據共有峰及變異峰的理論判別法-Shaprio-Wilk W檢驗判別法，來確定不同樣品紅外指紋圖譜中的共有峰及變異峰。

3.2十全大補丸與補中益氣丸品種精確鑒別分類根據相同品質中藥的系統理論判別方法[14]，基于內在品質規律而不是外觀性狀對十全大補丸及補中益氣丸進行了精確分類，在Pg≥58%(根據相同品質中藥的系統理論判別方法，相同品質中藥的相似度范圍x≤Pg≤100，x=58%～64%)，31個樣品的特征序列如下，樣品的正確識別率為100%。

十全大補丸的特征序列

S1:(S1)aS2S21 S22b

S2:S1(S2)S15 S10

S3:(S3)S4 S5 S6 S7S8 S9 S12 S13 S14

S4:S3(S4)S5 S6 S7 S8 S9 S12 S13 S14

S5:S3 S4(S5)S6 S7 S8 S9 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S21 S22

S6:S3 S4 S5(S6)S7 S8 S9S12 S13 S14

S7:S6 S3 S4 S5(S7)S9 S8 S13 S12 S14

S8:S3 S4 S5 S6 S7(S8)S9 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S19 S21 S22

S9:S3 S4 S5 S6 S7 S8(S9)S11 S12 S13 S15 S16

S10：(S10)S12 S14 S15 S16 S19 S20 S21 S22

S11:S5 S8 S9(S11)S12 S13 S14 S15 S19 S21 S22

S12:S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11(S12)S13 S14 S15 S16 S20 S19 S21 S22

S13:S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S11 S12(S13)S14 S15 S16 S20 S21 S22

S14：S3 S4 S5 S6 S7 S8 S10 S11 S12 S13(S14)S15 S16 S20 S21 S22

S15:S5 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14(S15)S16 S19 S20 S21 S22

S16:S5 S8 S9 S10 S12 S13 S14 S15(S16)S20 S21 S22

S17:S8(S17)S18 S19 S21 S22

S18:S17(S18)S19 S21 S22

S19:S8 S10 S11 S12 S15 S17 S18(S19)S20 S21 S22

S20:S10 S12 S13 S14 S15 S16 S19(S20)S21 S22

S21:S5 S8 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20(S21)S22

S22:S5 S8 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21(S22)

補中益氣丸的特征序列

S23:(S23)S24 S31

S24:S23(S24)

S25:(S25)S26 S29

S26:S25(S26)S27 S28

S27:S26(S27)S28

S28:S26 S27(S28)

S29:S25(S29)S30

S30:S29(S30)

S31:S23(S31)

a.S1:(S1)aS2，S1的特征序列，其中S1屬于自身的最相似樣品，構成其特征序列的成分，其他樣品各自構成自身特征序列的成分。b.S21 S22.是緊鄰S1特征序列的非特征序列樣品，它們的Pg<58%，因S21S22與S1S2同屬于十全大補丸，這說明S1S2與S3～S22，確實屬于同類，但特征序列體現出統計學意義。

2個組成非常相似的中藥品種的特征序列之間沒有交疊，十全大補丸S1～S22的特征序列完全由S1～S22構成，而補中益氣丸S23～S31的特征序列完全由S23～S31構成，實現理想的分類模式識別。

3.3十全大補丸品質等級數理理論分析結果根據本文建立的中藥品質等級數理理論分析方法，對3個不同廠家的22個十全大補丸樣品的氯仿提取物的紅外指紋圖譜進行分析。各個共有吸收峰波數對應的峰頻率見表3。

表3　十全大補丸氯仿提取物的紅外指紋圖譜峰對應的頻率

根據表3的數據，可以計算平均頻率=8.92，標準偏差Sf=8.06，由此得不同品質等級樣品的頻率邊界及范圍。及其對應的指紋峰。見表4。

表4　十全大補丸不同品質等級樣品指紋峰頻率區間及其對應的指紋峰群

表5　十全大補丸樣品不同品質等級指紋峰頻率及品質等級

根據雙指標信息理論方程[17]，可以推出，當2個樣品的相似度Pg≥61%,2個樣品具有相同的品質。根據這一理論結果，建立公式(4)～(7)，可以判斷每個樣品的質量等級。十全大補丸樣品優、良、中級及合格等不同品質等級指紋峰頻率f優，f良，f中，f合格及樣品的品質等級，根據表2中確定的品質等級細化判別規則，22個十全大補丸的品質等級判別結果見表5。

表5分析結果顯示，雖然S1,S2與S3～S22有微小的差異，3個廠家生產的22個十全大補丸產品，皆為優級品，說明3個廠家產品具有優良的穩定性，品質一致性。根據表2，則可將S1,S2 2個樣品確定為優級-，而S3～S22確定為優級+，這也與它們的特征序列具有一定的差異相吻合。

4　結論

本研究建立的生物體系內稟品質等級數理理論，實現了中藥生物體系品質等級的嚴謹理論判別，突破了幾千年來中藥品質等級確定只能依賴于經驗知識及主觀規定的局限性。該理論方法的每個環節都基于嚴謹的理論基礎，因而對中藥品質等級的理論判別結果具有科學合理性。建立的基于指紋圖譜峰頻率的品質等級描述方法，具有一定的創新性。該方法理論上適用于所有種類的生物體系，包括中藥材、中藥復方品質等級的理論分析，為解決中藥品質的客觀精確定量評價問題探索了一條新的可行路徑。該理論方法確定的優級品質分子性狀亦可以作為生物體系的特征標記群,用于生物體系的快速準確定性鑒別。

致謝：本研究論文的部分原始數據采自作者2007級碩士研究生董鳳娟的畢業論文。

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(2015-10-12收稿責任編輯：徐穎)

Fingerprint Spectra-based Mathematical Theory in Determining the Intrinsic Quality Grade of Biological System of Chinese Medicine

Zou Huabin

(School of Chemistry and Chemical Engineering of Shandong University, Jinan 250100, China)

Quality grade theory; Biological information theory; Shiquan Dabu pills; Fingerprint spectra; Pattern Recognition; Identification

山東省中醫藥科技發展計劃項目(編號：2013-157)

鄒華彬，博士，副教授，碩士研究生導師，研究方向：中藥鑒別及質量評價理論方法學研究，E-mail：huabinzou@126.com

R286.0

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.060